全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (10): 1445~1452　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0209 1445
收稿 2014-05-04　　修定 2014-08-26
资助 国家自然科学基金项目(31222053、31170431和31172256)、
教育部长江学者和创新团队发展计划(IRT13019)、新世
纪优秀人才支持计划(NCET-11-0217)、中央高校基本科
研业务费项目(lzujbky-2013-k08和lzujbky-2013-bt05)。
* 通讯作者(E-mail: jlzhang@lzu.edu.cn; Tel: 0931-8913447)。
非损伤微测技术在植物生理学研究中的应用及进展
李静, 韩庆庆, 段丽婕, 王沛, 李惠茹, 王锁民, 张金林*
兰州大学草地农业科技学院, 草地农业生态系统国家重点实验室, 兰州730020

摘要: 非损伤微测技术(NMT)是一种选择性微电极技术, 可以在不损伤活体样品的情况下获得进出样品的各种离子或分子
浓度、流速及其三维运动方向的信息。该技术具有非损伤性、长时间、多电极、高分辨率、高灵敏度、多角度测量等优
点, 可获得其他技术难以测到的生理特征和生命活动规律, 从而在理论研究和应用领域产生实质性的突破。本文综述了近
年来NMT在植物营养调控、抗病性、抗盐碱、抗旱、抗冷、抗重金属毒害等方面的应用及其进展, 并展望了NMT在植物
生理学研究中的应用前景。
关键词: 非损伤微测技术; 植物营养调控; 生物胁迫; 非生物胁迫
Applications and Advances of Non-Invasive Micro-Test Technique in Plant
Physiology Researches
LI Jing, HAN Qing-Qing, DuAN Li-Jie, WANG Pei, LI Hui-Ru, WANG Suo-Min, ZHANG Jin-Lin*
State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University,
Lanzhou 730020, China
Abstract: Non-invasive micro-test technique (NMT) is a kind of selective microelectrode technique which can
get the information on concentration, flux rate and three-dimensional movement of ions or molecules going in
or out of the samples without any damages. The technique has the advantages of being non-invasive, long-term,
multi-electrodes, high resolution, high sensitivity and multi-angle measurement etc. NMT can aid scientists to
obtain physiological characteristics and life activity rules of the tested samples that are difficult to be detected
by other techniques. In this paper, the application and development of NMT in plant nutrition regulation, dis-
ease resistance, and salt, alkali, drought, cold and heavy metal tolerance etc. are reviewed. Finally, the applica-
tion of NMT in plant physiology is prospected.
Key words: non-invasive micro-test technique; plant nutrition regulation; biotic stress; abiotic stress
