全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (5): 785~791　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0033 785
收稿 2015-01-14　　修定 2015-04-20
资助 国家自然科学基金(31201144和31271746)、教育部高等学
校博士学科点专项科研基金新教师类(20122223120003)、
吉林省发改委项目(JF2012C002-04)和吉林农业大学国家
级大学生创新创业训练计划项目(201410193036)
* 通讯作者(E-mail: hyli99@163.com; Tel: 0431-84533427)。
大豆磷脂酶C基因GmPLC12的表达分析与原核表达
王法微1, 包桥桥2, 邓宇2, 董金晔2, 崔志彤2, 王慧莹2, 修华谦2, 李海燕1,2,*
吉林农业大学1生物反应器与药物开发教育部工程研究中心; 2生命科学学院, 长春130118
摘要: 磷脂酶C (phospholipase C, PLC)是一类能够水解磷脂生成肌醇三磷酸与二酰甘油的酶, 在植物非生物胁迫中起着重
要的调控作用。本研究首次从大豆中克隆了大豆磷脂酶C基因GmPLC12, 其全长cDNA序列1 671 bp, 编码一个由556个氨
基酸组成的蛋白。系统发育树分析发现, GmPLC12与菜豆PvPLC1、豇豆VuPLC同源性最近。利用实时定量PCR分析发现,
GmPLC12在盐、碱以及盐碱胁迫下表达量升高极为显著, 尤其是盐碱胁迫。将GmPLC12基因连接到原核表达载体中并利
用IPTG诱导表达, 产生一条约为70 kDa的条带, 与预期结果一致。
关键词: 磷脂酶C; 生物信息学分析; 基因表达; 原核表达
Expression Analysis and Prokaryotic Expression of GmPLC12 in Glycine max
WANG Fa-Wei1, BAO Qiao-Qiao2, DENG Yu2, DONG Jin-Ye2, CUI Zhi-Tong2, WANG Hui-Ying2, XIU Hua-Qian2, LI Hai-Yan1,2,*
1Ministry of Education Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development; 2College of Life Sciences,
Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract: Phospholipase C (PLC) is a class of enzymes that cleave phospholipids into diacyl glycerol (DAG)
and inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3). It plays an important role in plant abiotic stresses. In this study, we firstly
cloned the GmPLC12 gene from soybean (Glycine max). The full-length of GmPLC12 is 1 671 bp and encoding
556 amino acids. Phylogenetic analysis indicated that GmPLC12 shared highest homology with PvPLC1 and
VuPLC. Real-time quantitative analysis showed that the expression levels of GmPLC12 were induced by salt,
alkali and salt-alkaline treatments, especially salt-alkaline stress. Subsequently, GmPLC12 was ligated into pE-
T28a vector and transferred into Escherichia coli strain BL21. The recombinant protein was induced by IPTG
and showed an about 70 kDa bands, which was consistent with prediction.
Key words: phospholipase C; bioinformatics analysis; gene expression; prokaryotic expression
磷脂酶C (phospholipase C, PLC)是一种能够
水解磷脂的酶类, 它可以水解磷脂酰肌醇(4,5)-二
