全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (8): 1347~1349　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0236 1347
收稿 2015-04-30　　修定 2015-07-14
资助 江苏省高校专业学位研究生科研实践计划项目(SJLX_0614)。
* 通讯作者(E-mail: weijun@yzu.edu.cn; Tel: 13004326981)。
改良NH4F掩蔽法在测定植物组织二价铁含量中的应用
倪琳琳1, 侯炤琪1, 封士达1, 吴晨阳3, 陆小龙2, 韦军1,*
扬州大学1园艺与植物保护学院, 2测试中心, 江苏扬州225009; 3宿迁学院, 江苏宿迁223800
摘要: 针对NH4F掩蔽法测定二价铁含量中存在的问题, 将此测定方法改良为: 对提取液不用浓硫酸或盐酸调节pH, 直接先
加入0.15% 邻菲罗啉溶液2 mL, 再加入3 mol·L-1 NH4F溶液2 mL, 决定系数和变异系数分别为0.9998和10.23%, 回归率达到
了100.82%, 适合植物组织中二价铁含量的精确测定。
关键词: 植物组织; Fe2+; NH4F掩蔽法
Application of Improved NH4F Masking Method in Determination of Ferrous
Iron in Plant Tissues
NI Lin-Lin1, HOU Zhao-Qi1, FENG Shi-Da1, WU Chen-Yang3, LU Xiao-Long2, WEI Jun1,*
1College of Horticulture and Plant Protection, 2Testing Center, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009, China; 3Suqian
College, Suqian, Jiangsu 223800, China
Abstract: In order to solve the problems of ferrous iron contents in plant tissues, NH4F masking method were
improved in this paper. The results showed that the determination coefficient and coefficient of variation were
0.9998 and 10.23% respectively and the recovery was up to 100.82%, when 0.15% phenanthroline 2 mL and 3
mol·L-1 NH4F 2 mL were added in turn without sulfuric acid or hydrochloric acid to adjust pH.
Key words: plant tissue; ferrous iron; NH4F masking method
技术与方法 Techniques and Methods
铁是植物必需的微量元素, 参与植物体内的
叶绿素合成、氧化还原反应和电子传递等(申红芸
等2011), 在植物的生理代谢过程中起着重要作
用。植物缺铁黄化已成为世界性营养失调问题,
解决缺铁问题对农业甚至人类健康都有十分重要
的意义(金亚波等2007)。我国长江中下游地区的
梨园普遍存在缺铁黄化问题, 因此准确评价梨树
铁营养状况尤为重要, 叶片全铁含量变化常用来
作为植物铁营养状况诊断的生理指标, 但近年来
研究发现, 全铁含量并不能准确反映植物体内的
铁营养状况(Terry 1980)。80年代中期, 提出用植
物组织在低浓度HCl浸提液中的铁含量评价植物
铁营养状况, 称其为活性铁指标(Pierson和Clark
1984), 这一概念在此后的诊断工作中得到较多的
应用。上述两种诊断指标的共同之处是全铁和活
性铁的离子形态均由Fe2+和Fe3+组成, 区别仅是活
性铁是一种以Fe2+为主, 混杂有部分Fe3+的铁含量
(Pierson和Clark 1984)。近年来的研究结果表明,
在植物正常铁代谢过程需要的铁离子形态主要是
Fe2+ (Clarkson和Hanson 1980), 显然, 在植物生产上
直接采用Fe2+含量变化作为诊断指标可能对评价
植物的铁营养状况更具有应用价值, 但多年来, 国
内外对Fe2+含量变化与铁营养状况的关系研究未
见报道, 主要原因之一是针对植物组织中Fe2+含量
变化的可靠测定方法尚未成熟。
目前, 测定植物组织中Fe2+和Fe3+含量变化的
方法主要为双波长分光光度法和掩蔽法(高勇等
2013)。双波长分光光度法是选择510和390.5 nm
两种波长, 以邻菲罗啉为显色剂, 同时测定Fe2+和
Fe3+的含量(曲东和王保莉1991)。由于Fe3+和邻菲
罗啉的反应常呈非线性, 难以准确测定三价铁的
含量变化, 也影响到植物组织中二价铁含量含量
变化的准确测定(Patel等2001)。常用的掩蔽法有
EDTA掩蔽法和NH4F掩蔽法, EDTA掩蔽法是利用
植物生理学报1348
