全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 8期, 2010年 8月824
收稿 2010-05-14 修定 　2010-06-05
资助 国家重点基础研究发展计划项目(2009CB125906)和黑
龙江省重大科技攻关项目(GA0 9B201-4)。
* 通讯作者(E-mail: tbjiang@yahoo.com; Tel: 0451-82190607)。
烟草内源铁蛋白NtFer1和NtFer2的相互作用
周博如, 吴丽丽, 丁宝健, 姜廷波 *
东北林业大学, 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 以 2个烟草铁蛋白基因全长序列(NtFer1和NtFer2, GenBank登录号: AY083924和AY141105)为基础, 利用细菌双杂
交系统分析不同烟草铁蛋白亚基之间及相同铁蛋白亚基之间的互作关系, 并利用Northern杂交分析2个铁蛋白基因的特异
表达。结果表明, 铁蛋白基因NtFer1和NtFer2在叶片中均有表达, 同时 2种亚基之间存在很强的互作关系, 说明在叶片中
组成铁蛋白的24个亚基可能有3种类型, 或来自单一的NtFer1亚基, 或来自单一的NtFer2亚基, 也可能来源于不同的铁蛋
白亚基。在烟草根部组织中只有铁蛋白NtFer1基因大量表达, 而NtFer2基因的表达非常微弱, 所以根部的铁蛋白大分子
可能由单一的铁蛋白 NtFer1亚基聚合而成的。
关键词: 烟草; 铁蛋白; 蛋白质互作; 基因表达
Protein Interaction Analysis among Tobacco Ferritin NtFer1 and NtFer2
ZHOU Bo-Ru, WU Li-Li, DING Bao-Jian, JIANG Ting-Bo*
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China
Abstract: Based on the full length sequence of two tobacco ferritin genes (NtFer1 and NtFer2), the differential
expression of ferritin genes was detected by Northern blotting, and the protein interaction among the ferritin
subunits were analyzed by BacterioMatch two-hybrid assay system. Results indicated that the NtFer1 and
NtFer2 gene could be higher expressed in leave, and a strong interaction between NtFer1 and NtFer2 subunits
were detected, and suggested that composed of 24 subunits of ferritin may contain three assemble types: sole
kind NtFer1 subunit, or sole kind NtFer2 subunit, or multi kind subunits. In the root, only NtFer1 gene was
expressed, which suggested that composed of 24 subunits of ferritin in root was sole kind of NtFer1 subunit.
Key words: tobacco; ferritin; protein interaction; gene expression
铁蛋白(ferritin)是一种可以储存铁离子的蛋白
质, 每个铁蛋白分子能以可溶、无毒和生物体可利
用的形式储存高达 4 500个铁原子(Harrison和
Arosio 1996)。植物可以通过铁蛋白氧化还原过程
有规律的吸收和释放铁离子, 铁蛋白对协调铁离子
的新陈代谢, 避免铁离子不溶性和毒性具有重要作
用(Theil 1987)。植物铁蛋白与动物铁蛋白不同, 植
物铁蛋白亚基的氨基酸序列较长, 在N端编码有信
号肽, 而动物铁蛋白不含信号肽序列。植物铁蛋白
亚基前体N端信号肽大约由70个氨基酸残基组成,
包括一个质体定位(targetting plastid, TP)序列(大约
40个残基)和延伸肽(extention peptide, EP)。TP用
于铁蛋白在质体中的定位, 在蛋白质进入质体后被
剪切掉。EP存在于成熟铁蛋白的N端, 可能是体
外蛋白质稳定性调控的一个重要决定因素。自
1990年从大豆胚轴中克隆出第一个植物铁蛋白基
因以来(Ragland等1990), 已经对许多植物的铁蛋白
基因进行了克隆和测序, 如菜豆(Spence等 1991)、
