全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (1): 89~94 89
收稿 2012-11-12　　修定 2012-12-23
资助 黑龙江省科技厅课题(GZ11B101)和校博士启动金课题(校
启2012DB-02)。
* 通讯作者(E-mail: agrigw@163.com; Tel: 0459-6819181)。
不同酸化条件对菜豆幼苗碳氮代谢酶系活性的影响
孙海燕1, 郭伟2,*
黑龙江八一农垦大学1测试中心, 2黑龙江省寒地作物种质改良与栽培重点实验室, 黑龙江大庆163319
摘要: 采用4个不同pH值(pH 7, 6, 5, 4)培养液模拟菜豆萌发和幼苗生长环境, 研究了酸化条件下菜豆种子萌发和幼苗生长
特性、幼苗根系和幼叶的抗氧化酶系活性以及叶片的碳氮代谢的主要酶系活性和产物水平, 以期明确菜豆的碳氮代谢对
酸化胁迫的响应机制。结果表明: 随着pH的降低, 菜豆发芽势和发芽率降低, 幼苗和根系干物质量减少; 谷氨酰胺合成酶活
性降低, 蔗糖磷酸合成酶活性增强, 从而增加了蔗糖、果糖和总可溶性糖含量; 根系的超氧阴离子自由基(O2¯· )和丙二醛
(MDA)含量降低, 叶片的O2¯·和MDA含量增加, 而叶片和根系的抗氧化酶系活性同向变化, 即超氧化物歧化酶和过氧化氢酶
活性增强, 过氧化物酶活性降低。酸化条件下, 菜豆的碳代谢加强, 氮代谢受到抑制; 叶片过氧化物酶活性的降低和O2¯·含量
的增加, 导致了叶片膜脂过氧化程度的加剧。
关键词: 菜豆; 酸化; 碳氮代谢; 抗氧化酶
Effects of Acid on Enzyme Activity of Carbon-Nitrogen Metabolic in Kidney
Bean Seedling
SUN Hai-Yan1, GUO Wei2,*
1Test Center, 2Key Laboratory of Cold Crop Germplasm Improvement and Cultivation of Heilongjiang Province, Heilongjiang
Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang 163319, China
Abstract: Four different pH (pH 7, 6, 5, 4) nutrient solutions were applied to simulate the environment of ger-
mination and growth for kidney bean (Phaseolus vulgari L.). Seed germination, seedling growth characteristics,
antioxidase enzyme activities of root and leaf and carbon-nitrogen metabolism enzyme activities and product
levels of leaf were studied with decreasing pH in order to explain the response mechanism of carbon-nitrogen
metabolism to acidification stress for kidney bean. The results showed that germinating potential and germina-
tion rate decreased, seedling and root dry weight reduced, and glutamine synthetase (GS) activity decreased and
sucrose phosphate synthase (SPS) activity increased which increased the contents of sucrose, fructose and total
soluble sugar, decreased the contents of superoxide anion free radical (O2¯· ) and malondialdehyde (MDA) of
root, and increased the contents of O2¯· and MDA of leaf with decreasing pH. However, the change trend of anti-
oxidase in root was the same as that in leaf, namely, the activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase
(CAT) increased, peroxidase (POD) activity decreased. Carbon metabolism was increased, however, nitrogen
metabolism was inhibited under acidification stress, increased O2¯· content and reduced POD activity of leaf re-
sulted in the increase of membrane lipid peroxidation.
