全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 1期，2010年 1月 1 1
收稿 2009-09-23 修定 　2009-12-01
资助 河南省重点科技攻关项目(92102110160)和国家自然科
学基金项目(3 0 9 00 9 7 3 )。
* 通讯作者(E-mail: wzc@henu.edu.cn; Tel: 0378-2868833-3767)。
马铃薯(Solanum tuberosum L.)茎尖的超低温保存及其遗传变异的初步观察
曲先, 王子成 *
河南大学生命科学学院农业生物技术研究所, 河南开封 475004
提要: 研究马铃薯茎尖超低温保存技术的结果表明, 4 ℃低温下锻炼6 d, 在添加二甲基亚砜(DMSO)和乙酰胺的培养基中预
培养5 d, 60% PVS2于室温下装载30 min, 0 ℃下PVS2脱水40 min时, 茎尖成活率最高(71.6%), 再生植株生长分化正常。进
一步对再生植株进行AFLP分析, 6对引物组合共扩增出385条带, 超低温保存前后的材料之间未见到明显差的异带, 但用
MSAP技术分析超低温保存前后植株甲基化的结果显示: 超低温保存后的材料均有不同程度的甲基化。在扩增的624条带
中, 处理与否之间完全一致的带型为584条; 有变化的带型为40条, 处理2 (茎尖经过完整的超低温保存过程, 区别于处理1,
增加了冷冻、解冻和洗涤后恢复培养)有13个位点的甲基化增加, 21个位点去甲基化。
关键词: 马铃薯; 超低温保存; 遗传变异; 甲基化变化
Cryopreservation of Potato (Solanum tuberosum L.) Shoot-Tips and Prelimi-
nary Observations of Its Genetic Variation
QU Xian, WANG Zi-Cheng*
Institute of Agricultural Biotechnology, College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng, Henan 475004, China
Abstract: A technology of potato shoot-tip-cryopreservation was studied in this paper. The highest survival rate
of shoot-tips could reach 71.6% after trained at 4 ℃ low temperature for 6 days, pre-cultured on the medium
with DMSO and acetamide for 5 days, loaded with 60% PVS2 for 30 min at room temperature, and dehydrated
with PVS2 for 40 min at 0 ℃. The regeneration plants differentiated normally. 385 bands were amplified from
the regeneration plants using 6 pairs of primers combination for AFLP analysis. Before and after cryopreservation
the samples showed no obvious variation bands. It suggested that the plants maintained a good genetic stability
at DNA level. But MSAP analysis on the plant methylation indicated that after cryopreservation the materials had
different methylation changes. Among 624 bands, the control and the treated samples had 584 bands of identical
type and 40 bands of changerable type. Treatment 2 (shoot-tips culture after the complete cryopreservation
process, is different from Treatment 1 with an increase of freezing, thawing and washing recovery training) had
13 de novo methylation sites and 21 demethylation sites.