磷酸生成两个重要的第二信使分子——二酰甘油
(diacylglycerol, DAG)与肌醇三磷酸(inositol tris-
phosphate, IP3) (Rupwate和Rajasekharan 2012)。
DAG可以被二酰甘油激酶磷酸化为磷脂酸(phos-
phatidic acid, PA), PA能够与一些蛋白激酶、脂激
酶和NADPH氧化酶等蛋白相互作用, 从而调节植
物逆境胁迫、细胞生长离子运输以及细胞死亡等
生理过程(Wang等2006)。而IP3在植物中可以迅速
转化为IP6, 进而调节Ca
2+信号传导网络(Munnik和
Testerink 2009; Lemitiri-Chlieh等2003)。Shi等
(1995)首先从大豆质膜中分离出一种蛋白, 通过
cDNA文库筛选并测序后证实为磷脂酶C, 酶活性
分析发现它对不同磷脂酰肌醇均具有水解活性。
近年来已经从拟南芥(Peters等2010; Wimalasekera
等2010)、水稻(Singh等2013)、番茄(Vossen等
2010)等植物中克隆并鉴定了它们的功能, 研究发
现, 磷脂酶C在植物受到盐胁迫时能够通过调节气
孔状态使植物减少因渗透胁迫而受到的伤害(Pe-
ters等2010)。植物受到病原菌侵染时, 磷脂酶C能
够激活一系列病程相关蛋白的表达, 从而抵抗胁
迫所带来的影响(Vossen等2010)。这些研究结果
均说明磷脂酶C对植物逆境, 尤其是盐胁迫, 具有
重要的调控作用。
大豆是一种含有丰富蛋白质与脂肪酸的作物,
以大豆为原料可以加工为中国的传统食物豆腐。
同时, 大豆也可以榨油, 大豆油已经成为我国食用
植物生理学报786
最多的植物油。然而, 随着近些年来气温逐渐升
高等因素, 加剧土壤的干旱以及盐碱化, 这些非生
物胁迫严重影响大豆的产量以及质量(高中超等
2007; 郝兴宇等2010)。选育抗逆性强的大豆新种
质已经成为大豆育种的一个重要目标。本文克隆
了一个大豆磷脂酶C基因, 分析其在不同逆境胁迫
下的表达模式, 并对其进行原核表达研究, 为该基
因深入研究奠定基础。
材料与方法
1 材料
1.1 植物材料
大豆(Glycine max L.)品种‘威廉姆斯82’ (‘Wil-
liams 82’)来源于生物反应器与药物开发教育部工
程研究中心, 并种植于吉林农业大学试验田中。
1.2 菌株与试剂
大肠杆菌DH5α菌株、BL21菌株和表达载体
pET28a由本实验室保存; 克隆载体pGEM T-easy载
体购自于Promega公司; 植物总RNA提取试剂盒
(RP3301)购自于北京百泰克生物技术有限公司; 限
制性内切酶、反转录试剂盒(RR047A)、Extaq、
DNA Marker、荧光定量PCR试剂盒(RR420A)均购
自于TaKaRa公司; 质粒提取试剂盒与凝胶回收试
剂盒购自于爱思进生物技术有限公司; 其他生化
试剂均为国产或进口分析纯试剂。
2 材料的处理
将大豆种子播种于装有Hoagland液体培养基
的水培桶中, 在12 h白天(26 ℃)与12 h黑暗(22 ℃)
的培养室中培养, 光照强度150 μmol·m-2·s-1。当大
豆生长至12 d时, 选取生长状态一致的大豆进行以
下不同胁迫处理: ABA处理(100 μmol·L-1 ABA)、
干旱处理(8% PEG8000)、盐处理(120 mmol·L-1
NaCl)、碱处理(50 mmol·L-1 NaHCO3)和盐碱处理
(70 mmol·L-1 NaCl+50 mmol·L-1 NaHCO3)。处理时
间分别为0、1、3、6、9与12 h, 处理结束后, 迅速
将根及叶片包于锡箔纸中, 液氮速冻后保存于–80
℃冰箱备用。另外, 在大豆生长过程中分别取生
长20 d的茎、花、未成熟种子(花后30 d)以及成熟
种子, 液氮速冻后保存于–80 ℃冰箱备用。
3 总RNA的提取及cDNA的合成
将冻存的大豆材料取出后迅速置于液氮中,
依次取出后在液氮中充分研磨。研磨充分后收集
样品粉末, 根据植物总RNA提取试剂盒说明书中
的方法提取总RNA。总RNA经琼脂糖凝胶电泳检
测后反转录为cDNA, 反转录步骤与反转录体系见
TaKaRa反转录试剂盒说明书, 每个反转录体系中
所含总RNA质量为1.5 μg。
4 GmPLC12基因的克隆与表达载体构建
根据G m P L C 1 2基因 ( G e n B a n k登录号
XM_003538420.2)的序列设计1对含有Xba I酶切位
点的特异引物(上游引物: 5 gCTCTAgAATggC-
C A g T C A C A A C TA C A A A 3 ; 下游引物 : 5
gCTCTAgATCATCTAAACTgAAACCgCA 3), 以
cDNA为模板进行PCR扩增目的基因。PCR扩增体
系为: 18.3 μL ddH2O, 上游引物与下游引物、模
板、dNTP各1 μL, PCR缓冲液2.5 μL, Extaq 0.2