自从1974年美国海洋生物学实验室(Marine
Biological Laboratory)的神经科学家Lionel F. Jaffe
提出非损伤微测技术(non-invasive micro-test tech-
nique, NMT)原初概念, 到1990年成功应用于测定
细胞Ca2+运动方向和流速, 该技术已经解决了众多
科学问题(Kuhtreiber和Jaffe 1990; Jaffe 2010)。
NMT是实时选择性测定进出活体材料离子和小分
子流速的技术, 是生理功能研究的工具之一。该
技术由电脑自动控制离子和分子选择性微电极,
在不接触活体样品的情况下, 获得进出样品的各
种离子和分子浓度、流速及其三维运动方向的信
息(丁亚男和许越2007), 能够按照研究人员的设定,
以手动或编程的方式, 从任意角度(相对于样品表
面)对样品进行测量(霍翔远等2010)。NMT技术具
有以下特点: (1)非损伤活体测量; (2)可长时间进行
三维动态和实时测量; (3)多个微电极同时测量; (4)
具有高分辨率和高灵敏度; (5)强大的智能化数据
采集、分析及管理软件(丁亚男和许越2007; 吕杰
等2013)。NMT的原理是通过微电极和微传感器
获取离子和分子的信号, 基于Nernst方程和Fick’s
第一扩散定律计算离子和分子的浓度和流速, 能
够获得非常细微的信号 , 流速能够达到1 0 - 1 2
mol·cm-2·s-1 (Smith 1995; 丁亚男和许越2007)。目
前, NMT可以测量H+、Ca2+、K+、NH4
+、Al3+、
Na+、Cd2+、NO3
-、Cl-以及O2、CO2、NO、氨基
酸等50多种离子和分子, 为获得生物样品离子和
植物生理学报1446
分子信息提供了良好的实验平台(丁亚男和许越
2007)。被测样品可以是单细胞、细胞层、组织、
器官甚至整个生物体, 从而获得其他技术难以检
测的生理特征和生命活动规律, 在理论研究和应
用领域方面产生了前所未有的重大突破(梁宇等
2004)。随着NMT的快速发展, 该技术在诸多领域
得到广泛应用, 取得了大量的科研成果, 在诸多学
科领域得到应用 , 如植物学、动物学、微生物
学、医学、环境科学、材料科学等 (吕杰等
2013)。本文重点综述了NMT在植物营养调控、
抗病性、抗盐碱、抗旱、抗冷、抗重金属毒害等
方面的应用及其进展(表1)。
1 在植物营养调控研究中的应用
在复杂的生长发育过程中, 植物需要从周围
环境大量吸收N、P和K等营养元素, 这些营养元
素常常以NH4
+、NO3
-和K+等离子的形式流入到根
内, 为保证植物正常吸收营养离子, Ca2+、H+等离
子往往要流入或流出根部进行调节(Shabala和
Newman 2000)。因此, 离子流的检测能够在微观
尺度上研究植物吸收营养这一动态过程(Yang等
2010a)。同时, NMT也是植物营养研究与检测的新
系统, 它可以研究作物营养吸收的机理和规律以
及调控机理, 寻找调节营养吸收的物质, 能够采集
植物生长过程中NH4
+、NO3
-、K+、Ca2+及H+等离
子流的变化情况, 绘制营养吸收曲线, 筛选优良的
作物品种, 评价肥料的效果, 指导合理施肥, 这是
对植物营养吸收过程最直接反映, 为评价作物的
营养供应提供了非常可靠的证据(Li等2010)。
Hawkins等(2008)采用NMT研究表明, NO3
-、NH4
+
和H+的净吸收速率在花旗松(Pseudotsuga menzie-
sii)和扭叶松(Pinus contorta)之间存在很大差异; 根
不同区域的营养吸收有很大差别, 离子流状况受
根的生长和成熟速率的影响, 并为每个物种的起
源收集了数据, 这种离子流的图谱为认识品种间
差异提供了直观的数据。Hawkins和Robbins
(2010)采用NMT比较了两种针叶树(花旗松和扭叶
松)和大豆(Glycine max)根部NH4
+和NO3
-在pH影响
下的吸收过程, 发现在大豆和扭叶松中, pH值为7
时质子外流, 但是pH为4时质子内流; 花旗松根尖
以后都出现质子外流, 且能够在低pH下保持NH4
+
的吸收, 可能与保持质子的外流相关, 这种质子外
流使植物能更好地适应酸性土壤。Li等(2010)使
用NMT研究了高铵毒害的机理, 发现限制跨膜的
NH4
