全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (1): 1~6 1
收稿 2013-10-23　　修定 2013-12-04
资助 四川农业大学“双支计划”项目(03570109)和四川农业大学
大学生创新性实验计划(6309215)。
* 通讯作者( E-mail: 173698873@qq.com; Tel: 13111822452)。
园艺植物茎尖冷冻疗法脱毒的技术研究
邱静, 汤浩茹, 曹会娟, 许晶, 杨海燕, 罗娅*
四川农业大学园艺学院, 四川雅安625014
摘要: 超低温冷冻疗法是超低温保存技术在植物脱毒上的一个新的应用。由于其脱毒率高, 操作简单, 被认为是最有效脱
除植物病毒的方法, 为脱毒苗的生产开辟了一条新的途径。本文就超低温冷冻疗法脱毒的原理、操作程序、关键技术和
在园艺植物上的最新研究进展进行综述, 并对其今后的发展进行了展望。
关键词: 超低温疗法; 超低温保存; 茎尖; 病毒
Study on Cryotherapy of Shoot Tips of Horticultural Plants
QIU Jing, TANG Hao-Ru, CAO Hui-Juan, XU Jing, YANG Hai-Yan, LUO Ya*
College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China
Abstract: Cryotherapy is a novel application of plant cryopreservation in virus elimination. Due to high virus-
free percentage and easy operation, it is considered to be the most effective detoxification method, and create a
new path for the production of virus-free plantlets. In this paper, the principles, operating procedures, key tech-
nology and the latest research progress in horticultural plants of cryotherapy were summarized; the future
development of cryotherapy was discussed as well.
Key words: cryotherapy; cryopreservation; shoot tips; virus
病毒是由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白
质构成的非细胞生物, 具有繁殖、传染和寄生在
其他生物体的能力。植物病毒是指能感染高等植
物、藻类等真核生物的病毒(王蒂2004)。迄今为
止, 记载的植物病毒已有300多种(不包括不同株
系), 主要危害禾本科、茄科、豆科、十字花科和
葫芦科等植物。病毒侵染植物后将破坏细胞的代
谢, 使其表现出生长缓慢、植株矮小、叶片失绿
或变色等特征, 从而严重影响果实品质和产量, 造
成巨大损失(王正龙 2007)。
针对病毒给生产带来的巨大影响, 生产上常采
用无病毒苗来解决此问题。目前无病毒苗主要通
过热处理脱毒法、茎尖脱毒法、热处理结合茎尖
脱毒法、花药培养法、珠心组织培养法、微茎尖
嫁接脱毒法、愈伤组织培养法和抗病毒剂法等生
物技术方法获取(Wang和Valkonen 2008a; 李志强等
2012), 其中热处理结合茎尖脱毒法运用最为广泛,
然而此法与新兴的超低温冷冻疗法相比, 存在着操
作困难, 耗时长和脱毒率不高等缺点(梁一池和杨
华2002)。本文就超低温冷冻疗法的发展历程、原
理和在园艺植物上应用的关键技术进行介绍。
1 超低温疗法的发展
1973年, Nag和Street首次利用超低温技术保