μL。PCR反应程序为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变
性50 s, 55 ℃退火50 s, 72 ℃延伸60 s, 反应进行32
个循环后72 ℃后延伸5 min。通过琼脂糖凝胶电
泳检测PCR产物, 将阳性条带回收并克隆入pGEM
T-easy载体中, 将阳性质粒送交北京金唯智生物技
术有限公司进行测序。
以阳性克隆载体质粒为模板, 利用原核表达
引物(上游引物: 5 CGGGATCCATggCCAgTCAC-
AACTACA 3; 下游引物: 5 CCCTCGAGTCTAA A-
C TgAAACCgCA 3)进行PCR扩增(反应体系同
上)。将PCR产物与pET28a空载体分别进行BamHI
与XhoI双酶切, 酶切产物经琼脂糖电泳后分别回收
目的基因与载体大片段, 连接后转化至大场杆菌
BL21中, 验证阳性克隆后进行蛋白诱导表达实验。
5 GmPLC12的生物信息学分析
利用Primer Premier 5.0软件将测序获得的
GmPLC12基因编码区序列翻译为氨基酸序列, 在
NCBI (www.nlm.nih.gov)中进行BLAST分析并查
找与GmPLC12相似性较高的其它植物PLC。利用
DNAMAN软件对选取的与GmPLC12相似性相高
的序列进行系统发育树分析。同时, 对GmPLC12
与PvPLC1、VuPLC进行相似性分析。另外, 将
GmPLC12的氨基酸序列利用SWISS模型(http://
swissmodel.expasy.org)分析GmPLC12蛋白的三维
结构。
6 实时荧光定量PCR
利用实时定量PCR技术分析GmPLC12基因在
不同组织以及ABA、干旱、盐、碱和盐碱胁迫下
王法微等: 大豆磷脂酶C基因GmPLC12的表达分析与原核表达 787
的表达模式。G m P L C 1 2基因上游引物为 : 5
GAGCTCAGATGGTTGCGTTCA 3, GmPLC12基
因下游引物为: 5 TCAGGCTTTTTCACATAAC-
CGC 3。并以Act11基因(上游引物: 5 GCGGGAA-
ATTGTAAGGGATGT 3, 下游引物: 5 TCGC-
CAATAGTGATGACCTG 3)为内参基因进行相对
表达量分析。采用TaKaRa公司的实时荧光定量
PCR试剂盒进行PCR反应, 反应体系(20 μL)含有10
μL Premix酶, 7 μL ddH2O, 上、下游与模板各1
μL。定量PCR反应程序为94 ℃预变性30 s; 94 ℃
变性5 s, 60 ℃退火与延伸20 s, 反应进行40个循环
后计算溶解曲线。定量PCR结束后, 根据内参基因
与目的基因的Ct值计算GmPLC12基因的相对表达
量。GmPLC12基因在不同组织的相对表达量按照
2-ΔCt法计算, GmPLC12基因在不同逆境胁迫下的表
达量按照2-ΔΔCt法计算。每次实验每个样品做3个
重复, 并进行3次生物重复实验。
7 GmPLC12基因的原核表达
挑取大肠杆菌BL21阳性单菌落, 接种于2 mL
LB液体培养基中37 ℃培养至OD600值为0.8~1.0, 再
将此菌扩大培养至200 mL LB液体培养基中继续
培养。当菌液生长至OD600值为0.8左右时, 分别加
入0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mmol·L-1 IPTG, 在
28 ℃诱导表达6 h后离心收集菌体, 超声破碎后离
心并取上清液, 加入蛋白上样缓冲液后沸水浴煮10
min, 用于SDS-PAGE和Western blot检测。
8 SDS-PAGE及Western blot
将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE, 每个点
样孔上样20 μL样品蛋白, 在5%浓缩胶与12%分离
胶下进行电泳。浓缩胶区域电压为60 V, 分离胶区
域电压为140 V。待电泳结束后利用考马斯亮蓝染
色, 之后利用脱色液进行脱色以检测蛋白的表达
情况。
测定各个蛋白的浓度, 并按照每个点样孔20
μg标准再次进行SDS-PAGE, 电泳结束后进行转
膜, 将SDS-PAGE胶上的蛋白转移至PVDF膜上。
利用封闭液(PBST+5%脱脂奶粉) 4 ℃封闭2 h, 随
后与鼠抗6×His单克隆抗体室温孵育2 h, PBST洗
膜3次后加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗, 室温
孵育2 h。孵育结束后, 利用PBST洗膜3次, 加入3
mL显色液进行显色, 显色结束后用PBST洗膜一次
后拍照记录。
实验结果
1 GmPLC12基因的克隆
以反转录的cDNA为模板, PCR扩增GmPLC12
基因后获得1条长度为1 671 bp的条带(图1-A)。将
该片段利用凝胶回收试剂盒回收后与p G E M
T-easy载体在T4 DNA连接酶的作用下连接过夜,