+流和GMPase的功能能够显著降低NH4
+对拟
南芥(Arabidopsis thaliana)的毒害, 这项工作为植
物的铵盐毒害提供了理论解释。Ding等(2011)把
丛枝菌根真菌(Glomus mosseae, GM)和慢生大豆
根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum, BJ)注射到大豆
苗中, 通过NMT研究发现, GM把根瘤的H+外流提
高了3倍, BJ把接近根瘤部位侧根的H+外流提高了
8倍。植物磷含量的增加与根瘤和菌丝的H+外流
呈显著的线性正相关, 研究认为从枝菌根真菌诱
导了固氮酶的活性, 增加了根瘤的H+外流(冯固等
2000)。孙清斌等(2008)发现磷可以提高铝的耐性,
磷和Al3+可以发生相互作用, 最后通过NMT研究H+
的流速解释了这一现象。ten Hoopen等(2010)使用
NMT测定大麦(Hordeum vulgare)和拟南芥根部的
NH4
+、K+的积累以及NH4
+、K+和H+的流速, 结果
表明, 植物的K+转运体和通道能够转运NH4
+, 通过
转运体调控的NH4
+吸收可能是由于在低K+水平
NH4
+毒性的作用结果, 从而解释了NH4
+的毒性可
以通过更多的K+得到缓解的假说。小麦(Triticum
aestivum)根部营养吸收的节律性是Shabala和
Knowles (2002)运用NMT发现的, 他们的研究结果
显示, 小麦根部对K+、H+和Ca2+的吸收呈现一定规
律的正弦曲线。Fang等(2007)研究发现合理的施
肥能够促进作物吸收更多的NH4
+和NO3
-, 外界
NH4NO3浓度升高有助于吸收更多的NO3
-, 但是减
少了对NH4
+的吸收, 说明合理的施肥对于氮素的
吸收具有重要的调节意义。Luo等(2013)研究表明
H+流与NH4
+和NO3
-的吸收具有负相关性, 因此, 可
以通过调节土壤的pH来促进植物对氮素的吸收。
Xu等(2012b)使用NMT测定了拟南芥根部的H+流
速, 发现14-3-3蛋白(tomato 14-3-3 protein, TFT)超
表达的植物在低磷胁迫下增加H+的流速和质膜
(plasma membrane, PM) H+-ATPase的活性, 进一步
从基因到蛋白, 再到生理功能的一系列工作, 清晰
地阐明了该基因的功能。
2 在植物抗病性研究中的应用
Ramos等(2009)使用NMT研究了芽管菌丝发
育时期菌丝中的H+流, 发现胞外的pH在宿主植物
玉米(Zea mays)和菌根真菌(Gigaspora margarita和
李静等: 非损伤微测技术在植物生理学研究中的应用及进展 1447
表1 NMT在植物适应非生物逆境研究中的应用
Table 1 Application of NMT in the studies on plant responding to various abiotic stresses
胁迫类型 植物材料 所测离子及部位 结论 参考文献
盐碱 大麦 根部K+和H+流速 K+外流与抗盐性呈负相关 Chen等2005
小麦 根细胞质膜K+和Ca2+净离子流 Ca2+流速与K+通道的激活没有相关性 Gilliham等2006
大麦 根部的Na+和K+流速 大麦耐盐的主要机制并不是木质部Na+的外排, 而是 Chen等2007
耐盐型品种能更有效地将Na+区隔化到叶片中, 且能
维持木质部更高的K+/Na+比
烟草 叶肉细胞质膜上Na+和K+流速 CED-9 (抗凋亡基因)表达能显著降低氧化应激引起 Shabala等2007b
的K+外流
拟南芥 pks5突变体根中H+和Ca2+净流 pks5突变体植株把质子排出胞外, 因而能够忍耐外 Fuglsang等2007
量的变化情况 部更高的pH
大麦 根部的Na+和K+流速 大麦抗盐品种对盐胁迫的响应通过累加效应产生作用 Chen等2008
破囊壶菌 盐胁迫下Na+、Cl-和K+ 流速 破囊壶菌细胞在没有Na+的环境中也能够正常生长 Shabala等2009
胡杨和群众杨 根部和根原生质体在盐胁迫下 胡杨抗盐的机制在于其根部质膜上具有高活性的 Sun等2009
的Na+、H+和Cl-流的变化情况 Na+/H+逆向蛋白和较强的离子转运能力
大麦 木质部的Na+和K+流速 木质部装载K+可能是SKOR将K+排到木质部的结果 Shabala等2010
