全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (11): 1255~1260 1255
收稿 2013-08-05　　修定 2013-09-16
资助 国家自然科学基金(31070622和30872063)和中央高校基本
科研业务费专项(XDJK2009A004和XDJK2013A004)。
* 通讯作者(E-mail: limy@swu.edu.cn; Tel: 023-68250086)。
不同脱落力下蜡梅花梗CpEXP1基因的表达与扩张蛋白活性
李政, 马婧, 眭顺照, 李名扬*
西南大学园艺园林学院, 重庆市花卉工程技术研究中心, 南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆北碚400715
摘要: 为了研究不同脱落力下蜡梅花梗中CpEXP1基因的表达水平以及扩张蛋白活性, 采用real-time PCR技术检测不同脱
落力下蜡梅花梗组织CpEXP1基因的表达水平; 同时采用蛋白质体外重组法以及培养基添加法对花梗组织扩张蛋白活性进
行测定。结果表明: CpEXP1基因的表达与扩张蛋白活性变化趋势相同, 并在蜡梅花蕾脱落过程中具有阶段特异性。
CpEXP1基因在自然脱落组的表达量显著高于其他组(P<0.05)。此时扩张蛋白活性也最强。扩张蛋白对麻点百合愈伤组织
的分化无明显影响, 对增殖以及生根有明显促进作用。
关键词: 蜡梅; CpEXP1基因; 扩张蛋白; 脱落力
Expression of CpEXP1 Gene and Expansin Activity in Pedicel of Wintersweet
under Different Break Strength
LI Zheng, MA Jing, SUI Shun-Zhao, LI Ming-Yang*
Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing Engineering
Research Center for Floriculture, College of Horticulture and Landscape, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: To investigate the expression patterns of CpEXP1 gene and expansin activity extracted from pedicel
of wintersweet under different break strength, real-time PCR was employed to examine the expression levels of
CpEXP1 gene in pedicel. Meanwhile, protein recombinant in vitro and medium supplemented with expansin
were applied to analyze expansin activity in pedicel. Results showed that the expression of CpEXP1 gene in
pedicel and the expansin activity were stage specific and represented the same tendency. The gene expression
and protein activity were higher in natural abscission than any other stages (P<0.05). Medium supplemented
with expansin indicated that expansin extracted from pedicel of wintersweet had no effect on differentiation of
Drimiopsis maculata. However, it could promote proliferation and rooting significantly.
Key words: wintersweet; CpEXP1 gene; expansin; break strength
蜡梅(Chimonanthus praecox)是冬季开花的珍
贵木本花卉, 也是目前最具有市场开发潜力的木
本切花之一, 具有巨大的经济价值。但在蜡梅切
枝采后以及贮运过程中容易落蕾落花, 尤其在中
蕾期花蕾易脱落, 严重影响了蜡梅作为鲜切花开
发的进程(郭维明和贺文婷2004)。因此, 研究蜡梅
花蕾脱落原因, 对于减少蜡梅花蕾脱落, 提高蜡梅
切枝商品价值具有重要意义。前人研究表明, 蜡
梅为非乙烯敏感型切花, 其发育和衰老进程受ABA
及CTKs等内源激素平衡的调节, 并与切枝水分状
况及膜脂过氧化和抗氧化酶动态密切相关(王支槐
1995; 盛爱武等1999)。这些研究基本停留在生理
