全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (1): 85–91　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0651 85
收稿 2015-12-03　　修定 2015-12-21
资助 教育部科学技术研究重大项目(313032)、国家自然科学基
金(31370285)和国家转基因生物新品种培育科技重大专项
(2014ZX08009-030B-002)。
* 通讯作者(E-mail: wangnn@nankai.edu.cn)。
大豆氨基酸透性酶基因GmAAP2-like 1的克隆及功能初探
李美美, 夏铜梅, 王丹, 梅圆圆, 王宁宁*
南开大学生命科学学院, 天津300071
摘要: 氨基酸透性酶(amino acid permeases)在植物不同器官的氨基酸转运过程中发挥着重要作用, 但迄今为止, 大豆中氨基
酸透性酶相关的研究甚少。本文利用大豆初生叶水培系统对大豆(Glycine max)品种‘Williams 82’进行缺氮处理后, 发现与
足氮对照相比, 大豆初生叶中GmAAP2-like 1基因的表达明显上调。对大豆不同器官中GmAAP2-like 1的转录水平进行RT-
PCR检测, 结果显示该基因在花、叶和茎中的表达量较高而在根和种子中表达量很低。构建GmAAP2-like 1 (无内含子)过
表达植物表达载体, 在转化农杆菌时发现, 该载体转化农杆菌GV3101致死; 改进载体构建策略, 采用融合PCR方法, 在
GmAAP2-like 1的第一个外显子后插入一段内含子序列, 改进的载体可以成功转化农杆菌。应用农杆菌介导的花苞浸泡法
转化拟南芥, 对所获得的转基因拟南芥抗性苗进行基因组PCR和RT-PCR鉴定, 共检测到8个GmAAP2-like 1不同程度表达的
转基因拟南芥株系, 且其中的内含子都得到了正确的剪切。氨基酸有毒类似物(MSX)处理实验表明: 转基因拟南芥对MSX
处理比野生型更为敏感, 暗示GmAAP2-like 1具有运输谷氨酸等酸性氨基酸的功能。
关键词: 大豆; 氨基酸透性酶; 缺氮; 融合PCR; 氨基酸运输
大豆是一种在世界各地广泛种植的经济作物,
由于种子中含有丰富的蛋白质和植物油, 因此成
为人类食物、动物饲料以及工业副产品的重要来
源之一(Gresshoff 2013)。
氮素在植物中占有重要的地位 , 它是氨基
酸、酰胺、蛋白质、核酸、辅酶、叶绿素和某些
植物激素等的组成元素(潘瑞炽2008), 在植物光合
作用和种子成熟等过程中发挥着重要作用。在大
豆中氮素影响着其生长发育过程、根瘤固氮等代
谢过程以及品质、产量的形成等多个过程(夏玄
2014)。同时, 在绝大多数植物中, 氨基酸是氮素同
化物长距离运输的主要形式(Zhang等2015)。
无论是植物根部直接从土壤中吸收氨基酸、
根部吸收和合成的氨基酸向“库”器官的长距离运
输、氮素再动员过程中“源”器官中氨基酸的韧皮
部装载还是叶肉细胞和种子中氨基酸的输入等过
程, 都离不开氨基酸转运蛋白(Tegeder 2012)。氨
基酸透性酶(amino acid permeases, AAPs)是研究的
相对比较清楚的一类氨基酸转运蛋白。在模式植
物拟南芥中的研究表明, 氨基酸透性酶在氨基酸
由“源”向“库”的转运和种子的发育过程中发挥着
重要的作用。例如, AtAAP1定位于根表皮、根毛
以及整个植物根尖和胚, 能够将氨基酸运输到根
和发育中的胚(Lee等2007; Sanders等2009); AtA-
AP2定位于植物整个韧皮部中, 在将木质部中的氨
基酸运输到韧皮部过程中发挥作用, 同时可以将
“源”叶中的氨基酸装载到韧皮部中并且将氨基酸
分配到种子“库”中(Zhang等2010); AtAAP3主要在
根部表达, 定位在根韧度部的质膜和核膜, 可能负
责根部氨基酸的吸收和分配(Fisher等1995; Oku-
moto等2004); AtAAP5主要在根皮层中表达, 参与
碱性氨基酸L-Arg和L-Lys等的吸收(Hirner等2006;
Svennerstam等2008); AtAAP6主要在“库”器官中表
达, 比如根、“库”叶, 主要作用是将氨基酸从木质部
转运到韧皮部(Okumot等2002; Hunt等2010); AtA-
AP8主要在发育中的种子和成熟种荚中表达(Oku-
moto等2002), 在种子早期胚胎发育中可以将氨基酸
运输到胚乳中供给发育中的胚(Schmidt等2007)。