拟南芥 质膜H+流速 质膜H+-ATPase的磷酸化状态对拟南芥应对环境刺 Yang等2010b
激非常重要
海榄雌 根部的Na+流速 NO调节的质膜H+-ATPase和液泡膜Na+/H+反向转运 Chen等2010
体的活性与盐忍耐密切相关
小麦 根部的Na+流速 小麦的抗盐性受Na+/H+逆向转运蛋白驱动 Cuin等2011
藜科植物 叶片Na+和K+离子和渗透的 藜科植物昆诺阿藜木质部有非常强烈的Na+控制能 Hariad等2011
关系 力和有效地把Na+从叶片移除的能力
杨树 接种外生菌根(EM)真菌的杨 EM增加共生期间根部的Ca2+, Ca2+调节盐胁迫下的 Li等2012
树根部Na+、K+和Ca2+离子流 K+、Na+稳态平衡
拟南芥 根部的H+流速 碱胁迫增加了野生型拟南芥根尖生长素的转运和 Xu等2012a
PIN2的表达
二色补血草 盐腺的Na+分泌速率 Na-K-Cl共转运体可能参与盐腺分泌Na+ 杨剑超等2012
胡杨和群众杨 根的Na+、H+和K+流速 H2S通过上调杨树根系胞质膜Na
+/H+逆向转运体系, 朱会朋等2013
促进Na+和H+逆向跨膜转运, 并且限制盐诱导的K+
外流
红树 根的Na+、H+、K+和Ca2+流速 外源H2O2、NO和Ca
2+调节NaCl胁迫下两种红树根 Lu等2013
的离子流
拟南芥 根部在盐处理后Na+外流 TaST基因过表达的拟南芥幼苗根部在盐处理后Na+ Huang等2012
呈现明显的外流
烟草 根尖伸长区表皮细胞的Ca2+ 甜菜碱和盐分(NaCl)能够共同影响Ca2+的跨膜流动 Li等2014
流信息
干旱 水稻和拟南芥 根尖ABA积累、生长素运 中度水胁迫增加根尖ABA的积累和生长素的运输, Xu等2013
输和质膜H+流速 ABA参与根尖生长素运输的调控, 生长素激活质膜
H+-ATPase
低温 豌豆和蚕豆、黄 根部的H+流速 冷敏感品种的临界温度更高, 这种临界温度的差异 Shabala和
瓜和南瓜、玉米 可能与细胞膜的相变引起的离子转运有关 Newman 1997
重金属 烟草 根部Cd2+的流速 NO通过调节Cd2+的吸收和促进Cd2+在BY-2细胞的积 Ma等2010
累导致Cd2+诱导的PCD中扮演着正调控的作用
拟南芥 根毛Ca2+流速 Cd2+引起Ca2+外流, 破坏Ca2+梯度 Fan等2011
水稻 根毛K+流速 外源施用CdCl2能明显造成水稻根毛细胞膜的去极 李隼等2011
化, 诱导外向K+通道开放, 导致根系内K+外渗
东南景天 根部和叶片Cd2+的流速 Cd2+超积累生态型表现出较高的根系Cd2+内流和叶 Sun等2013a
柄Cd2+外流
胡杨 细胞质膜和液泡膜的Cd2+ H2S能通过调控液泡对Cd
2+的富集与隔离来减轻Cd2+ Sun等2013b
流速 的毒性
缺氧 玉米 根尖NO流速 NO释放与氧气消耗自动调控的环路是有效适应缺 Mugnai等2012
氧条件的重要因素
植物生理学报1448
Glomus clarum)间的离子交换以及菌根真菌在宿
主植物生长中的重要作用, 菌丝的H+流振荡与芽
管菌丝的生长存在相互关系, 菌丝的H+流和生长
被根系分泌物所调控, 此项工作对于认识真菌的
生长发育及其响应外源物质的机理提供了全新的
思路, 即H+是真菌发育的关键标签。Nemchinov等
(2008)采用NMT检测了经丁香假单胞菌(Pseudo-
monas syringae)处理的烟草(Nicotiana benthami-
ana)根Ca2+流的变化情况, 发现Ca2+内外流与细菌
处理的时期有关, 通过Ca2+流的转变认识到了细胞
防御反应中的关键成分, 建立了细胞死亡与防御
过程中的离子流模型, 推断在植物的病原超敏反
应中, 质膜Ca2+-ATP泵是超敏反应的关键。因此,
通过研究离子流可以发现植物和真菌相互作用过
程中发生的变化, 这种变化可能是不同真菌的特
异性所致, 从而可建立植物和真菌相互作用的信
号转导途径。
3 在植物抗盐碱研究中的应用
盐渍化会对植物造成各种各样不利的影响,
例如离子毒害、渗透胁迫、营养元素失衡等, 最
终抑制植物的生长, 从而严重制约农业生产; 大量
的研究表明, 保持K+/Na+平衡对于植物适应高盐环
境至关重要(Zhang等2010; Zhang和Shi 2013)。北
京林业大学陈少良研究组使用NMT研究了抗盐的
胡杨(Populus euphratica)和盐敏感的群众杨(P.