Key words: Phaseolus vulgari; acidification; carbon-nitrogen metabolism; antioxidase
环境一直是人类最关心的全球性问题之一,
而环境酸化, 尤其是农田土壤酸化是全球环境变
化中的一个重要方面(Guo等2010)。影响土壤酸化
的人为因素主要包括由于大气环境污染导致酸沉
降的增加(童贯和等2005)和不当的农业措施等(魏
丹等2006)。土壤酸化导致土壤盐基流失及铝、锰
等毒性元素的释出和活化, 对植物根系造成伤害;
另外, 随着工业化的快速发展, 排入大气的SO2和
NO2等气体剧增, 致使酸雨沉降的强度不断增强
(朱敏和孙宗修1998), 对植物叶片造成直接伤害
(王维君等1992)。研究发现酸雨对大豆等植物的
影响, pH值水平是抑制植物生长的重要原因(Ve-
likova等2000)。而对水稻(刘拥海等2008)、荞麦
(李朝苏等2004)、大豆(刘鹏等2003)和马尾松(柳
若安和刘厚田1995)等的研究表明, 溶液中的H+对
植物的影响较小, 而pH值的变化导致土壤中铝形
植物生理学报90
态发生变化, 从而对植物生长造成伤害。众多研
究表明, pH值的减低导致了活性氧产生及清除失
去平衡, 造成活性氧对细胞的毒害作用, 引起膜脂
过氧化作用, 特别是酸化土壤对根系和酸雨对叶
片的直接危害(童贯和等2005; Scandalios 1993), 而
酸性环境下pH值的降低对植物代谢的间接影响研
究较少。豆科作物在种植过程中大量施用氮肥,
而氮素被植物吸收较少, 使氮素在土壤中残留、
转化及被吸收过程中造成了土壤酸化加重(刘颖
2010)。本文选用菜豆为材料, 研究不同pH值条件下,
菜豆的萌发特性和幼苗的根系与幼叶的活性氧毒
害情况, 进一步研究pH值对菜豆幼苗碳氮代谢的
间接影响。通过对幼苗根系和幼叶的抗氧化酶系
活性、碳氮代谢主要酶系活性及产物的分析, 明确
菜豆种植过程中pH值对其地上部分和地下部分生
长的损伤关系, 以及碳氮代谢平衡的间接影响。
材料与方法
1 试验材料
试验用菜豆(Phaseolus vulgaris L.)品种为‘垦
芸2号’ (黑龙江省农垦科研育种中心经济作物研究
所选育)。用HCl和NaOH调pH值为7、6、5、4的
溶液作发芽试验, 用HCl或NaOH调节相同pH值的
Hoagland营养液作水培溶液(HCl与NaOH分别为
一价强酸、强碱 , 缓冲作用可忽略不计 , 且对
Hoagland营养液中矿质元素影响极小)。
2 试验方法
选取籽粒饱满、大小一致的自然风干种子50
粒, 重复4次, 称重。用3%H2O2消毒8 min, 蒸馏水
冲洗3遍。在洁净烘干的发芽盒中放入4层滤纸(3
层底, 1层覆盖), 分别加入用去离子水配制而成的
各浓度的酸化溶液至滤纸吸足水分后称重。然后
摆入种子, 置于25 ℃的培养箱中进行黑暗培养, 注
意补充蒸发的水分。
待第一对真叶出现, 选取发芽整齐的菜豆幼
苗, 移植于带有圆孔的泡沫板上, 在2 000 mL烧杯
中用1/2Hoagland营养液室温下通气培养, 每个烧
杯定植10株, 每个处理重复4次, 每隔3 d更换一次
营养液, 待到幼苗2叶复叶期开始进行酸胁迫, 胁
迫7 d后取样, 剪取叶片, 然后液氮速冻, –80 ℃超低
温冰箱保存待测定, 根和叶烘干后的质量为干物
质量。
测定3 d内种子发芽个数的百分率为发芽势, 7
d内种子发芽个数的百分率为发芽率。
硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)和谷氨酰胺
合成酶(glutamine synthetase, GS)活性测定分别采
用NADH比色法和氯化铁显色比色法(中国科学院
上海植物生理研究所2004); 其他测定指标参照高
俊凤(2006)的方法。可溶性蛋白质含量测定采用
考马斯亮蓝法; 总可溶性糖含量测定采用蒽酮比
色法; 蔗糖和果糖含量测定采用间苯二酚比色法;
蔗糖合成酶(sucrose synthetase, SS)和蔗糖磷酸合
成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)活性测定采
用UDPG比色法, 超氧阴离子自由基(superoxide an-
ion free radical, O2¯· )的测定采用羟胺氧化法; 丙二
醛(malondialdehyde, MDA)含量测定采用硫代巴比
妥酸法, 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,
SOD)活性采用氮蓝四唑法; 过氧化氢酶(catalase,
CAT)活性采用紫外分光光度法; 过氧化物酶(per-
oxidase, POD)活性测定采用愈创木酚法; 多酚氧化