然而, 到目前为止, 国内外对大豆中氨基酸透
性酶的研究非常少见。本文完成了大豆氨基酸透
性酶基因GmAAP2-like 1的克隆并获得了转基因拟
南芥, 通过对转基因植物进行有毒氨基酸类似物
处理实验推测GmAAP2-like 1具有谷氨酸等酸性
氨基酸运输的功能。
材料与方法
1 实验材料与处理
1.1 实验材料与培养条件
实验用大豆[Glycine max (L.) Merr.]品种为
植物生理学报86
‘Williams 82’, 水培时用1/2Hoagland营养液进行培养。
实验用拟南芥为哥伦比亚生态型(Arabidopsis
thaliana L., Col-0)。进行分子鉴定所用植物材料
在培养初期(萌发后7~9 d)于固体1/2MS (蔗糖含量
为1%)上培养; 有毒氨基酸类似物处理时用液体
1/2MS进行培养。
1.2 大豆缺氮处理方法
在正常水培条件下, 将野生型大豆培养至初
生叶刚刚展开, 将实验组转移到缺氮营养液(除去
1/2Hoagland营养液中的氮素)培养1~2 d, 对照组继
续在1/2Hoagland营养液(足氮营养液)中培养。
1.3 有毒氨基酸类似物处理方法
有毒氨基酸类似物处理实验参照Perchlik等
(2013)进行。首先将颗粒饱满, 大小一致的WT和
转基因拟南芥种子在4°C黑暗条件下春化48 h; 对
照组采用1/2MS液体培养基, 实验组于1/2MS液体
培养基中添加10 µmol·L-1谷氨酸有毒类似物L-Met
sulfoximine (MSX, 购自上海维源化学科技有限公
司), 对照组和每个实验组分别取20粒拟南芥种子
进行实验; 将拟南芥种子分别于上述培养基中振
荡培养, 转速为80 r·min-1, 处理8 d。
2 总RNA的提取和cDNA合成
取大豆不同器官或拟南芥9 d幼苗的全苗约
100 mg, 用TRIzol法提取总RNA, 并用1 µg RNA反
转录合成cDNA第一链, 具体步骤参照Liu等(2010)
文献。
3 GmAAP2-like 1基因Real-time PCR和半定量
RT-PCR
采用Real-t ime PCR对缺氮处理后大豆中
GmAAP2-like 1的表达量进行测定, 以大豆cDNA为
模板, 引物为RT-F: 5’-AGGACCCCAAGGTG-
GAGTGGT-3’, RT-R: 5’-TGAGCCA-ACAGCAGC-
CGCAA-3’; 以大豆ELF为内标, 引物为ELF-F:
5’-GTTGAAAAGCCAGGGG-ACA-3’, ELF-R:
5’-TCTTACCCCTTGAGCGTGG-3’。用半定量RT-
PCR检测GmAAP2-like 1在大豆各个器官的表达特
异性时, 引物为sRT-F: 5’-GGCATTGCCAAAGTT-
GCAGA-3’, sRT-R: 5’-CAAAGAGGGGCTGGG-
CATAA-3’; 以大豆18S rRNA为内标, 引物为rR-
NA-F: 5’-CCTTGCTTGTTGCTTTACTAAATAG-3’,
rRNA-R: 5’-ATGCACCTTTTCGTTTGTTTCG-
GAG-3’, PCR反应程序为: 94°C 5 min; 94°C 30 s,
58°C 30 s, 72°C 45 s, 28个循环; 72°C 10 min。
4 GmAAP2-like 1基因的克隆、转基因拟南芥的
获得和分子鉴定
4.1 GmAAP2-like 1基因的克隆
GmAAP2-like 1 (无内含子)基因的扩增: 以野
生型大豆的cDNA为模板, 正向引物为 F1: 5’-GG-
GCCCAGAATTCATGGAGCCTTACTCCATTGAT-
GGTG-3’, 反向引物为R2: 5’-ACTAGTACCTC-
G A G ATA G T C TA C AT G A A A C G G T T T G -
TATTTCTG-3’。PCR反应程序为: 94°C 5 min;
94°C 30 s, 58°C 30 s, 72°C 2 min, 26个循环; 72°C
10 min。
GmAAP2-like 1 (含内含子)基因的扩增: 分别
克隆上下游片段再融合而成。上游片段以野生型
大豆基因组为模板, 正向引物为F1 (与前文F1序列
相同), 反向引物为R1: 5’-CTCTTCCCGGTAA-
CAGGGTCACC-3’; 下游片段以野生型大豆cDNA
为模板, 正向引物为F2: 5’-GGTGACCCTGTTAC-
CGGGAAGAG-3’, 反向引物为R2 (与前文R2序列