Key words: potato (Solanum tuberosum); cryopreservation; genetic variation; methylation alteration
超低温保存技术可以避免传统的种质离体保
存过程中的染菌和遗传变异, 有保存时间长和稳定
而方便的优势。自Nag和 Street (1973)最早用超
低温保存胡萝卜悬浮细胞系以来, 人们先后以此方
法对200多种植物材料进行了保存, 认为是植物种
质资源长期保存的可行方法。超低温保存过程一
般包括预培养、脱水、冷冻和解冻等, 在保存过
程中会涉及到一系列的胁迫, 包括渗透胁迫和低温
胁迫等。研究表明, 这些胁迫可能作为一种选择压
对不同基因型的植物材料产生选择效应(Diettrich
等 1986), 从而对植物的遗传信息产生一定的影
响。从保存种质遗传完整性的角度出发, 对保存后
的再生材料进行遗传稳定性检测是必要的。马铃
薯的超低温保存已有报道(Wang等 2006)。但从分
子水平上研究超低温保存后马铃薯的遗传变异, 特
别是表观遗传的变化尚未见报道。本文对超低温
保存前后的马铃薯进行了AFLP和MSAP分析, 以
研究超低温保存对其遗传信息的影响。
材料与方法
材料为郑州市蔬菜研究所提供的马铃薯
(Solanum tuberosum L.)品种 ‘郑蔬 5号 ’。继代培
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养基: MS+0.2 mol·L-1 6-BA+0.03 mol·L-1 IAA, 培养
基的 pH 为 5.8, 培养室温度为(22±1) ℃, 光照强度
为 40 μmol·m-2·s-1, 光照时间为 12 h·d-1。用于AFLP
和 MSAP分子检测的材料是经过超低温保存后成
活和未进行超低温处理(对照)的材料, 超低温保存
后成活的材料为: 4 ℃低温下锻炼6 d后, 在添加二
甲基亚砜(DMSO)和乙酰胺的培养基中预培养 5 d,
60% PVS2 (PVS2成分为: 30%甘油 +15%乙二醇 +
15% DMSO+0.4 mol·L-1蔗糖)室温装载 30 min, 以
PVS2 0 ℃脱水 40 min, 液氮处理 12 h后成活的材
料, 也就是说用于分子检测的材料是经过超低温保
存后成活率最高的条件下的材料。
预培养和预处理时选取继代培养 40 d左右的
植株上带顶芽的茎段(长 0.5~1.0 cm), 4 ℃下在预
培养基培养, 预培养基为MS+50 g·L-1 DMSO+10
g·L-1乙酰胺 +0.4 mol·L-1蔗糖 +0.7%琼脂。预培养
后剥取茎段顶端 2~3 mm长的茎尖, 置于 1.8 mL
冷冻管中, 每管 10个茎尖。加入预处理液 60%
P V S 2 , 在室温下进行预处理(吴雪梅和汤浩茹
2005)。
加保护液之前用无菌枪头吸出预处理液, 加入
保护液PVS2 并置于0 ℃冰水混合液中处理不同时
间, 将冷冻管放入自制的纱布袋中, 迅速投入液氮
中进行保存。
化冻与恢复培养采取快速化冻法, 即从液氮中
迅速取出冷冻管, 以 40 ℃水浴化冻 1~2 min, 以除
去保护液并用洗涤液将茎尖洗涤3次, 每次10 min,
洗涤液成分为MS+1.2 mol·L-1蔗糖溶液。取出茎
尖置于无菌滤纸上以吸去残留在茎尖表面上的洗涤
液, 然后接种到恢复培养基上, 为了减少再培养中
的光抑制和利于离体材料恢复生长, 经过超低温保
存后的材料应进行暗培养, 暗培养后再转移到正常
光照条件下进行恢复培养。恢复培养基的成分为
MS+0.4 mol·L-1 6-BA+0.05 mol·L-1 NAA+0.3 mol·L-1
GA3, 培养基pH为5.8 (王子成和邓秀新2001; 李明
军等 2008)。
马铃薯茎尖设置 3个处理: (1)对照(茎尖不进
行任何处理, 直接在恢复培养基上继代培养); (2)处
理 1 (茎尖经预培养、预处理和保护液处理后, 不
放入液氮中冷冻, 直接洗涤并恢复培养); (3)处理 2
(茎尖经过完整的超低温保存过程, 区别于处理 1,
增加了冷冻、解冻和洗涤后恢复培养)。
DNA的提取参照邸宏等(2006)文中的 CTAB
方法。
AFLP分析参照Hao等(2002)文中的方法, 略有
改动。酶切时在 20 μL体系中加入 3 U EcoRI, 3 U
MseI, 250 ng基因组DNA; 连接: EcoRI接头, MseI
接头, T4连接酶, 25 ℃连接2.5 h; 预扩: 预扩引物为
E-A和M-C, Taq酶, 扩增 2 h; 20对引物组合用于
AFLP选扩。选扩产物 94 ℃变性 5 min后上样于
6% PAGE, 恒功率 55 W, 电泳 2.5 h, 结束后经固
定、银染漂洗与显色后分析结果并拍照。
MSAP 分析参照Cervera等(2002)文中的方法
略修改。与本文AFLP方法类似, 其中内切酶组合