并将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。提取阳
性菌液的重组质粒DNA, 利用XbaI进行酶切鉴
定。结果显示, 泳道3~4酶切得到1条大小为1 671
bp的片段, 初步证实克隆片段正确(图1-B)。将重
组质粒送交北京金唯智生物技术有限公司进行测
序, 测序结果与预期基因序列一致, 证实成功克隆
了大豆GmPLC12基因。
2 GmPLC12蛋白的生物信息学分析
将测序得到的基因序列利用软件进行翻译后
得到其编码的蛋白质序列, 该蛋白含有556个氨基
酸 , 预计分子量大小为62 987.4 Da, 等电点为
图1 大豆GmPLC12基因的克隆与鉴定
Fig.1 Cloning and identification of the GmPLC12 gene
A: 大豆GmPLC12基因的克隆; 1~2: PCR扩增结果。B: 重组质粒酶切鉴定; 1~4: 酶切结果。M: DNA marker DL2000。
植物生理学报788
5.78。利用SWISS分析GmPLC12的三维结构发现,
该蛋白主要包含3个结构域, 分别为EF指型结构
域、X-Y催化结构域与C2结构域(图2)。其中, EF
指型结构域由7个α螺旋与6个β折叠构成; X-Y结构
域由9个α螺旋与11个β折叠构成, C2结构域则由1
个α螺旋与12个β折叠构成(图2)。
3 GmPLC12蛋白的系统发育树分析
利用NCBI中的BLAST工具搜索与GmPLC12
相似性较高的蛋白, 将这些蛋白与GmPLC12进行
系统发育树分析。分析结果发现GmPLC12与菜豆
PvPLC1亲缘关系最近, 其次为豇豆VuPLC、绿豆
VrPLC、鹰嘴豆CaPLC与苜蓿MtPLC (图3)。在这
些PLC中, GmPLC12与PvPLC1的相似性为87.05%,
与VuPLC的相似性也达到84.89%, 大豆GmPLC12
与豆科其他PLC的相似性均高于其他作物的PLC。
通过系统发育树分析以及同源性分析表明, Gm-
PLC12属于植物磷脂酶C, 其在分子进化中十分保守,
并且其分子进化与不同物种间的生物进化相一致。
4 GmPLC12基因的表达分析
结果(图4)发现, GmPLC12在各个组织中均有
表达, 茎中的表达量最高, 而在未成熟种子中的表
达量最低, 在叶片、花及根中的表达量约为茎中
图2 大豆GmPLC12的3D结构图
Fig.2 3D structure of GmPLC12
图3 几种植物PLC蛋白的进化分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of PLC from several plants
ZmPLC: 玉米(Zea mays), NP_001108119; OsPLC2: 水稻(Oryza sativa), NM_001061066; OsPLC3: 水稻, NM_001067270; AtPLC1: 拟南
芥(Arabidopsis thaliana), NP_568881; AtPLC2: 拟南芥, AEE74640; AtPLC3: 拟南芥, AEE86943; AtPLC4: 拟南芥, AED97086; PvPLC1: 菜豆
(Phaseolus vulgaris), XP_007141767; PvPLC2: 菜豆, XP_007163545; CaPLC: 鹰嘴豆(Cicer arietinum), XP_004490993; MtPLC: 苜蓿(Medica-
go truncatula), XP_003616633; GmPLC12: 大豆(Glycine max), XM_003538420.2; VrPLC: 绿豆(Vigna radiata), AAQ95731; VuPLC: 豇豆(Vigna
unguiculata), AAB41107; CsPLC: 黄瓜(Cucumis sativus), XP_004490993; MnPLC: 川桑(Morus notabilis), EXC09417; PtPLC: 杨树(Populus
trichocarpa), XP_002316213。
王法微等: 大豆磷脂酶C基因GmPLC12的表达分析与原核表达 789
的一半。其次, 分析了大豆叶片及根中GmPLC12
基因在盐、碱、盐碱、干旱以及ABA处理后的表
达量的变化。结果(图5)表明, 叶片中GmPLC12在
ABA处理后表达量没有发生明显变化; 在干旱处
理下, 表达量略微升高, 在6 h达到表达量的峰值,
为对照的1.88倍; 在碱处理下, GmPLC12表达量迅
速升高, 在3 h达到对照水平的2.36倍, 之后一直维
持这个表达水平到12 h; 在盐胁迫初期GmPLC12
表达量略微升高, 在12 h时升高到对照的2.09倍;
当大豆在盐碱胁迫时, GmPLC12基因的表达量随
着处理时间出现先升高后降低的趋势, 并且在9 h
出现表达量的最大值, 为对照的3.04倍(图5-A)。