相同), 上下游片段扩增的PCR反应程序均为: 94°C
5 min; 94°C 30 s, 58°C 30 s, 72°C 1 min, 12个循环;
72°C 10 min。将上下游片段的PCR产物回收后, 进
行融合PCR, 该 PCR体系中上下游片段产物摩尔
数比为1:1, PCR反应程序为: 94°C 5 min; 94°C 30 s,
58°C 30 s, 72°C 2 min, 12个循环; 72°C 10 min。
将扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后通过TA
克隆连接到T载体上, 阳性克隆由华大基因公司测
序。将测序正确的含有目的片段的质粒和pCAM-
BIA 1301空载体同时用 KpnI和ApaI双酶切, 之后
用胶回收试剂盒回收目的片段, 再用连接酶将目
的片段连接到经相同酶切后的pCAMBIA 1301载
体上, 获得的35S:GmAAP2-like 1阳性克隆由华大
基因公司测序。测序结果正确后转化农杆菌
GV3101。
4.2 35S:GmAAP2-like 1转基因拟南芥的获得和分
子鉴定
用农杆菌介导的花苞浸泡法(Clough和Bent
1998)来转化拟南芥。将获得种子在含有30 mg·L-1
潮霉素的1/2MS培养基上筛选, 将抗性苗移到土中
培养并进行分子鉴定。取3周大时拟南芥第3或第
李美美等: 大豆氨基酸透性酶基因GmAAP2-like 1的克隆及功能初探 87
4片叶子, 参考《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克
和拉塞尔2002)提取基因组DNA, 进行PCR鉴定。
PCR体系中, 引物为F1和R2 (F1、R2序列均与前文
相同), 取1 µL基因组DNA为模板, PCR反应程序为:
94°C 5 min; 94°C 30 s, 58°C 30 s, 72°C 2 min, 32个
循环; 72°C 10 min。获得纯合子后, 用9 d大的幼苗
全苗提取RNA进行半定量RT-PCR检测, 引物为
sRT-F和sRT-R (二者序列均与前文序列相同); 内标
引物为Tip41-F: 5’-GAATTCAGGAGCA-AGC-
CGTCTCAG-3’, Tip41-R: 5’-ATCAACTCTCAGC-
CAAAATCGCAAG-3’。PCR反应程序为: 94°C 5
min; 94°C 30 s, 58°C 30 s, 72°C 45 s, 30个循环;
72°C 10 min。
实验结果
1 缺氮处理后初生叶中GmAAP2-like 1表达上调
分别取缺氮处理1和2 d的大豆初生叶, 提取总
RNA, 通过Real-time PCR检测GmAAP2-like 1基因
的表达。结果如图1所示, 缺氮处理后GmAAP2-
like 1的表达明显上调; 随着缺氮处理时间由1 d延
长到2 d, 其表达水平上升; 而足氮对照中该基因的
表达水平较低, 且不受时间延长的影响。
2 GmAAP2-like 1在大豆各器官中的表达特异性
分析
为了研究GmAAP2-like 1在大豆各个器官的表达
特异性, 分别取正常培养大豆R2期的根、茎、叶,
盛花期的花, 鼓粒期的种荚和种子作为材料, 进行半
定量RT-PCR检测。结果如图2所示, GmAAP2-like 1
在大豆的各个器官中均有表达, 其中在花、叶和茎
中表达水平较高, 而在根和种子中表达水平很低。
3 含35S:GmAAP2-like 1 (无内含子)融合基因的载
体转化农杆菌致死
将携带35S:GmAAP2-like 1 (无内含子)的表达
载体与空载体对照分别转化大肠杆菌DH5α, 二者
均在含有卡那霉素的LB培养基上得到许多菌落,
并鉴定出成功转入35S:GmAAP2-like 1 (无内含子)
构建的阳性克隆(图3-A)。将构建好的35S:G-
mAAP2-like 1 (无内含子)质粒与空载体分别转化农
杆菌菌株GV3101, 空载体转化成功, 35S:GmAAP2-
like 1 (无内含子)质粒转化农杆菌后无菌斑长出(图
3-B)。我们推测35S:GmAAP2-like 1 (无内含子)质
粒转化GV3101致死。
图1 GmAAP2-like 1对缺氮的响应
Fig.1 GmAAP2-like 1 transcription in response to
nitrogen-deficiency
图2 GmAAP2-like 1在大豆各器官的特异性表达