为 EcoRI/HapII和 EcoRI/MspI, 接头为 EcoRI接头
和H-M接头, 预扩引物为E-A和HapII-MspI, 选扩
引物组合 13对。分子标记检测所用的接头及引物
来自上海生工公司(表 1)。
结果与讨论
1 超低温保存过程中不同处理对马铃薯茎尖成活
率的影响
从图1中可以看出4 ℃下预培养5 d的材料经
超低温保存后的存活率最高达到 71.1% (图 1-a)。
60% PVS2处理30 min的成活率最高达到71.6%, 40
min的成活率为 70.4%, 处理 50 min的成活率为
68.3% (图 1-b), 差别不明显。而用 PVS2处理 10
min存活率仅为 39.5%。这可能是 PVS2没有完全
达到缓冲作用的结果(薛建平等 2003)。而当处理
时间大于 40 min, PVS2对材料可能有毒害作用, 以
致其存活率下降, PVS2处理 60 min的存活率仅为
38.7% (图 1-c)。另外, 暗培养时间对超低温保存
后材料的恢复影响也很大。暗培养 9 d内的材料
的存活率随着处理时间的延长而增长(图1-d), 说明
暗培养对细胞的恢复是必需的, 但是暗培养时间超
过 11 d, 存活率反而又下降, 这可能是暗培养时间
过长, 光照不足, 细胞的分裂和分化受到抑制所致。
另外, 液氮处理时间的长短对材料存活率几乎没有
影响(图1-e), 这可能是由于在超低温(–196 ℃)的状
态下细胞生理代谢水平几乎停滞所致。液氮处理
时间的长短是否对DNA甲基化有影响, 尚需进一步
研究。
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表 1 AFLP和MSAP分析的接头及引物序列
Table 1 Sequences of adaptes and primers for AFLP and MSAP
引物 /接头 序列
接头 EcoRI-adapter I 5 CTCGTAGACTGCGTACC 3
EcoRI-adapter II 5 AATTGGTACGCAGTC 3
MseI-adapter I 5 GACGATGAGTCCTGAG 3
MseI-adapter II 5 TACTCAGGACTCAT 3
HapII-MspI-adapter I 5 GATCATGAGTCCTGCT 3
HapII-MspI-adapter II 5 TCATGATCCTGCTCG 3
预扩引物 E-A 5 GACTGCGTACCAATTCA 3
M-C 5 GATGAGTCCTGAGTAAC 3
HapII-MspI 5 ATCATGAGTCCTGCTCGG 3
选扩引物 EcoRI-AAC 5 GACTGCGTACCAATTCAAC 3
EcoRI-ACT 5 GACTGCGTACCAATTCACT 3
EcoRI-AGG 5 GACTGCGTACCAATTCAGG 3
EcoRI-ACA 5 GACTGCGTACCAATTCACA 3
EcoRI-ACT 5 GACTGCGTACCAATTCACT 3
EcoRI-AGC 5 GACTGCGTACCAATTCAGC 3
EcoRI-ACC 5 GACTGCGTACCAATTCACC 3
EcoRI-AAG 5 GACTGCGTACCAATTCAAG 3
MseI-CAA 5 GATGAGTCCTGAGTAACAA 3
MseI-CTG 5 GATGAGTCCTGAGTAACTG 3
MseI-CTC 5 GATGAGTCCTGAGTAACTC 3
MseI-CTA 5 GATGAGTCCTGAGTAACTA 3
MseI-CAT 5 GATGAGTCCTGAGTAACAT 3
HapII-MspI-TCAA 5 ATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA 3
HapII-MspI-TCCA 5 ATCATGAGTCCTGCTCGGTCCA 3
2 不同处理前后马铃薯茎尖变异的AFLP分析
用20对引物组合对超低温保存前后的马铃薯
茎尖进行PCR扩增, 从中筛选出谱带清晰并呈现多
态性的有效引物共 6对, 对这 6对引物PCR扩增的
谱带进行分析的结果显示: 6对引物组合共扩增出
385条带, 在超低温保存前后的马铃薯茎尖之间未
见到明显的差异带(图2)。这表明处理与否在DNA
水平上都保持较好的遗传稳定性, 没有发生遗传变
异。这和前人的研究结果(Wilkinson等 2003)相一
致。
3 基因组甲基化水平的MSAP分析
HapII和MspI是一组同裂酶, 二者均识别并切
割 5 CCGG 3序列, 但HapII对胞嘧啶的甲基化极
其敏感, 它不能切割任何 1个或 2个均甲基化的序
列, 也即 HapII对 5 CmCGG 3、5 mCCGG 3和
5 mCmCGG 3都不能表现出活性, 但若只在单链发
生甲基化, 就能够识别切割。一般认为MspI对内
部胞嘧啶的甲基化不敏感, 而对外部胞嘧啶的甲基