大豆(Lescure等 1991)、豌豆(Lobréaux等 1992)、
蚕豆(Wicks和 Entsch 1993)、豇豆(Wardrop等
1999)、玉米(Petit等 2001)和烟草(Jiang 2005)等植
物铁蛋白基因均已见报道。研究认为植物铁蛋白
基因是由少数基因编码的基因家族(玉米, Fobis-
Loisy等 1995; 拟南芥, Petit等 2001), 说明在植物
细胞中可能同时存在不同的铁蛋白亚基。
前期研究表明至少有 2个不同的的铁蛋白基
因 NtFer1和 NtFer2存在于烟草基因组内(Jiang
2005), 并获得了2个铁蛋白基因cDNA的全长序列,
为研究烟草铁蛋白亚基在形成多聚体过程中的作用
植物生理学通讯 第 46卷 第 8期, 2010年 8月 825
机制奠定了基础。本研究为探索内源烟草铁蛋白
的互作关系, 利用细菌双杂交方法对两种烟草铁蛋
白亚基的相互作用及单一亚基间的作用进行分析,
为明确铁蛋白亚基的聚合机制提供理论依据。
材料与方法
1 细菌双杂交分析
1.1 pBT和 pTRG载体构建 本研究采用Bacterio-
Match® II双杂交系统载体试剂盒(Two-Hybrid Sys-
tem Vector Kit, Stratagene)进行载体构建。为了将
NtFer1和NtFer2克隆到pBT和pTRG中, 根据Jiang
(2005)报道的2个烟草铁蛋白基因序列(GenBank登
录号: AY083924和AY141105), 在编码成熟肽链区
域设计引物(表 1), 并在引物的 5端导入内切酶的
酶切位点, 用于以后的定向克隆。设计引物时充分
注意插入的铁蛋白基因片段与载体上的λcI蛋白和
RNAPα蛋白的读码框相匹配, 以保证表达出正确的
蛋白质。用 PCR法从克隆载体上扩增铁蛋白基因
cDNA目的片段。PCR产物经胶回收纯化后, 取出
2 μg分别用相应的限制性内切酶双消化, 同时载体
pBT和 pTRG也取出 2 μg用相应的内切酶进行酶
切。酶切产物经胶回收纯化后进行连接反应, 采用
插入片段和载体的摩尔比为 2:1设置连接体系, 用
Ligation High® (TOYOBO)连接酶在16 ℃连接过夜。
用电穿孔法将连接产物转化到大肠杆菌菌株XL1-
Blue MRF Kan中, 经抗生素筛选、PCR检测重组
体, 最后通过测序确认序列的正确性, PCR引物和
测序引物根据载体上的序列设计, 跨越 λcI蛋白
(pBT重组质粒)和RNAPα蛋白(pTRG重组质粒)与
插入片段的两侧。将测序确认正确的克隆摇菌, 用
质粒纯化试剂盒(Wizard® Plus SV Minipreps DNA
Purification Systems, Promega)提取重组的 pBT和
表 1 实验中使用的引物名称和序列
Table 1 The name and sequence of primers used in this study
引物名称 DNA序列(5→ 3) 酶切位点及用途 退火温度 /℃
NF2-F1 GCGAATTCAAAGGGTTCGAACACC 含 EcoRI, 构建 pBT重组质粒 61.97
NF2-F2 GCGAATTCCTTCAAAGGGTTCGAACACC 含 EcoRI, 构建 pTRG重组质粒 64.94
NF2-R GCGCTCGAGTCATGCAACAACTTCCTC 含 XhoI, 构建两种重组质粒 66.56
NF1-F GCGGATCCTCAAAGGCGAGCAACCAC 含 BamHI, 构建 pTRG重组质粒 68.30
NF1-R GCGCTCGAGTCAAGCAGCAGCTCCCTC 含 XhoI, 构建 pTRG重组质粒 71.11
PBT-F TCCGTTGTGGGGAAAGTTATC pBT 正向测序引物 58.01
PBT-R GGGTAGCCAGCAGCATCC pBT 反向测序引物 61.86
PTRG-F TGGCTGAACAACTGGAAGCT pTRG正向测序引物 57.8
PTRG-R ATTCGTCGCCCGCCATAA pTRG反向测序引物 57.3
　　D N A 序列中下划线表示酶切位点。
pTRG 质粒。
1.2 质粒共转化和蛋白互作分析 为了测定NtFer1
和NtFer2之间的相互作用, 将构建好的重组质粒
pBT-NtFer2、pTRG-NtFer2、pTRG-NtFer1以及
pBT和 pTRG空载体进行组合, 再加上试剂盒提供
的阴性对照一共 6个组合, 用电转化仪(Electropor-
ator 2510, Eppendorf)将两种质粒导入BacterioMatch
II validation reporter cells中。细胞复苏之后, 等量
菌液分别涂布于不含有 3-AT的非选择培养基、含
有3-AT的选择培养基以及含有链霉素的双重选择
培养基上, 培养基按照 BacterioMatch II双杂交系
统载体试剂盒(Stratagene)说明书配制。
2 NtFer1和NtFer2差异表达分析
2.1 植物材料 将烟草种子(Nicotiana tabacum L. cv.