存胡萝卜细胞获得成功后, 许多实验室相继开展
了植物组织和细胞超低温保存以及种质资源库建
立的研究工作 , 并取得较大进展 (Nag和Street
1973)。Brison等(1997)首次运用超低温冷冻疗法
脱除李痘包病毒(Plum pox virus, PPV), 获得无病
毒植株后, 超低温冷冻疗法开始逐渐应用于植物
脱毒。Helliot等(2002)利用超低温冷冻疗法成功脱
除了香蕉黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,
CMV)和香蕉条斑病毒(Banana streak virus, BSA),
其脱毒率(30%和90%)明显高于茎尖培养的脱毒(0
和52%)。Wang等(2003, 2006)利用该法先后成功
脱除了葡萄病毒A (Grapevine viruses A, GVA)、马
铃薯卷叶病毒(Potato leaf curl disease, PLRV)和马
铃薯病毒Y (Potato virus Y, PVY)。2008年后, 随着
对超低温疗法的深入研究, 该法开始广泛应用于
综　述 Reviews
植物生理学报2
甘薯(Wang和Valkonen 2008a; Feng等2011)、草莓
(蔡斌华等2008)、马铃薯(白建明等2010; 王子成
等2011)、柑桔(Ding等2008)、天竺葵(Gallard等
2011)、树莓(Wang和Valkonen 2009b)和葡萄
(Bayati等2011)等多种植物病毒的脱除, 并取得了
较好的脱毒效果(表1)。
2 超低温疗法的原理
超低温冷冻疗法是建立在超低温保存基础上
的一门新型高效脱毒技术, 主要是将材料预处理
后置于液氮中冷冻处理, 再经解冻再生等过程, 从
而脱除植物病毒。其原理主要是利用茎尖分生组
织细胞与分化细胞结构上的差异进行脱毒。
为忍受超低温(–196 ℃)的极端环境, 材料需
经过脱水处理后再放入液氮中, 以免细胞内大量
冰晶形成, 降低对细胞器和细胞膜的损伤, 从而提
高细胞存活率。茎尖分生组织细胞具有体积较
小、液泡小和较大核质体积比等特点, 脱水更容
易, 在液氮环境中不易被冻死; 而分化细胞体积较
大, 含有较大的液泡和较小的核质比, 脱水处理较
难, 在超低温环境下易被冻死。此外, 茎尖分生组
织所在区域所含病毒少或不含病毒, 而分化组织
细胞所在区域往往是病毒积累区。因此, 当茎尖
分生组织经液氮处理后, 受伤死亡的细胞往往是
分化细胞, 存活的细胞是不含病毒的分生组织细
胞, 继而通过培养使其形成无病毒植株(图1)。
相比传统脱毒, 超低温冷冻疗法有以下两个
显著优点(Wang和Valkonen 2009a, b; Feng等2013):
(1)脱毒率显著高于传统方法; (2)脱毒率不依赖茎
尖大小: 传统脱毒方法需剥离0.2~0.5 mm茎尖才能
达到脱毒效果, 而超低温疗法处理的茎尖长度在2
mm范围内均可达到几乎相似的脱毒效果, 如脱除
马铃薯PYV和PLRV病毒, 1~1.5 mm的茎尖长度脱
毒效果几乎没有差异(Wang等2006), 在脱除香蕉
BSV (Helliot等2002)和葡萄GVA (Bayati等2011)等
病毒上也有相似的研究结果。目前该法被认为是
最有效脱除植物病毒的方法(Feng等2013), 为脱毒
苗的生产开辟了一条新的途经。
3 冷冻疗法操作程序
茎尖超低温疗法主要由8个步骤构成(王君晖
和黄纯农1994; Wang和Valkonen 2009b; 石茹等
2011; Feng等2013), 其流程如图2所示。
3.1 材料选择
迄今, 愈伤组织、茎尖、花粉、根尖、休眠
芽、悬浮细胞和原生质体等多种植物材料均可作
表1 超低温疗法在部分园艺植物上的应用
Table 1 The application of cryotherapy in some parts of the horticultural plants
植物 病毒 脱毒率/% 参考文献
传统脱毒方法 超低温疗法
李 PPV 19A 50 Brison等1997
香蕉 CMV/BSV 0/52A 30/90 Helliot等2002