生化水平, 而且缺少针对落蕾问题的专门研究。
扩张蛋白自1992年首次分离得到以来, 相继
证明该蛋白与植物的酸生长关系密切(McQueen-
Mason等1992)。随后的研究相继发现扩张蛋白在
种子萌发、叶片生长、果实发育、根系萌发以及
植物开花过程中都发挥着重要作用(Huang等2000;
Tucker等2007; Zheng和Hrazdina 2010; Dotto等
2011; Monti等2013)。Belfield等(2005)在对接骨木
的研究中发现扩张蛋白基因SniExp2和SniExp4在
叶片离区转录水平明显增加; Sane等(2007)采用脱
落力分级的方法对月季的研究发现扩张蛋白基因
以及扩张蛋白对花瓣脱落有明显影响; Quiroz-
Castañeda等(2011)采用loosenin蛋白处理棉纤维,
发现处理过的棉纤维更易被水解酶水解。目前,
扩张蛋白是研究中发现的唯一能在体外诱导细胞
植物生理学报1256
壁扩展、细胞体积膨大的蛋白(McQueen-Mason等
1993; Cho和Kende 1997)。但这些研究也主要集中
在乙烯敏感型植物上。
2009年, 我们在蜡梅的研究中分离得到扩张
蛋白基因CpEXP1 (GenBank登录号DW-222744),
并发现该基因的表达与蜡梅花蕾的发育有密切关
系(Ma等2012)。但是关于该基因在花蕾脱落过程
中表达量与扩张蛋白活性的相关性如何尚未见报
道。本研究旨在明确在蜡梅花蕾脱落过程中扩张蛋
白基因CpEXP1的表达与相应蛋白活性的关系, 为
蜡梅切枝保鲜的研究奠定基础, 同时丰富扩张蛋
白在乙烯非敏感型植物上的研究内容。
材料与方法
1 植物材料
选用栽植于重庆市西南大学园艺园林学院农
场6年生素心蜡梅(Chimonanthus praecox var. con-
color Makino)成年植株为植物材料。
2 主要仪器与试剂
本研究使用的查狄伦数显测力计型号为美国
chatillon公司生产的DFS-010型, Bio-Rad CFX96型
荧光定量PCR仪为美国BIO-RAD公司生产, DNase
I、RNAprep pure Kit、PrimeScriptTM RT Reagent
Kit、Quant qRT-PCR (SYBR Green) Kit、琼脂
糖、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、4-羟乙基
哌嗪乙磺酸、二硫苏糖醇、琼脂粉、硫酸铵、
交联葡聚糖G25、Triton X100等均购自天根生物
公司。
3 方法与步骤
3.1 总RNA的提取与反转录
剪取当年生短于20 cm的中等枝以及短枝, 参
考Sane等(2007)的方法, 用查狄伦数显测力计测定
中蕾期花蕾(蕾径5.50~8.50 mm)的脱落力。并根
据脱落力的大小将花蕾分为I、II、III、IV 4组, 依
次为I: 0 N<脱落力<1.4 N; II: 1.4 N≤脱落力<2.8
N; III: 2.8 N≤脱落力<4.2 N; IV: 脱落力≥4.2 N。
每组保证所收集的花蕾数量在30个以上。同时以
刚刚自然脱落的中蕾期花蕾作为对照(CK, 脱落力
为0 N)。提取花梗末端2 mm左右组织的总RNA,
提取方法根据天根RNA提取试剂盒说明书操作步
骤进行。提取的RNA样品用DNase I处理以除去残
留DNA。RNA质量用1.0%琼脂糖电泳以及分光光
度计法进行检测。采用PrimeScriptTM RT Reagent
Kit并按照使用说明对提取的总RNA进行反转录。
反应体系为25 µL: 2 µL总RNA, 1 µL随机引物, 5
µL dNTPs (10 mmol·L-1), 0.5 µL RNasin, 1 µL反转
录酶, 5 µL 5×RT Buffer, 10.5 µL ddH2O。反应程序
为: 先加入RNA原液、dNTP和随机引物, 70 ℃变
性5 min后立即置于冰上冷却, 再加其余试剂, 混匀
后于37 ℃温育60 min, 95 ℃灭活5 min。反转录获
得的cDNA第一链于–20 ℃保存备用。
3.2 实时荧光定量PCR
以看家基因Actin-b和β-Tubulin为内参基因,
根据本实验室前期获得的CpEXP1基因编码区序
列以及GenBank数据库中Actin-b和β-Tubulin基因
编码序列, 采用Primer Premier 5.0软件设计定量引
物q-CpEXP2F和q-CpEXP2R (表1)。实时荧光定量
PCR反应体系为10 µL: 花梗组织RT产物0.5 µL,
Ssofast EvaGreen Supermix 5 µL, 上下游引物各0.5
µL和3.5 µL ddH2O。反应程序为: 95 ℃预变性30 s;
95 ℃变性5 s, 58 ℃退火5 s, 72 ℃延伸5 min, 读板,
共40个循环; 然后再72 ℃延伸5 min; 熔解曲线分
析: 60~95 ℃, 每隔0.2 ℃读板一次, 温度恒定1 s后
读板; 最后72 ℃延伸5 min。每个样品重复3次。
表1 引物信息
Table1 Information of primers