Petit Havana SR-1), 播种于含MS培养基的培养皿
中生长 1个月后, 移栽到含不同铁离子浓度MS培
养基的培养瓶中(培养基含 0、25或 100 μmol·L-1
Fe-EDTA)。生长条件为 27~29 ℃, 每天 16 h光照,
8 h黑暗。2个月后, 采集叶片和根系保存在液氮
中备用。
2.2 Northern杂交分析 用 TRlzol试剂(Invitrogeb,
Aukland, New Zealand)提取烟草叶片和根系的总
RNA。每个样本取 5 μg烟草总RNA在 1%的甲醛
变性胶上进行电泳, 然后将 RNA转移到尼龙膜上
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图 1 含铁蛋白基因NtFer1和NtFer2的重组质粒自我激活
检测
Fig.1 Testing self-activation by recombinant pBT and
pTRG containing NtFer1 and NtFer2 gene
用于转化报告大肠杆菌的质粒组合分别是: 重组 pBT-NtFer2+
空质粒 pTRG (A、B), 空质粒 pBT+ 重组 pTRG-NtFer2 (C、
D), 空质粒 pBT+ 重组 pTRG-NtFer1 (E、F), 空质粒 pBT+ 重
组 pTRG-Ga l11P(G、H)。将共转化的报告大肠杆菌分别涂布
在非选择平板培养基上( A、C、E、G )和选择平板培养基上
( B、D、F、H )。如果共转化的报告大肠杆菌不能在选择平
板培养基(B、D、F、H )上生长, 说明该系统适合用于检测目
的蛋白之间的互作分析。
(HybondTM-N+, Amersham)。参照 Engler-Blum等
(1993)描述的方法进行Northern杂交分析。为研
究 NtFer1和 NtFer2两个基因的不同表达情况, 在
两基因编码区设计特异探针, 并用地高辛探针合成
试剂盒(Boehringer Mannheim, Germany)进行探针
标记, 探针设计参照 Jiang (2005)描述的方法进行,
一个探针来自 NtFer1的编码区(110~822 bp), 另一
个探针来自 NtFer2编码区(147~788 bp)。对 2个
探针的特异性进行检测表明, 不同探针可特异性地
识别各自的 cDNA。
实验结果
1 细菌双杂交系统的检测
在利用细菌双杂交系统研究目的蛋白互作关
系之前, 先用重组诱饵质粒 pB T和空白靶质粒
pTRG, 或用空白诱饵质粒pBT和重组靶质粒pTRG
对大肠杆菌报告菌株(BacterioMatch II validation
reporter cells)进行共转化, 检测利用该系统研究2种
铁蛋白互作的可行性。按照上述组合将一个空质
粒和一个含有铁蛋白 NtFer1或NtFer2基因 cDNA
序列的重组质粒导入报告菌株, 然后将等量菌液分
别涂布到不含 3-AT的非选择平板培养基(含 25
μg·mL-1氯霉素和 12.5 μg·mL-1四环素)和含有 5
mmol·L-1 3-AT的选择平板培养基(含 25 μg·mL-1氯
霉素和 12.5 μg·mL-1四环素), 在 37 ℃培养 24 h后
进行检测。结果表明在非选择培养基上产生了大
量菌落(图 1-A、C、E、G), 说明共转化成功; 但
在含有 3-AT的选择培养基上没有菌落产生(图 1-
B、D、F、H), 说明在报告菌株中含有一个空白
质粒和一个重组质粒不会激活报告基因的转录, 即
不会产生假阳性反应, 细菌双杂交系统适用于研究
烟草铁蛋白的互作关系。
2 铁蛋白亚基互作关系分析
将含有编码 2 个蛋白基因序列的重组质粒
pBT-NtFer2和pTRG-NtFer1共导入报告菌株, 分析
烟草铁蛋白NtFer1和NtFer2之间是否存在互作关
系; 将含有铁蛋白基因 NtFer2的重组质粒 pBT-
NtFer2和pTRG-NtFer2导入报告菌株, 检测NtFer2
铁蛋白亚基之间的相互作用。结果表明, 2个组合
的共转化报告菌株在选择培养基与非选择培养基都
长出了大量的阳性克隆, 而且在2种选择培养基上
出现的克隆数都很多(图2), 说明2个铁蛋白NtFer1
和NtFer2亚基之间存在很强的相互作用, 并且相同
的铁蛋白NtFer2亚基之间的相互作用也很强。
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讨　　论
植物铁蛋白主要存在于植物细胞质体中, 如叶
绿体、线粒体、白色质体, 以及种子、幼苗、根
的顶部(Lescure等 1991; Zancani等 2007)。另外,
在植物导管细胞、维管形成层、生殖细胞和衰老
的细胞中也发现有铁蛋白的存在(Briat等 1995)。
铁蛋白在植物体中的功能主要是在种子形成、叶
片衰老或铁过量时积累铁, 在种子萌发或质体绿化
过程中释放铁, 调节植物对铁的吸收和释放(Laulhere