Fig.2 Tissue specific expression of GmAAP2-like 1 in soybean
图3 含35S:GmAAP2-like 1 (无内含子)融合基因的载体转化DH5α (A)和GV3101 (B)
Fig.3 DH5α (A) and GV3101 (B) were transformed with vector harboring 35S:GmAAP2-like 1 fusion gene
植物生理学报88
4 融合基因的获得及农杆菌转化
重新调整构建策略, 在GmAAP2-like 1的第
一、二个外显子中间插入一段内含子序列, 即分
别克隆该基因的上下游片段再进行融合。上游片
段以大豆基因组为模板, F1、R1为引物, 下游片段
以大豆cDNA为模板, F2、R2为引物, 如图4-A所
示。图4-B为融合基因PCR扩增的电泳图, 其中泳
道1为上游片段, 大小为292 bp, 泳道2为下游片段,
大小为1 424 bp, 泳道3为融合后的片段, 大小为
1 716 bp。将构建好的新的35S:GmAAP2-like 1 (含
内含子)质粒与空载体对照分别转化农杆菌GV3101,
如图4-C, 在含有卡那霉素、庆大霉素、利福平的
YEP培养基上均长出大量菌斑, 并且可以获得成功
转入上述质粒的转化子。
图4 融合PCR及农杆菌转化结果
Fig.4 Fusion PCR and Agrobacterium transformation results
A: 融合PCR示意图; B: 融合基因PCR产物电泳结果, 其中M为DNA分子量标准, 泳道1为上游片段, 泳道2为下游片段, 泳道3为融合后
片段; C: 转化GV3101结果。
李美美等: 大豆氨基酸透性酶基因GmAAP2-like 1的克隆及功能初探 89
5 转基因拟南芥的分子鉴定
对获得的35S:GmAAP2-like 1 (含内含子)拟南
芥抗性苗进行基因组水平和转录水平的检测, 结
果显示11株抗性苗基因组中均插入了35S:GmAAP2-
like 1 (含内含子)片段, 为阳性苗(图5-A)。图5-B为
转录水平的检测结果, 由于在构建中插入了一个
内含子, 为了检测转基因植物中的内含子序列是
否在转录后加工过程中被正确剪切, 同时设置了
分别以35S:GmAAP2-like 1 (无内含子)和35S:G-
mAAP2-like 1 (含内含子)质粒为模板的PCR作为对
照, 结果如图5-B所示, 9个被检测株系中有8个株系
可以明显检测到GmAAP2-like 1基因的表达, 且
35S:GmAAP2-like 1 (含内含子)构建中的内含子序
列都得到了正确的剪切。
6 GmAAP2-like 1具有酸性氨基酸运输功能
谷氨酸属于酸性氨基酸, 经谷氨酸的有毒类
似物MSX处理8 d后, CK组的WT与35S:GmAAP2-
like 1 (含内含子)转基因拟南芥长势良好且一致。
MSX处理组的WT与35S:GmAAP2-like 1 (含内含
子)转基因拟南芥生长均受到明显抑制, 转基因拟
南芥的长势较WT更弱, 完整的叶片数也明显少于
WT, 叶片坏死现象较WT更为严重(图6), 表明
GmAAP2-like 1可能具有运输谷氨酸等酸性氨基
酸的功能。
讨　　论
根据序列同源性分析, 我们在大豆中发现了
一个与拟南芥中氨基酸透性酶基因AtAAP2同源性
很高的基因GmAAP2-like 1。GmAAP2-like 1在大
豆缺氮处理后表达明显上调, 我们推测该基因可
能在大豆缺氮或低氮条件下的氨基酸运输过程中
发挥作用。我们在实验中发现, GmAAP2-like 1在
大豆各个器官中都有表达, 但其表达丰度具有器
官特异性, 即在花、叶和茎中表达较高而在根和
种子中表达很低, 说明其可能主要在花、叶和茎
等器官的氨基酸转运中发挥作用。对AtAAP2的研
究发现, 该基因在拟南芥各个器官的维管组织中
均有表达(Zhang等2010), 而GmAAP2-like 1在植物
各器官中的具体表达部位还有待进一步研究。另
外, 本实验中GmAAP2-like 1的氨基酸吸收功能是
通过有毒氨基酸类似物的处理实验来验证的。经
谷氨酸毒性类似物M S X处理 8 d后 3 5 S : G -
mAAP2-like 1转基因拟南芥比WT受到更为严重的
生长抑制, 表明35S:GmAAP2-like 1转基因植物对
MSX更为敏感, 推测GmAAP2-like 1具有运输谷氨
酸的功能。Fisher等(2002)通过爪蟾卵母细胞的电