化则很敏感, 也就是说MspI可以切割5 CmCGG 3,
但不能切割 5 mCCGG 3。本文将MSAP方法测
出的限制带型分为 a、b、c、d这 4种(表 2)。通
常认为, MSAP不能检测到DNA外侧或内、外侧
胞嘧啶完全甲基化的位点( mCC GG/ GG C mC 或
mCmCGG/GGmCmC), 即H、M在此种酶切位点处无
带, 而本文中超低温保存与否的马铃薯茎尖在此位
点无带时作统计, 如果未做超低温保存的有而超低
温保存的材料无带或未做超低温保存的无带而超低
温保存材料有带, 则说明超低温保存的马铃薯茎尖
在此位点上发生甲基化。
本文用MSAP技术分析马铃薯茎尖超低温保
存后DNA甲基化的遗传变异的结果(图3)显示: 13
对引物组合共扩出600条左右清晰条带, a型带355
条, b型带 121条, c型带 108条。c型带比 b型带
略少。与不作超低温处理相比, 超低温保存后的材
料均有甲基化变异带, 处理 1和 2的总变异带分别
为 26条和 34条, 变异率分别为 4.41%和 6.78%。
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图 1 超低温保存过程中不同处理对保存后的马铃薯茎尖成活率的影响
Fig.1 Cryopreservation process of different treatments on impact of the survival rate of potato shoot tips
说明超低温保存后茎尖DNA的甲基化发生变化。
玻璃化法超低温保存的茎尖(处理2)比只用PVS2处
理的未经过超低温的茎尖(处理 1)变异率大。变异
带增加的类型中, b→ d型最多, 处理 1达 6条, 处
理 2达 8条。另外, 处理 1中, a→ b型的 1条、a
→c型的4条; 甲基化减少的带型处理1和处理2的
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表 2 HapII和MspI的甲基化敏感性、限制性带型和带型分类
Table 2 The methylation-sensitive and restriction bands of HapII and MspI and the classify of the bands pattern
内切酶活性 限制性带型
甲基化状态 带型统计类型
HapII MspI H M
CCGG/GGCC 有 有 ＋ ＋ a
mCCGG/GGCC 有 无 ＋ － b
CmCGG/GGmCC 无 有 － ＋ c
mCmCGG/GGmCmC 无 无 － － d
mCCGG/GGCmC 无 无 － － d
a 表示 H、M都有带(＋、＋); b表示 H 有带、M没带(＋、－); c表示 H 没带、M有带(－、＋); d表示 H、M都没带(－、－)。
图 2 不同处理样品基因组DNA的AFLP分析电泳图谱
Fig.2 DNA-AFLP finger-printing map of the different
treatment samples
1: 对照; 2 : 处理 1; 3 : 处理 2。
图 3 不同处理样品的基因组DNA甲基化
的MSAP分析电泳图谱
Fig.3 DNA methylation MSAP finger-printing map of the
different treatment samples
1: 对照; 2 : 处理 1; 3 : 处理 2。
表 3 不同处理样品的MSAP带型数
Table 3 MSAP-banding patterns of the different
treatment samples
甲基化变化
处理
增加条数 减少条数
处理 1 a→ b 1 b→ a 7
a→ c 4 c→ a 2
a→ d 0 c→ b 3
b→ c 0 d→ a 1
b→ d 6 d→ b 2
总数 1 1 总数 1 5
处理 2 a→ b 1 b→ a 8
a→ c 1 c→ a 3
a→ d 2 c→ b 5
b→ c 1 d→ a 2
b→ d 8 d→ b 3
总数 1 3 总数 2 1
甲基化增加的带型为: a→ b、a→ c、a→ d, b→ c、b→ d;
甲基化减少的带型为: d→ b、d → a、c → b, c → a、b → a。
基本上都有, 其中b→ a最多, 说明去甲基化的带型
变化较一致。处理1和处理2的甲基化减少条带数
分别为15和 21条; 这表明超低温保存后, 无论是液
氮冷冻还是冷冻外的处理都对茎尖的甲基化状态有
一定程度的影响。既有甲基化增加, 又有脱甲基化
变化, 总的来看, 去甲基化变化是主要趋势(表 3)。
总之, 超低温保存影响植物的甲基化变化后是
否会引起可遗传的变异, 以及哪些基因表达有变化,
尚需深入研究。
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