popularis)根部和根原生质体在盐胁迫下的Na+、
H+和Cl-流的变化情况, 发现胡杨抗盐的机制在于
其根部质膜上具有高活性的Na+/H+逆向蛋白和较
强的离子转运能力(Sun等2009)。Li等(2012)测定
了卷边网褶菌(Paxillus involutus)菌株MAJ和NAu
影响下的白杨树盐敏感杂交种 (Popu lus×ca-
nescens)根部和外生菌根真菌的H+、Na+、K+和
Ca2+的离子图谱, 发现外生菌根真菌改变了植物在
盐胁迫下的Ca2+流速, 减少K+外流, 促进H+吸收和
Na+排出, 从而调节盐敏感杨树的K+/Na+稳态平
衡。澳大利亚科学家使用NMT研究了藜科(Che-
nopodiaceae)植物昆诺阿藜(Chenopodium quinoa)
离子和渗透的关系, 发现盐生植物木质部有非常
强烈的Na+控制能力或有效地把Na+从叶片移除的
能力(Hariad等2011)。近年来的研究表明, 植物把
吸收的Na+排出体外和保持K+的能力是抗盐的重
要性状(Shabala等2007a; Zhang等2010; Li等2012;
Zhang和Shi 2013)。Gilliham等(2006)应用NMT检
测出小麦根细胞质膜K+和Ca2+净离子流速, 并与膜
片钳技术测得的电流强度比较后发现, K+流速/强
度的比值变化反映了质膜上外整流K+通道的不同
分布, 而且Ca2+流速与K+通道的激活并没有相关
性。为了了解抗盐性状的遗传行为, 并建立新的
抗盐评价标准, 澳大利亚科学家Shabala的研究小
组使用NMT测定了不同抗盐能力大麦的K+流速,
发现K+外流与抗盐性呈负相关, K+和H+流作为盐
胁迫的早期事件, 不仅能够研究调控机理, 而且还
能用来快速筛选耐盐碱植物(Chen等2005)。Chen
等(2007)研究表明, 大麦耐盐的主要机制并不是木
质部Na+的外排, 而是耐盐型大麦品种能更有效地
将Na+区隔化到叶片中, 且能维持木质部更高的K+/
Na+比, 其木质部对K+的装载能力更强, 这一过程
也可能是液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白控制的。大
麦抗盐品种对盐胁迫的响应主要是通过累加效应
产生作用, 与抗性等位基因有关, 而且部分表现出
显性遗传(Chen等2008)。Shabala等(2010)将NMT
与膜片钳技术结合使用, 发现大麦木质部装载K+
可能是中柱细胞质膜上的外整流钾通道(stelar K+
outward rectifying channel, SKOR)将K+排到木质部
的结果。同时Cuin等(2011)研究表明, 不同小麦品
种的Na+内流速率相当, 耐盐品种‘Kharchia 65’的
净Na+外流速率显著高于其他盐敏感小麦, 可能受
质膜Na+/H+逆向转运蛋白驱动。这一系列研究为
快速评价麦类作物的抗盐性建立了新的标准, 也
有望在其他物种中进行尝试。我们使用NMT测定
了不同K+、Na+条件下盐生植物小花碱茅(Pucci-
nellia tenuiflora)根部Na+、H+、K+和Ca2+的流速,
结果表明提高Na+的外排和K+的内流是小花碱茅
适应高盐(300 mmol·L-1 NaCl)和钾饥饿生境的重
要策略; Na+的外排受Na+/H+逆向转运蛋白(salt
overly sensitive 1, SOS1)的介导, 且由H+跨膜梯度