生理学运输实验证明, AtAAP2主要运输谷氨酸和
中性氨基酸, 而GmAAP2-like 1是否也可以运输中
性氨基酸还有待进一步研究。
图5 转基因拟南芥的分子鉴定
Fig.5 Molecular identification of transgenic Arabidopsis
A: 基因组PCR结果; B: 转基因株系的RT-PCR鉴定。M为DNA分子量标准, 数字代表35S:GmAAP2-like 1 (含内含子)转基因植物的不
同株系; +为正对照, 35S:GmAAP2-like 1 (含内含子)质粒作为模板; +(含)为含内含子的正对照, 35S:GmAAP2-like 1 (含内含子)质粒作为模板;
+(无)为无内含子的正对照, 35S:GmAAP2-like 1 (无内含子)质粒为模板; －为负对照, ddH2O作为模板。
图6 MSX处理导致35S:GmAAP2-like 1转基因拟南芥受到
更为严重的生长抑制
Fig.6 MSX treatment resulted in more severe growth
inhibition in transgenic Arabidopsis
1~6为6个MSX处理组。
植物生理学报90
我们在实验过程中发现, 携带35S:GmAAP2-
like 1 (无内含子)构建的质粒转化农杆菌GV3101
不能获得转化子。有报道指出, 35S启动子可以驱
动GUS基因在农杆菌中进行表达(刘斌2003)。我
们推测35S:GmAAP2-like 1转化农杆菌致死可能是
由于可以使GmAAP2-like 1蛋白在农杆菌中表达,
从而对农杆菌产生毒性造成的。关于致死原因我
们做出以下3种推测: 第一, 可能是由于GmAAP2-
like 1蛋白从培养基中转运了较多的氨基酸到农杆
菌体内, 而高浓度的氨基酸对细胞有毒害作用(Ji
等2015), 进而导致农杆菌死亡; 第二, 由于绝大多
数氨基酸运输蛋白转运氨基酸的过程都是质子与氨
基酸共转运的(Ortiz-Lopez等2000), 可能GmAAP2-
like 1运输氨基酸的同时伴随着H+的跨膜转运, 从
而使农杆菌细胞内的pH值发生改变, 改变了细菌
生长所需的酶的活性, 导致农杆菌死亡; 第三, 绝
大部分氨基酸透性酶主要定位在质膜上(Tegeder
和Rentsch 2010), GmAAP2-like 1可能对农杆菌细
胞膜结构产生了影响, 导致细菌细胞膜穿孔(黄琴
等2007), 从而引起农杆菌渗漏死亡。为了解决这
个问题, 本研究中采用融合PCR方法, 在GmAAP2-
like 1基因中插入一段内含子序列后可以成功将构
建转化农杆菌。由于在农杆菌中不存在转录后加
工过程, 无法剪切内含子, 因此不会表达GmAAP2-
like 1蛋白, 不会出现上述3种情况, 因此不会对农
杆菌产生毒害作用, 所以35S:GmAAP2- like 1 (含内
含子)可以成功转化农杆菌。该构建策略为我们在
相关实验中解决类似的问题提供了一个新的思路。
本文首次从大豆中克隆了氨基酸透性酶基因
GmAAP2-like 1, 并通过对转基因拟南芥进行初步
的氨基酸吸收功能验证推测GmAAP2-like 1具有
酸性氨基酸运输功能, 为深入解析大豆氮素“源”-
“库”输送机制奠定了基础。
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Cloning and preliminary functional analysis of an amino acid permease gene
GmAAP2-like 1 in soybean
LI Mei-Mei, XIA Tong-Mei, WANG Dan, MEI Yuan-Yuan, WANG Ning-Ning*
College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract: Amino acid permeases play important roles in transferring amino acids between different parts of the
plants; however, so far their functions have rarely been studied in soybean. In this research, an amino acid per-