目的基因 序列号 引物名称 引物序列
CpEXP1 DW222744 q-CpEXP2F GCAAGAAACAAGGAGGAGTAAG
q-CpEXP2R CCATCCATCCAGTCTTTGAACC
Actin-b NM_007393 ActinF AGGCTAAGATTCAAGACAAGG
ActinR TTGGTCGCAGCTGATTGCTGTG
β-Tubulin EF608942 TubulinF GTGCATCTCTATCCACATCG
TubulinR CAAGCTTCCTTATGCGATCC
李政等: 不同脱落力下蜡梅花梗CpEXP1基因的表达与扩张蛋白活性 1257
同时, 以未添加模版作为阴性对照。定量结果采
用2-ΔΔCT法(Livak和Schmittgen 2001)利用Bio-Rad
CFX Manager Software Version 1.6软件进行分析。
3.3 扩张蛋白活性测定
采用上述3.1节中的方法采集不同脱落力的中
蕾期花蕾, 每组保证所收集的花蕾数量在50个以
上。采用McQueen-Mason (1992)、Belfield等(2005)
的方法分别提取各组花梗末端2 mm左右组织的扩
张蛋白, 同时提取刚刚自然脱落花蕾花梗扩张蛋
白作为对照(CK)。
采用体外重组法用提取的蛋白处理死亡的大
豆下胚轴, 通过测量下胚轴的伸展情况来测定扩
张蛋白活性(童斌2003), 重复3次。扩张蛋白活性
计算按下公式进行: 扩张蛋白活性(%·h-1)=[加入蛋
白提取液前后伸展效率(µm·h-1)之差/组织切段上
记号间的起始长度(µm)]×100。
3.4 培养基添加实验
以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1为基
本培养基, 将从自然脱落花蕾花梗中提取的扩张
蛋白添加到不同阶段麻点百合(Drimiopsis maculata
Lindl. & Paxton)组培苗培养基中, 添加浓度为0、
1.0、2.0、3.0 g·L-1, 培养30 d后, 对麻点百合的分
化、增殖以及生根情况进行统计, 比较该蛋白对
组培苗各阶段的影响。
实验结果
1 总RNA质量检测
采用1.0%琼脂糖电泳对总RNA质量进行检测
(图1)。结果显示5组材料提取的总RNA条带清晰
明亮, 且重复性好。OD260/OD280比值均在1.85左右,
表明RNA完整性和纯度较好, 能够用于后续定量
分析。
2 不同脱落力下花梗CpEXP1基因的表达水平
为了研究CpEXP1基因在蜡梅花蕾脱落中的
作用, 采用2-ΔΔCT法对不同脱落力下的中蕾期花梗进
行了定量分析。作为内参基因的Actin-b和β-Tubulin
的变异系数均为1.3880, 平均M值为0.4568。两内
参基因M值之差为0.0787, 能够作为内参使用。对
照组(CK)表达量为15.13455, 分别为I、II、III、IV
组表达量的4.47、15.13、9.04和6.28倍(图2), 显著
高于其他4组(P<0.05), 而其他4组间对比无显著差
异(P<0.05)。表明在蜡梅中蕾期花蕾脱落过程中,
随着脱落力的逐渐下降CpEXP1基因的表达开始
处于相对较低的水平; 在临近脱落时表达量迅速
增加。
3 不同脱落力下扩张蛋白活性分析
采用蛋白质体外重组技术对不同脱落力下蜡
梅花梗扩张蛋白的活性进行了比较。自然脱落的
花梗中扩张蛋白活性最高(11.4%·h-1), 在其他组中
扩张蛋白活性普遍偏低(图3)。差异显著性分析表
明: 自然脱落组扩张蛋白活性与其他4组均有极显
著差异, I组与IV、III、II三组有极显著差异, 而
IV、III、II三组间无显著差异。表明扩张蛋白活
性的变化趋势与CpEXP1基因表达变化趋势相同,
即随着脱落力的下降, 扩张蛋白的活性开始较低;
在临近脱落时活性迅速增加。表明在蜡梅花蕾脱
落过程中, 该蛋白主要在临近脱落期起作用。
图1 蜡梅花梗总RNA电泳图谱
Fig.1 Agarose gel photograph of total RNA extracted from
pedicel of wintersweet
M: Marker; CK: 自然脱落(脱落力0 N); I: 0 N<脱落力<1.4 N;
II: 1.4 N≤脱落力<2.8 N; III: 2.8 N≤脱落力<4.2 N; IV: 脱落力≥
4.2 N (图2、3同)。
图2 不同脱落力下蜡梅花梗中CpEXP1基因的表达水平
Fig.2 Expression level of CpEXP1 gene in pedicel of
wintersweet under different break strength
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
植物生理学报1258
4 培养基添加实验结果
采用培养基添加法比较扩张蛋白对麻点百合
组培苗各阶段的影响(表2)。结果表明: 不同浓度
的扩张蛋白对麻点百合愈伤组织的分化无明显影
响(图4); 对增殖有一定促进作用, 并且随着添加浓
度的增加, 麻点百合增殖率上升。另外, 添加扩张