酶(polyphenol oxidase, PPO)活性测定采用比色
法。上述指标均采用平行测定方式。
利用Excel 2007进行数据处理和制图, SAS 8.2
进行统计分析, 新复极差法进行5%的差异显著性
检验。
实验结果
1 酸化对菜豆种子萌发和幼苗生长的影响
由图1可知, pH值5~7处理的发芽势和发芽率
无显著差异, 而pH 4时发芽势和发芽率均显著降
低; pH值对幼苗建成的影响显著, pH 6处理的整株
干物质量最高, 略高于pH 5和pH 7两个处理, 但未
达显著水平, 而pH 4处理的干物质量低于其他3个
处理, 且与pH 6处理差异显著; 通过根系干物质量
的比较发现, pH 4处理的根系干物质量略低于其他
处理, 但未达显著水平。由上可知, 在种子萌发阶
段, 培养环境在pH 4, 菜豆种子萌发速率显著降低,
根系形成对培养环境的pH值敏感程度不显著。
2 菜豆幼苗叶片氮代谢对酸化的响应
NR与GS作为氮代谢关键酶, 催化NO3
-向谷氨
酰胺的转化(宋建民等1998)。由图2可知, 酸化环
境下, 菜豆幼苗的NR活性有降低的趋势, 但未达显
著水平; 随着pH值的降低, GS活性显著降低; 当pH
在4~6的范围内, 可溶性蛋白质含量随着酸化程度
孙海燕等: 不同酸化条件对菜豆幼苗碳氮代谢酶系活性的影响 91
的增加含量显著增加, 但均低于对照(pH 7的处
理)。可见, 酸化环境下菜豆氮代谢活性的减低是
酶系活性受到抑制的结果, 尤其是氮代谢关键酶
GS活性受到明显抑制。
3 菜豆幼苗叶片碳代谢对酸化的响应
SS与SPS作为光合碳同化的限速酶, 调节蔗糖
的分解与合成(宋建民等1998)。由图3可知, 酸化
对SS活性影响较小, pH 4处理的SS活性略有降低,
但未达显著水平; pH值在4~7范围内SPS活性随pH
值降低逐渐增强, 因此, 随着环境pH值的降低, 可溶
性总糖含量逐渐增加(图4), 尤其是果糖含量显著增
加, 蔗糖含量也有增加趋势, 但未达显著水平。
图1 pH值对菜豆种子萌发和幼苗干物质量的影响
Fig.1 Effects of pH on seed germination and dry weight of kidney bean
同一测定项目不同处理间不同字母表示差异显著(P<0.05), 下图同此。
图2 pH值对菜豆幼苗叶片氮代谢的影响
Fig.2 Effects of pH on nitrogen metabolism of kidney bean seedling leaf
图3 pH值对菜豆幼苗叶片碳代谢关键酶活性的影响
Fig.3 Effects of pH on key enzyme activity for carbon metabolism of kidney bean seedling leaf
植物生理学报92
通过不同pH值条件下菜豆幼苗碳氮代谢间相
关分析(表1)可知, pH值的降低显著影响幼苗的碳
氮代谢, 通过降低GS活性而抑制氮代谢(pH值与
GS活性呈显著正相关), 并通过提高SPS活性而促
进了碳水化合物的合成(pH值与SPS活性、蔗糖含
量、果糖含量和总可溶性糖含量呈显著负相关)。
不同pH值条件下菜豆幼苗的碳氮代谢间具有
显著的相关性, 被视为蔗糖分解主要酶SS的活性
与氮代谢的限速酶NR间显著正相关, 可见, pH值
表1 不同pH值条件下菜豆幼苗叶片碳氮代谢间的相关分析
Table 1 The correlation analysis between carbon metabolism indices and nitrogenous metabolism indices
of kidney bean seedling leaf under different pH
项目 pH SPS活性 SS活性 总糖含量 蔗糖含量 果糖含量 GS活性 NR活性
pH 1.0000
SPS活性 –0.8631** 1.0000
SS活性 0.3099 –0.3276 1.0000
总糖含量 –0.9215** 0.6587 –0.3828 1.0000
蔗糖含量 –0.8080* 0.8328* 0.0682 0.5979 1.0000
果糖含量 –0.8207* 0.5663 –0.0040 0.7163* 0.7965* 1.0000
GS活性 0.9029** –0.6461 –0.0609 –0.8468** –0.7669* –0.8965** 1.0000
NR活性 0.3922 –0.1786 0.8097* –0.6270 0.1195 –0.0826 0.1654 1.0000
整株干质量 0.5546 –0.4886 –0.2553 –0.4205 –0.4973 0.6500 0.1330 –0.0636