而在根中GmPLC12在ABA处理后表达量迅速升
高, 在3 h后即达到对照的2.53倍; 在盐处理1 h后
GmPLC12的表达量即达到峰值, 然后表达量逐渐
降低; 在盐碱、碱及干旱处理下GmPLC12的表达
量略微升高(图5-B)。
5 GmPLC12在大肠杆菌中的表达
经考马斯亮蓝染色及脱色后, 发现空载体条
带与各个不同浓度IPTG诱导后的蛋白条带几乎一
致, 推测的目的蛋白条带处也均有一条明显的条
带(图6-A)。为了进一步确定目的蛋白是否诱导表
达成功, 我们对蛋白进行定量上样并进行Western
图4 大豆GmPLC12基因在不同组织的表达分析
Fig.4 Expression analysis of GmPLC12 in different organs
图5 不同逆境胁迫下大豆的叶片及根中GmPLC12基因的表达分析
Fig.5 Expression analysis of GmPLC12 in leaves and roots under various stresses
植物生理学报790
blot检测。结果发现空载体处没有任何条带, 未诱
导的样品中在70 kDa处有一条较弱的条带(图
6-B)。而经IPTG诱导后, 目的蛋白的表达量明显
增加。其中, 0.1、0.3与0.5 mmol·L-1 IPTG诱导的
目的蛋白表达量最高, 且没有任何杂带(图6-B)。
讨　　论
迄今为止, Shi等(1995)首次从大豆中克隆了1
个磷脂酶C基因(GmPLC1), 但并未对该基因进行
更进一步的研究。Chou等(2004)利用磷脂酶C的
特异性抑制剂U-73122研究了磷脂酶C酶活性被抑
制, 发现PLC在病原菌侵染时对防御基因的表达起
负调控的作用。许多学者将U-73122与新霉素作
为磷脂酶C的专一性抑制剂开展反向研究(Ghars等
2012; Andreeva等2010; Komis等2008), 但近些年来
Klein等(2011)提出了对PLC专一性抑制剂的质疑,
他发现不同剂量的U-73122在一定的时间内能够
激活PLC的活性, 并且活性是对照组的8倍。所以,
关于磷脂酶C的研究还应该从基因本身入手。为
此, 本研究克隆了大豆GmPLC12基因, 通过BLAST
及系统发育树分析证实该基因属于植物磷脂酶C
基因。GmPLC12与Shi等(1995)克隆得到的Gm-
PLC1基因序列相似性为57.9%, 但在X-Y催化区相
似性相对较高。Mikami (2014)表明X-Y催化区是
决定磷脂酶C水解底物的关键区域，该区域的保
守性对磷脂酶C的活性至关重要 , 这说明Gm-
PLC12应该具有磷脂酶活性。Kopka等(1998)报道
马铃薯StPLC中共有14个α螺旋和19个β折叠, 而
GmPLC12含有17个α螺旋和29个β折叠, 这可能是
PLC在进化过程中发生的改变所致。在磷脂酶C
的原核表达中, 王志刚等(2012)与刘菲菲等(2013)
分别选取0.8及1.0 mmol·L-1 IPTG进行诱导表达。
而本研究结果显示, 0.1、0.3与0.5 mmol·L-1 IPTG
诱导条件下GmPLC12的表达量较好(图6)。
磷脂酶C基因在进化的过程中不仅在蛋白结
构上发生变化, 其表达模式在不同植物以及同种
植物不同基因之间也存在着差异。大豆叶片中
GmPLC12的表达量对ABA处理不敏感, 但Liu等
(2006)报道豌豆叶片中PsPLC可以被外源ABA及
SA所诱导。在盐处理条件下, 水稻OsPLC1表达量
升高显著, OsPLC2与OsPLC3变化不明显, 而Os-
PLC4表达量却降低(Singh等2013)。而本研究在盐
处理条件下大豆叶片中GmPLC12的表达量随处理
时间的推移而升高, 在处理12 h时达到表达量峰
值。在根中GmPLC12的表达量却迅速升高, 达到
表达量的峰值。磷脂酶C基因表达模式的差异说
明这些基因在不同逆境胁迫下的作用有所不同。
我们的研究结果表明大豆磷脂酶C基因可能参与
植物对盐、碱和盐碱胁迫的应答, 但其作用机理
仍不清楚。在后续的研究中, 试图通过将磷脂酶C
在拟南芥中进行过表达, 以及利用Pull-down技术
筛选与GmPLC12相互作用的蛋白, 从而研究该基
因调控植物逆境胁迫的机制。
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图6 GmPLC12重组蛋白在大肠杆菌中的表达
Fig.6 Expression of GmPLC12 protein in E. coli cells
A: SDS-PAGE检测; B: Western blot检测。M: 蛋白分子量标准; 1: pET28a空载; 2~7: IPTG浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0
mmol·L-1诱导的重组蛋白; 箭头表示GmPLC12的融合蛋白条带。
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