图 2 铁蛋白亚基NtFer1和NtFer2互作关系分析
Fig.2 Interaction analysis of NtFer1 and NtFer2 subunit
用于转化报告大肠杆菌的质粒组合分别是: 重组 pBT-NtFer2+
重组 pTRG-NtFe r1 (A、B), 重组 pBT-NtFer 2+重组 pTRG-
NtFer2 (C、D)。将共转化的报告大肠杆菌分别涂布在非选择
平板培养基上(A、C)和选择平板培养基上(B、D )。如果共转
化的报告大肠杆菌能在选择平板培养基上(B、D)生长, 说明重
组质粒上翻译出的蛋白之间存在互作关系。
3 阳性克隆的链霉素抗性筛选
为了进一步验证在选择培养基上出现阳性克
隆的蛋白组合之间相互作用的正确性, 从选择培养
基上挑取阳性克隆, 用无菌水稀释后, 均匀涂布在
含有 5 mmol·L-1 3-AT和 2种抗生素的双重选择培
养基上(含25 μg·mL-1氯霉素和12.5 μg·mL-1四环素
及 12.5 μg·mL-1链霉素), 37 ℃培养 24 h。结果表
明 2个组合均出现了阳性克隆, 证明铁蛋白NtFer1
和NtFer2亚基之间及相同的铁蛋白NtFer2亚基之
间的相互作用是真实的(图 3)。
4 两种烟草铁蛋白基因的差异表达
利用Northern杂交分析铁离子对烟草铁蛋白
mRNA丰度的影响表明, NtFer1和NtFer2在不同组
织中的表达水平差异明显。通过加铁处理发现, 叶
片和根系中NtFer1基因均可被铁离子诱导表达, 而
NtFer2基因只在叶片中被铁离子诱导表达(图 4)。
在铁离子 100 μmol·L-1的MS培养基上生长的烟草
根系中, 几乎检测不到 NtFer2基因的表达, 并且叶
片中NtFer1基因的表达水平明显高于NtFer2基因
的表达水平。
图 4 烟草叶片和根系的铁蛋白mRNA丰度分析
Fig.4 Ferritin mRNA abundance in roots and leaves of
tobacco plants
将烟草幼苗移植到含有 0、25 和 100 μmol·L-1 Fe-EDTA
的液体培养基中生长 3 个月后分别采集根和叶用于提取 RNA。
分别用对 NtFer1和 NtFer2基因具有特异性的探针进行Northern
杂交。图中数字表示铁离子含量, 单位为 μmol·L-1。
图 3 蛋白质间互作关系的链霉素抗性验证
Fig.3 Verification of positives using the streptomycin
resistance reporter
将表现为阳性的克隆涂布于双重选择平板培养基, 进一步验
证蛋白质互作的真实性。A : 来自重组 p B T - N t Fe r 2 和重组
pTRG-NtFe r1 共转化菌株; B: 来自重组 pBT -NtFer 2 和重组
pT RG -NtFer 2 共转化菌株。
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和 Briat 1993; Laulhere等 1996)。铁蛋白是迄今为
止发现的唯一能控制铁离子从固相转移到液相的蛋
白质。铁蛋白是一种由 24个亚基组成的储存铁离
子的蛋白质外壳, 这24个亚基是由去除了信号肽的
成熟肽链组成的, 但有关铁蛋白分子亚基之间的互
作研究鲜有报道。研究蛋白质体内互作关系的方
法目前可用酵母双杂交系统和细菌双杂交系统, 两
种方法各有优势。由于细菌双杂交系统具有细菌
生长快、转化率高、假阳性率低, 及来自真核生
物的外源蛋白对报告菌株的毒性作用低等特点, 因
而可明显提高实验的效率和降低真核生物蛋白质互
作的假阳性。本研究采用的 BacterioMatch II系统
中的报告基因His3和 aadA(Strr), 当待检测蛋白之
间发生相互作用, 就会使与被检测蛋白结合的DNA
结合域(λcl)氨基端, 结合到与另一被检测蛋白结合
的RNA聚合酶α亚基的N端, 从而使RNA聚合酶
结合到启动子上, 激活下游报告基因His3和 aadA
(Strr)的表达, 报告菌株对 3-AT (组氨酸酶抑制剂)
和链霉素产生的耐性, 使其不但能在含有 3-AT的
培养基上生长, 而且能生长在含有链霉素的双重选
择培养基上。这样, 被检测蛋白是否存在互作就得
到了进一步验证。本研究表明铁蛋白 NtFer1和
NtFer2亚基之间以及 2个NtFer2亚基之间均存在
很强的互作关系, 同时 2个基因在叶片中均有大量
表达, 说明在叶片中组成铁蛋白的24个亚基可能存
在 3种类型, 或来自单一的NtFer1亚基, 或来自单
一的Ntfer2亚基, 也可能源于不同的铁蛋白亚基。
而在烟草根部组织中, 由于只有铁蛋白NtFer1基因
大量表达, 而 NtFer2基因的表达非常微弱, 所以根
部的铁蛋白大分子可能由单一的铁蛋白NtFer1亚
基聚合而成的。
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