来驱动; 在高盐胁迫初期Ca2+的大量内流可能在
SOS系统信号转导过程中发挥关键作用, 从而激活
了SOS1 (未发表资料)。
香港中文大学张建华实验室证实了生长素转
运蛋白PIN2在通过质膜H+-ATPase引起的质子分
泌调控植物根适应碱胁迫的过程中起到重要作用
李静等: 非损伤微测技术在植物生理学研究中的应用及进展 1449
的假说, 发现碱胁迫增加了野生型拟南芥根尖生
长素的转运和PIN2的表达, 证实了PIN2在适应碱
胁迫中是必需的因子之一, 它通过调节根尖的质
子分泌维持初生根的伸长进而应对碱胁迫的不利
影响(Xu等2012a)。Fuglsang等(2007)检测了不同
pH条件下拟南芥pks5突变体根中净H+流量的变化
情况, 发现在根尖处pks5突变体较野生型保持了更
高的质膜H+-ATPase活性, 从而具有更强忍耐高pH
的能力, 说明PKS5是新的Ca2+信号途径的调控者,
参与控制质膜H+-ATPase的活性和胞外的酸化。
Chen等(2010)通过测定Na+流速揭示了NO提高植
物抗盐的机理, 提供了NO调控盐腺Na+外流的直接
证据, 发现NO通过增加HA1和SOS1基因的表达、
盐分泌和Na+外流来增强海榄雌(Avicennia marina)
对盐的忍耐, NO调节的质膜H+-ATPase和液泡膜
Na+/H+反向转运体的活性与盐忍耐密切相关。Or-
doñez等(2014)研究发现, H2O2引起拟南芥根部快
速的K+外流和Ca2+内流。H2O2指纹可能操控高等
植物细胞中除细胞质钙指纹以外的信号转导系统
(Bose等2014)。Yang等(2010b)使用NMT研究发现,
拟南芥分子伴侣蛋白J3可以和PKS5相互作用且抑
制PKS5激酶活性。Huang等(2012)发现过表达小
麦TaST基因的拟南芥幼苗在盐处理后根部Na+呈
现明显的外流(而作为对照的野生型拟南芥则呈现
较多的Na+内流), 从而证实了TaST基因能增强植物
的排盐能力进而达到抗盐的目的。Li等(2014)以
烟草为材料, 发现甜菜碱和盐分(NaCl)能够共同影
响Ca2+的跨膜流动, Ca2+-CaM信号转导途径对热休
克蛋白(heat shock protein, HSP)的激活具有重要作
用, 从而提高烟草的耐盐性。这项研究建立了新
的Ca2+-CaM信号转导模式。Shabala等(2007b)研究
表明CED-9 (抗凋亡基因)控制叶肉细胞质膜上的
两种K+通道: 外整流K+通道(K+ outward rectifying
channel, KOR)和非选择性阳离子通道(non-selec-
tive cation channel, NSCC), 阻止NaCl引起的叶片
K+外流, CED-9基因表达能显著降低氧化应激引起
的K+外流, 维持胞内离子平衡, 以减少氧化应激带
来的短期和长期损害。Shabala等(2009)采用NMT
揭示了海洋原生生物破囊壶菌(Thraustochytrium
roseum)渗透调节的离子机制, 发现低渗引起破囊
壶菌显著的Na+、Cl-和K+外流, 胁迫初始的30 min
内完成了渗透调节, 这项工作为细菌如何进行渗
透调节提供了证据, 发现破囊壶菌细胞在没有Na+
的环境中也能够正常生长, 证明细胞的渗透/膨压
也能通过其他方式进行调节以及调节的机制。Lu
等(2013)使用NMT测定了红树(Bruguiera gymnor-
rhiza和Kandelia candel)根的Na+、H+、K+和Ca2+流