葡萄 GVA 40B 59 Wang等2003
葡萄 GVA 12A 97 Bayati2011
马铃薯 PVY/PLPV 56/62A 83~86/91~95 Wang等2006
甘薯 SPFMV/SPCSV ≤10A 100 Wang和Valkonen 2008a
甘薯 小叶支原体 7~10A 100 Feng等2011
柑桔 HLB 25.3A 98.1 Ding等2008
树莓 RBDV - 80E Wang等2005
马铃薯 PVX 56.02C 59.13 白建明等2010
马铃薯 PVY/PVS 65D/17A 83/47 王子成等2011
天竺葵 PLPV 15A 50 Gallard等2011
草莓 SMYEV 0F 95 蔡斌华等2008
A: 茎尖培养; B: 电疗法; C: 温热疗法+茎尖培养; D: 热处理脱毒法; E: 超低温疗法结合热疗法; F: 玻璃化处理。-: 未报道。PPV: 李痘
胞病毒(Plum pox virus); CMV: 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus); BSV: 香蕉条斑病毒(Banana streak virus); GVA: 葡萄病毒A (Grapevine
viruses A); PVY: 马铃薯Y病毒(Potato virus Y); PLRV: 马铃薯卷叶病(Potato leaf curl disease); RBDV: 树莓丛状矮化病毒(Raspberry bushy
dwarf virus); SPFMV: 甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus); SPCSV: 褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus); HLB:
柑桔黄龙病(Orange huang long disease); PVX: 马铃薯X病毒(Potato virus X); PVS: 马铃薯S病毒(Potato virus S); SMYEV: 草莓轻型黄边病毒
(Strawberry mild yellow edge virus); PLPV: 天竺葵属花破裂病毒(Pelargonium line pattern virus)。
邱静等: 园艺植物茎尖冷冻疗法脱毒的技术研究 3
为超低温保存的材料。而超低温冷冻疗法在选择
脱毒材料时 , 一般选择细胞体积小、分化程度
低、核质比大、无液泡或液泡小, 经过超低温处
理后遗传性稳定的茎尖生长点或分生组织为理想
材料(Wang等2009)。
3.2 材料预培养
为减少细胞自由水含量, 增强材料的抗冻性,
使其达到超低温冷冻要求, 需要对材料进行预培
养(马千全等2007)。预培养主要有三种方式, 一是
低温驯化; 二是在培养基中添加保护性物质, 如蔗
糖、甘露醇、二甲基亚砜(DMSO)和山梨醇等; 三
是低温驯化与添加保护性物质相结合。由于第三
种方法能明显提高材料低温处理后的存活率, 是
目前普遍采用的方法。
该法的技术要点是将培养材料置于0~5 ℃下
低温驯化0~30 d后, 转移至含有0.3~1.0 mol·L-1蔗糖
或5% DMSO培养基中继续培养1~5 d, 或冷驯化与
在添加保护性物质的培养基培养同时进行。对桃
离体茎尖超低温保存处理时, 将材料置于5 ℃条件
下低温驯化3周后, 又置于含0.7 mol·L-1蔗糖的固体
MS培养基上培养2 d, 超低温处理解冻后存活率
(72%)明显高于未经低温驯化处理的存活率(0%)
(赵艳华和吴亚琴 2006)。苹果茎尖在含0.5 mol·L-1
蔗糖和0.2 mol·L-1甘露糖的MS培养基中暗培养2 d,
其存活率达81% (Liu等2004)。值得注意的是, 冷
冻保护剂的选择应根据材料的不同而有所差异,
图1 超低温疗法前后的茎尖分生组织与已分化的细胞(Wang等2009; Feng等2013)