根系干质量 0.2604 –0.4109 –0.1550 –0.4145 –0.2700 0.4154 0.0125 –0.2184
　　*: 显著相关(P<0.05); **: 极显著相关(P<0.01)。
图4 pH值对菜豆叶片糖含量的影响
Fig.4 Effects of pH on sugar content of kidney seedling leaf
的降低抑制了NR活性同时提高了SS活性, 加速了
蔗糖的分解; SPS活性与蔗糖含量呈显著正相关,
而蔗糖含量与果糖含量显著正相关, 两者的提高
促进了总可溶性糖的积累; 3种糖含量的提高与GS
活性显著负相关。
由上可知, 在pH值降低和蔗糖的分解双重作
用下, SPS活性提高, 加速了蔗糖的合成, 同时, 促
进了果糖合成和GS活性的降低。
4 酸化环境下菜豆幼苗的抗氧化特性
由图5可知, 酸化条件下菜豆叶片O2¯·含量逐渐
图5 不同pH值条件下菜豆幼苗超氧阴离子自由基和丙二醛含量
Fig.5 Contents of O2¯· and MDA of kidney bean seedling under different pH
孙海燕等: 不同酸化条件对菜豆幼苗碳氮代谢酶系活性的影响 93
律; 酸化降低了叶片和根系的POD活性, 根系中差
异显著, 且叶片中的活性低于根系一个量级; PPO
活性变化与POD活性变化相反, 叶片的PPO活性高
于根系一个量级, 随着pH值的降低, 根系PPO活性
呈单峰曲线, 峰值处理为pH 5。综上分析, 根系和叶
片降低酚类损伤的机制不同, 叶片主要依靠PPO直
接氧化代谢产生的多酚, 而根系是通过增强POD活
性间接减少酚类含量。
讨　　论
很多研究认为, 土壤酸化引起的土壤盐基流
失, 以及铝、锰等毒性元素的释出和活化是对植
物根系造成伤害的主要原因 (朱敏和孙宗修
1998)。本文研究发现, 根域环境pH值降低, 导致
根系损伤、脱落是菜豆根系伤害的直接原因。随
着pH值的降低, 根系的O2¯·积累, 诱导SOD与CAT的
活性, 加强对自由基的清除, 但酸化严重降低了
POD的活性, 造成H2O2积累, 超过根系自由基清除
增加, 而根系O2¯·含量降低, 植株总的O2¯·含量随着
pH值降低而逐渐增加; O2¯·含量的增加导致叶片膜
损伤加剧, 叶片MDA含量增加, 而根系MDA含量
降低。
由图6可知, 随着pH值的降低, 根系的SOD活
性先升高再减低, 叶片的SOD活性也存在类似规律,
pH 4处理的叶片的SOD活性显著高于根系; CAT活
性随环境pH值的降低表现出与SOD类似的变化规
系统阈值, 根系生长受阻, 部分根毛和次生根系脱
落, 根冠比降低, 因此, 初生根系和主要的次生根
系中O2¯·含量降低, 甚至低于叶片的O2¯·含量, 以维
系根系的生理功能。花生、小麦等多种作物的研
究发现, 在土壤环境pH值改变的情况下根系内微
环境的pH值也会随之同向变化(蒋爱凤2006; 陈翠
玲和茹振刚2000), 在较低的pH值条件下, 根系对
O2¯·的清除能力有限, 最终造成MDA含量增加, 根
系干物质积累减少(时丽冉等2008), 根冠比降低是
最直接的体现(张仲新等2008)。可见, 在土壤环境
图6 不同pH值对菜豆幼苗抗氧化酶活性的影响
Fig.6 Effects of pH on antioxidase activities of kidney bean seedling
植物生理学报94
不断酸化的情况下, 促进作物根系建成, 增强对根
系的保护, 从而缓解低pH值对根系的损伤, 是酸化
土壤地区作物增产稳产的重要途径。
研究发现, 酸性pH值提高了小麦根系NR活
力 , 但对叶片的NR活力无显著影响 (李清芳等
2003); 对黑豆芽苗的氮代谢研究也表明, pH值对
叶片的蛋白质含量无明显影响(饶毅萍等2009)。
本研究发现, NR/SPS活性比值由pH 7处理的21.70
降低到pH 4处理的11.04, pH值的降低促进了碳代
谢关键酶SPS活性的增强, 蔗糖等碳水化合物的合
成加强了对ATP的竞争, 通过反馈抑制降低了氨基
酸合成关键酶GS的活性(孙小茗等2006), 导致NR
活性降低, NO3
-还原减少。酸化条件下芸豆叶片的
氮代谢受到抑制, 而碳代谢过程加强。但对裂叶
牵牛和甘蔗的研究表明, 随着pH值的降低牵牛茎
中可溶性糖降低(赵则海等2009), 而甘蔗幼苗的总
可溶性糖和可溶性蛋白质含量均降低(刘光玲等
2011)。可能不同植物的代谢过程对酸化的响应机
制不同, 且植物的不同器官对酸性pH胁迫的敏感
程度存在一定差异, 这还有待于对酸化条件下不
同作物及相同作物不同基因型作对比研究。
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