速, 发现外源H2O2、NO和Ca
2+调节NaCl胁迫下两
种红树根的离子流。
4 在植物抗旱研究中的应用
植物在适应土壤干旱的过程中, 维持根的生
长非常重要。Xu等(2013)通过NMT等多种方法证
实了植物为了保持根在中度水分胁迫下的生长,
需要生长素激活根尖质子的分泌, 进而调节脱落
酸(abscisic acid, ABA)介导的植物适应干旱的过程
以达到抗旱的目的。使用水稻(Oryza sativa)和拟
南芥为材料, 用渗透势为–0.47 MPa的聚乙二醇
(polyethylene glycol, PEG)进行模拟干旱胁迫处理
后, 检测了根尖的ABA积累, 生长素运输和质膜
H+-ATPase的活性(H+流速或称质子流速), 以及初
生根的长度和根毛的密度。结果表明, 中度干旱
胁迫增加了根尖ABA的积累和生长素的运输 ,
ABA参与了根尖生长素运输的调控, 生长素激活
了质膜H+-ATPase, 使更多的质子释放用来适应水
胁迫, 而根尖的质子分泌对保持和促进初生根的
伸长和根毛的发育是必需的过程。这项研究从
ABA调节干旱的作用入手, 发现生长素参与了干
旱的调节, 最终通过促进质子的分泌来维持水胁
迫下根的生长, 进一步说明激素之间的相互激活
对适应环境胁迫具有重要意义。
5 在植物抗冷研究中的应用
Shabala和Newman (1997)使用NMT测定了抗
冷的豌豆(Pisum sativum)和蚕豆(Vicia faha)、冷敏
感的黄瓜(Cucumis sativus)和南瓜(Cucurhita pepo)、
中间型冷忍耐的玉米根部的H+流速, 发现了3个明
显的临界温度, 冷敏感品种的临界温度更高, 这种
临界温度的差异可能与细胞膜的相变引起的离子
转运有关。通过NMT测定临界温度为植物育种提
供了快速和可靠的筛选抗冷品种的手段。
6 在植物抗重金属毒害研究中的应用
重金属是一类重要的环境污染物, 植物受重
金属胁迫后细胞的膜透性、光合代谢、呼吸代
植物生理学报1450
谢、酶代谢、遗传效应发生改变, 植物的耐性机
制表现在耐金属生态型的产生、重金属结合多肽
的形成、重金属离子的区域化以及活性氧自由基
清除系统的活化(杨世勇等2004)。Cd2+强烈抑制植
物的生长和发育, 是有害的重金属之一。NO是一
种重要的生物活性气体和功能分子, 在植物遭受
生物和非生物胁迫下NO作为信号分子对提高植物
的抗逆性发挥重要作用(Neill 2007)。Ma等(2010)
发现, 烟草Cd2+诱导细胞程序化死亡(programmed
cell death, PCD)出现时伴随着NO含量的显著增加,
施加NO释放剂——硝普酸钠(sodium nitroprusside,
SNP)可以加速PCD, 也可以促进Cd2+的内流, 导致
胞内Cd2+的更多积累; 而NO合成酶抑制剂——硝
基-L-精氨酸甲酯(nitro-L-arginine methylester,
L-NAME)和NO特异清除剂——2-(4-羧基苯)-
4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物[2-(4-carboxy-
phenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-ox-
ide, cPTIO]可缓解Cd2+引起的毒性, 降低Cd2+进入
细胞的速率, 减少胞内Cd2+的累积, 甚至是导致