Fig.1 Meristem of tips and differentiated cells before and after cryotherapy (modified from Wang et al 2009; Feng et al 2013)
LP1: 叶原基1; LP2: 叶原基2; HC: 健康细胞; PIC: 受病原体感染的细胞; AD: 顶端分生组织; P: 原质体; V: 液泡; Nu: 细胞核; M: 线粒
体; KC: 死亡细胞; SC: 存活细胞。
图2 茎尖冷冻疗法操作程序
Fig.2 Main steps involved in cryotherapy of shoot tips
植物生理学报4
且单独使用冷冻保护剂的效果往往较混合使用效
果差。如柑桔茎尖超低温保存预培养时, 用5%
DMSO能明显提高其成活率, 而用山梨醇处理却不
能提高其存活率(王子成和邓秀新2001)。单独用
DMSO作为红豆衫悬浮细胞超低温保存的冷冻保
护剂其存活率 (28.7%)远远低于混合使用10%
DMSO和8%葡萄糖作为冷冻保护剂的存活率
(88%) (臧新等2002)。
3.3 材料预处理
对预培养后的植物组织或细胞进行预处理,
旨在进一步提高其抗冻能力, 避免在细胞内形成
冰晶, 使其在液氮中不会被冻伤或冻死(马千全等
2007; 王郁民1992)。预处理包括两个步骤, 即装载
过程和脱水处理。其关键环节在于冷冻保护剂的
处理时间、处理温度以及冷冻方法的选择。
3.3.1 装载过程 装载过程是指在材料投入液氮
之前, 先用一定浓度的玻璃化剂处理材料。玻璃
化剂一般选择甘油和蔗糖混合液, 目前普遍采用
的是Sakai于1990年提出的PVS2 (Sakai等1990)。
不同材料装载时间和温度差异较大, 一般室温加
载0~90 min都能达到较好的效果。如马铃薯茎尖
在室温下装载20 min, 成活率可达90%以上(王彪
2011); 黑莓茎尖在室温下装载90 min成活率为85%
(Wang等2005)。
3.3.2 脱水处理 脱水处理是指在0~25 ℃下, 将装
载完毕的材料置于高浓度玻璃化剂中脱水0~180
min, 随即投入液氮中进行超低温脱毒。脱水时间
的差异也随材料的差异而有所不同。如罗汉果茎
尖最佳脱水处理是0 ℃下50 min (覃灵华和刘华英
2008); 草莓茎尖最佳脱水处理是0 ℃下60 min (蔡
斌华等2008); 甘薯最佳脱水处理是室温下180 min
(Wang和Valkonen 2008b)。
3.3.3 冷冻方法 选择合适的冷冻方法, 对材料的
存活率和再生率也有重要影响。目前, 随着国内
外对超低温保存研究的深入, 发展了多种冷冻方
法。主要包括: 快速冷冻法、慢速冷冻法、分步
冷冻法、逐级冷冻法、干燥冷冻法、脱水冷冻
法、玻璃化法、包埋脱水法和包埋玻璃化法等(马
千全等2007; 陈志林和李开锦2007; 石茹等2011)。
在上述方法中, 慢速冷冻法、分步冷冻法和逐级
冷冻法需要昂贵的降温仪, 干燥冷冻法需要控制
材料的脱水速度和脱水程度。而玻璃化冷冻法设
备要求简单、操作方便, 成为目前超低温冷冻疗
法采用较多的方法(吴雪梅和汤浩茹2005)。目前,
香蕉、草莓和树莓等材料的超低温脱毒方法均采
用玻璃化法(Helliot等2002; 蔡斌华等2008; Wang
和Valkonen 2009a)。De Carlo等(2000)比较玻璃化
法、包埋脱水法和包埋玻璃化法三种冷冻方法对
李茎尖成活率的影响, 结果表明, 玻璃化法的成活
率最高, 达54.2%, 高于包埋玻璃化法的47.5%和
包埋脱水法的4.2%。然而, 玻璃化法也不是通用
的, 不同材料最适的冷冻方法均有差异。如Wu等
(1999)用两步法、玻璃化法和包埋脱水法保存苹
果茎尖, 三种方法中包埋脱水法的成活率最高, 达
86%。因此, 选择一种适宜的冷冻方法对材料超低
温疗法脱毒效果至关重要。
3.4 化冻和洗涤
液氮处理1 h后取出的材料需马上进行化冻处
理。目前, 主要有两种化冻方法: 一是快速化冻,
即将液氮处理后的材料投入25~40 ℃的水浴中快
速化冻1~3 min, 避免植物材料细胞内的次生结冰
对材料造成伤害; 二是慢速解冻, 即将液氮处理后