蛋白后增殖的后代叶色加深, 叶柄长度和叶面积
也显著增加(图5); 在生根培养中, 对照组和添加扩
张蛋白组均能生根, 且根长度差异不大。但是经
扩张蛋白处理后的麻点百合发根数量增加, 粗度
也明显增加(图6)。
表2 扩张蛋白对麻点百合分化、增殖、生根的影响
Table 2 Influence of expansin on differentiation, proliferation
and rooting of D. maculata
扩张蛋白浓度/g·L-1
对麻点百合生长各阶段的影响
分化 增殖 生根
0 – + +
1.0 – ++ +
2.0 – ++ ++
3.0 – +++ ++
　　–: 无作用; +: 有作用; ++: 有明显作用; +++: 有极明显作用。
图3 不同脱落力下蜡梅花梗中扩张蛋白的活性
Fig.3 Expansin activity extracted from pedicel of wintersweet
under different break strength
不同大写字母表示极差异显著(P<0.01), 不同小写字母表示
差异显著(P<0.05)
图4 不同浓度扩张蛋白对麻点百合分化的影响
Fig.4 Influence of different concentration of expansin on differentiation of D. maculata
扩张蛋白浓度: A, 0 g·L-1; B, 1.0 g·L-1; C, 2.0 g·L-1; D, 3.0 g·L-1 (图5、6同)。
图5 不同浓度扩张蛋白对麻点百合增殖的影响
Fig.5 Influence of different concentration of expansin on proliferation of D. maculata
李政等: 不同脱落力下蜡梅花梗CpEXP1基因的表达与扩张蛋白活性 1259
讨　　论
1 蜡梅中蕾期花蕾脱落过程中脱落力、CpEXP1
基因表达以及扩张蛋白活性的关系
花蕾脱落的难易与花径呈反比(van Doorn
2001)。Sane等(2007)在月季花瓣脱落的研究中采
用最外1~2轮花瓣展开的花蕾为试材, 减小了因花
径造成的干扰。在实验中严格选取蕾径5.50~8.50
mm的素馨蜡梅中蕾期花蕾可以减少因蕾径所造
成的影响。以脱落力的大小为依据进行蜡梅中蕾
期花蕾的区分可以直观的反映该时期花蕾脱落的
难易程度。
扩张蛋白基因在高度特定的位点和高度特定
的细胞类型中表达, 其表达受激素和多种环境因
子的影响, 并在时间、空间上受到严格的调控(Wu
等1996; Rose等1997; Brummell等1999; Caderas等
2000; Vriezen等2000; Lee等2003)。这在前期蜡梅
CpEXP1基因的研究中也得到证实(Ma等2012)。
本研究分析了不同脱落力下中蕾期花梗中CpEXP1
基因的表达, 结果发现当脱落力≥1.4 N时, 该基因
的表达处于较低水平; 在临近脱落时表达量迅速
增加。表明在蜡梅中蕾期花蕾脱落过程中CpEXP1
基因主要在后期起作用。而Sane等(2007)在研究
中发现在月季花瓣脱落的整个过程中脱落力与扩
张蛋白基因的表达始终呈负相关。这可能与月季
为乙烯敏感型切花有关。
扩张蛋白是目前研究中发现的唯一能在体外
诱导细胞壁扩展、细胞体积膨大的蛋白(McQueen-
Mason等1993; Keller和Cosgrove 1995; Cho和Kende
1997)。通过体外重组对扩张蛋白活性测定, 发现
不同脱落力下提取的扩张蛋白均有活性, 但差异
明显。当脱落力≥1.4 N时, 扩张蛋白活性处于较
低水平; 在临近脱落时活性显著增强。这与CpEXP1
基因表达量呈正相关。
2 扩张蛋白对麻点百合组培苗生长的影响
尽管不同物种间的扩张蛋白氨基酸序列相似
性存在差异, 但仍是一类具有高度保守结构的蛋
白质, 其功能也具有相似性(Brummell等1999; Cos-
grove 2000)。童斌(2003)的研究发现从柿果实提
取的扩张蛋白能够促进百合组培苗的增殖与生
根。为保证扩张蛋白活性最强, 本实验将从蜡梅
自然脱落的中蕾期花梗中提取的扩张蛋白添加到
麻点百合不同阶段的培养基中。发现扩张蛋白对
麻点百合愈伤组织的分化无明显影响; 对增殖以
及生根有一定促进作用, 并且随着添加浓度的增加,
增殖率以及生根率均明显提高, 长势也显著增强。
器官脱落是一个复杂的过程, 不同的植物种
类、组织器官以及不同发育时期的影响因子各
异。本研究只是针对蜡梅这一非乙烯敏感型切花
在CpEXP1基因表达以及扩张蛋白活性变化方面
进行了探索, 客观评价还需要结合植物内部生理
生化活动、与脱落相关基因的表达以及生长状况
等因素进一步探讨。
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Fig.6 Influence of different concentration of expansin on
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