Cd2+外流。基于这些研究结果, 认为NO通过调节
Cd2+的吸收和促进Cd2+在BY-2细胞的积累导致
Cd 2+诱导的PCD中扮演正调控的作用。Fan等
(2011)通过研究Cd2+对细胞极性和Ca2+流速的影响,
发现Cd2+引起Ca2+外流, 破坏Ca2+梯度, 进而改变囊
泡运输, 导致细胞壁解聚, 尖端生长受到破坏, 这
为CdCl2影响拟南芥的细胞生物学机制提供了证
据。Sun等(2013a)研究表明东南景天(Sedum alfre-
dii) Cd2+超积累生态型表现出较高的根系Cd2+内流
和叶柄Cd2+外流。Sun等(2013b)发现H2S可以显著
缓解Cd2+诱导的胡杨PCD, 能通过调控液泡对Cd2+
的富集与隔离来减轻Cd2+的毒性, 为应对重金属污
染提供了新的研究思路。
7 在其他研究中的应用
Antoine等(2000, 2001)应用NMT和激光共聚
焦技术同时检测了玉米卵细胞与配子融合过程中
卵细胞内外Ca2+的变化情况, 发现在融合一瞬间,
胞外Ca2+有一个非常明显的内流, 而此时激光共聚
焦技术发现胞内Ca2+显著增加, 说明卵细胞和配子
融合过程中胞外的Ca2+参与了这个重要的生命过
程。Mugnai等(2012)使用NMT等方法研究发现玉
米根尖过渡区在感受和适应根部缺氧中起着重要
作用, 根尖细胞暴露在缺氧环境中促使整个根部
适应缺氧, 缺氧引起的NO外流与过渡区密切相关
并且对整个根部适应缺氧十分重要。Chen等
(2009)采用NMT分析了钙调素(calmodulin, CaM)
的功能和蛋白表达模式, 发现抑制Ca2+-CaM时快
速诱导了胞外Ca2+的内流, 导致胞内Ca2+浓度的急
剧增加和花粉管超微结构的异常, 随后肌动蛋白
丝解聚, 内吞和胞外分泌紊乱, 细胞壁结构改变,
最后导致花粉管生长混乱。Wu等(2008)利用显微
注射、荧光能量共振转移(fluorescence resonance
energy transfer, FRET)和NMT等技术证明了白皮松
(Pinus bungeana)花粉管发育过程中胞外CaM在与
其胞外结合点结合后, 可以引起胞内第二信使Ca2+
信号的增强, 说明植物胞外CaM可以通过介导跨
膜信号而发挥其信号肽的功能。Wang等(2010)发
现来自红海棉(Latrinculia magnifica)的高毒大环内
酯(latrunculin-B, Lat-B)或来自海棉(Jaspis johnsto-
ni)的天然产物大环肽(jasplakinolide, Jas)能够引起
肌动蛋白丝的分解, 导致线粒体中的Ca2+释放到胞
质中, 随之改变胞质中的Ca2+浓度。
8 展望
NMT已被应用于诸多领域, 作为一个开放性
的实验平台 , 正以其独特的优势发挥更大的作
用。在基因组学、蛋白质组学和代谢组学发展的
过程中, 越来越多的科学家认识到研究结构和功
能的重要性, 而新的研究中需要新的技术去探索
活细胞的生物功能。NMT是一个综合性较强的电
生理技术, 将成为迎接这一挑战的理想工具, 有望
将离子组学和分子组学从静态研究推进到动态研
究水平, 从而将二者与生物体生理生化变化建立
直接联系。国内外的科学家已经开始使用NMT开
展基因功能的研究。相信在不久的将来, 该技术
必将会得到更加广泛的使用, 从而推动植物生理
学及相关学科的快速发展。
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