的材料于0 ℃或者室温下进行慢速化冻30 min左
右(王荷和刘燕2011)。快速化冻法适合大多数植
物材料, 如黑莓(Wang和Valkonen 2009a)、百合
(Chen等2011)和甘薯(Feng等2011)等; 而一些木本
植物的冬芽或某些越冬经过低温锻炼的植物种子,
由于其细胞内水分已最大限度地流到细胞外结冰,
为避免快速化冻对细胞造成的渗透冲击, 常采用
慢速解冻法。如王郁民等(1992)在对苹果休眠枝
条进行超低温保存时发现, 在0~1 ℃的空气中缓慢
化冻有利于材料的存活, 而在38 ℃下快速化冻, 由
于枝条皮层与木质部升温不均匀, 皮层呈片状脱
离木质部, 致使枝条出现死亡。因此在解冻时要
根据材料和组织的特点选择适合的解冻方式。
化冻后洗涤的主要目的是去除高浓度冷冻保
护剂(如DMSO)对植物材料的毒害, 防止对超低温
处理后恢复培养的影响(Feng等2013)。最常用的
洗涤方法是用含1.2 mol·L-1蔗糖的MS液体培养基
在20~25 ℃条件下洗涤2~3次, 每次10 min (Wang
和Valkonen 2009a, b; 石茹等2011; Chen等2011;
Feng等2011)。
邱静等: 园艺植物茎尖冷冻疗法脱毒的技术研究 5
3.5 恢复培养和再生植株的活力检测
经液氮保存解冻后的材料需要立即转移至恢
复培养基中培养。研究表明, 材料先在黑暗或弱
光中培养一段时间后, 再转入正常光照下培养更
有利于植株的再生(石茹等2011)。刘艳霞等(2009)
将化冻后的菊花茎尖先在弱光中培养1 d, 再转入
新鲜培养基上正常光照下培养, 减少了茎尖褐变
现象及褐化对生长分化的阻碍。Chen等(2011)将
液氮处理后的3种百合茎尖在黑暗中培养2周后,
其存活率分别达到了65.0%、83.8%和43.3%。植
株的生活力检测主要是采用恢复生长法, 即解冻
后7 d统计成活率(解冻1周后茎尖颜色仍为绿色)。
3.6 再生植株的病毒检测
检测植物病毒是验证超低温疗法脱毒成功的
关键。常用的植物病毒检测方法主要有生物学方
法、电子显微镜法、免疫学检测技术和分子生物
学等4种方法(周厚成等2003)。免疫学中的酶联免
疫吸附反应(ELISA)和分子生物学方法因其特异
性强、灵敏度高、操作简单等优点, 成为目前植
物病毒检测的最重要方法 。采用酶联免疫法检测
病毒的植物包括柑橘(王彩霞等2008)、香蕉(肖火
根等1995; 林湛松等2011)、马铃薯(高方方等
2008)和百合(刘文洪等2006)等数十种园艺植物。
但ELISA检测方法需要制备抗体, 每一次只能检测
一种病毒, 而且有些植物抗体不易制备, 比如, 草
莓病毒粒子(徐东生 2003)。然而, 分子生物学方法
却不存在这些困难, 目前该法在葡萄(牛建新和李
东栋2002)、草莓(隋春等2003; 张志宏等2006)和
百合(王冲等2006)等园艺植物上都有应用。
4 展望
自1997年, Brision利用超低温疗法首次成功
脱除李痘包病毒后, 超低温疗法越来越受到科学
工作者的青睐。随着低温保存技术的不断完善和
新型冷冻保护剂的应用, 超低温疗法为园艺植物
脱毒体系的建立提供了一条崭新途径。然而作为
一种新型的脱毒方法, 仍有许多研究有待进一步
探讨: (1)脱毒苗病毒快速检测体系有待完善。酶
联免疫是一种快速检测病毒的有效方法, 但因其
抗体制备困难而受到限制。因此可以将免疫法与
分子技术相结合, 探索新的快速检测植物病毒的
方法, 建立更快更好的脱毒检测体系; (2)可从不同
材料的解剖结构出发, 分析超低温冷冻疗法过程
中不同材料病毒脱除特点, 从而深入了解超低温
疗法脱毒原理; (3)液氮处理后植株遗传体系的稳
定性不能确定, 可结合生物技术手段对低温脱毒
后植株的遗传性状进行分析; (4)由于超低温疗法
的影响因素较多, 不同材料的脱毒体系均有差异,
因此要根据材料的特性筛选预培养条件、预处理
时间和温度以及冷冻方法等, 建立每种材料合适
的超低温脱毒体系。
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