mease gene, GmAAP2-like 1, was seen to be up-regulated in primary leaves of hydroponically grown soybean
(Glycine max) cultivar ‘Williams 82’ under nitrogen-deficiency treatment compared with nitrogen-sufficient
control. The RT-PCR analysis further showed that GmAAP2-like 1 was much more abundantly in flowers,
leaves and stems of soybean while it showed very low expression in roots and seeds. During the cloning pro-
cess, it was found that the vector carrying 35S:GmAAP2-like 1 could be transformed into Escherichia coli strain
DH5α successfully but was lethal to Agrobacterium tumerfaciens strain GV3101. As an alternative strategy, this
gene was then cloned by fusion PCR with an intron inserted after the first extron and the following transforma-
tions turned out to be successful in both E. coli and Agrobacterium strains mentioned above. Subsequently, the
obtained Arabidopsis thaliana transgenic lines of 35S:GmAAP2-like 1 with intron were verified by genomic
PCR and semi-quantitative RT-PCR analysis, and the results showed that the intron was cut off correctly and
the gene of interest was overexpressed in almost all the lines examined. Furthermore, it was shown that even
though the growth of wild-type and transgenic seedlings were both inhibited after toxic glutamate analogues
treatment in comparison to that of the mock control, the growth inhibition of transgenic lines was much more
significant, implying that GmAAP2-like 1 could possibly transport such acidic amino acid.
Key words: soybean; amino acid permease; nitrogen-deficiency; fusion PCR; amino acid transport
Received 2015-12-03 Accepted 2015-12-21
This work was supported by the Key Grant Project of the Chinese Ministry of Education (Grant No. 313032), the National Natural Science Foun-
dation of China (Grant No. 31370285), and the Major Technological Program on Cultivation of New Varieties of Genetically Modified Organisms
(Grant No. 2014ZX08009-030B-002).
*Corresponding author (E-mail: wangnn@nankai.edu.cn).