EDTA与Fe3+形成稳定的络合物EDTA-Fe3+, 从而掩
蔽Fe3+对Fe2+测定的干扰, 但是研究表明, EDTA还
能与Fe2+形成较稳定的络合物EDTA-Fe2+, 也掩蔽
了部分Fe2+ (高勇等2013), 因此, EDTA掩蔽法测定
植物组织中的二价铁含量变化的准确性值得商榷
(姚群峰等2000)。NH4F掩蔽法是首先将测定液的
pH值调节至≤3, 然后依次加入2 mol·L-1 NH4F 2
mL和0.15%邻菲罗啉2 mL, 在波长510 nm处进行比
色测定(姚群峰等2000), 原理是利用NH4F中氟离子
(F-)与Fe3+形成稳定的络合物, 从而掩蔽Fe3+, 使邻
菲罗啉只与Fe2+发生显色反应, 但该方法目前主要
应用于水中二价铁含量的测定, 尚未用于植物组织
中二价铁的测定(姚群峰等2000)。此外, 显色剂邻
菲罗啉和掩蔽剂NH4F的加入顺序也对可能对测定
结果的准确性产生影响, 从理论上分析, 先加入邻
菲罗啉显色, 再加入NH4F掩蔽, 则邻菲罗啉先与
Fe2+反应, 生成的Fe2+-phen复合物比较稳定, 可以减
小Fe2+的氧化; 而先加入NH4F掩蔽, 再加入邻菲罗
啉显色, 则F-与Fe3+反应生成稳定的络合物, 减少
Fe3+-phen复合物的生成, 避免其发生光化学还原反
应(高勇等2013); 如果同时加入邻菲罗啉和NH4F, F
-
不可避免会影响Fe2+和Fe3+对邻菲罗啉的竞争。
因此, 本文基于原有的NH4F掩蔽法进行改良,
不对植物样品提取液进行pH调节, 设置不同NH4F
溶液浓度和不同的显色剂邻菲罗啉和掩蔽剂NH4F
的加入顺序, 探索适合对植物组织中二价铁含量
变化进行准确测定的方法。
材料与方法
1 材料
供试材料为扬州大学教学果园的砂梨品种
‘新高’ (Pyrus pyrifolia Nakai cv. ‘Niitaka’), 砧木豆
梨(Pyrus calleryana Decne), 株行距4 m×5 m, 十年
生, 砂壤土。
1.1 样品采集与处理
按照河北省标准(DB13/T 1401-2011)梨叶片
营养诊断技术规程, 新梢长至10 cm后采集‘新高’
树冠外围发育枝梢中段的健康叶。
取1 g鲜样用1 mol·L-1盐酸按1:50的比例浸提
(静置24 h), 过滤后取1 mL浸提液利用紫外可见分
光光度计测定浸提液中Fe2+的含量, 重复3次(邹春
琴等1998)。
1.2 试验仪器
紫外可见分光光度计(UV745N, 上海精密科
学仪器)。
2 方法
2.1 最适测定方法筛选
准确加入不同浓度梯度 ( 1、2、3、4和5
mg·L-1)的Fe2+和Fe3+标准溶液5 mL至样品提取液。
NH4F溶液和邻菲罗啉溶液的加入顺序设置3个处
理, 分别为A1 (混合后同时加入)、A2 (先加入NH4F
溶液后加入邻菲罗啉溶液)和A3 (先加入邻菲罗啉
溶液后加入NH4F溶液)。NH4F溶液浓度设置4个处
理, 分别为B1 (0.1 mol·L
-1)、B2 (1 mol·L
-1)、B3 (2
mol·L-1)、B4 (3 mol·L
-1)和B5 (5 mol·L
-1)。NH4F溶
液和邻菲罗啉溶液用量均为2 mL, 共15个处理, 每
个处理均作标准曲线, 对照为原NH4F掩蔽法。
数据分析采用DPS数据处理系统的LSD法(莫
惠栋1991)。回收率(%)=(加标样品测定平均值–未加
标样品测定平均值)/加标量×100 (杨剑虹等2008)。
2.2 遮光处理对测定结果的影响
鉴于实验显色过程中可能发生的光化学还原
反应对测定结果的影响, 对本实验筛选出的最适
测定方法进行遮光对比实验。方法是测定前对测
定器皿表面用锡箔纸包裹严密, 其它操作与对照
相同, 即准确加入不同浓度梯度(1~5 mg·L-1)的Fe2+
和Fe3+标准溶液5 mL至样品提取液。
结果与讨论
1 不同NH4F溶液浓度和加入顺序的筛选
从表1可以看出, 处理A2B5的决定系数明显偏
低, 可先排除。对照回收率远大于105%, 也不符合
要求。回收率接近95%~105% (杨剑虹等2008)的处
理有A1B4、A1B5、A3B4和A3B5四种, 其中变异系数
最小的是处理A3B4。后续实验统一采用A3B4处理。
表1表明, B处理中, B1、B2和B3处理的回收率
都远远高于105%, 导致测定结果被过分夸大(杨剑
虹等2008), 原因可能是NH4F溶液浓度过低(0.1、1
和2 mol·L-1), Fe3+没有被完全掩蔽, 残留的Fe3+与邻菲
罗啉反应, 生成Fe3+-phen复合物, 该复合物发生光
化学还原反应, 生成Fe2+-phen, 导致结果偏大, 回收
率过高, 因此可行的处理是B4和B5。A处理中, A2处
理的回收率也都远远高于105%, 原因可能是同时
加入邻菲罗啉和NH4F后, F
-的掩蔽效果受到影响,
倪琳琳等: 改良NH4F掩蔽法在测定植物组织二价铁含量中的应用 1349
原本应与F-络合的Fe3+不和F-结合, 反而与邻菲罗啉
反应生成Fe3+-phen复合物, Fe3+-phen发生光化学还
原反应生成Fe2+-phen, 导致回收率偏高。
本实验虽未对提取液进行调节pH处理, 但仍
得到满意的决定系数、变异系数和回收率, 说明
不调节pH也能准确测定植物组织中的二价铁含
量。原因可能是原NH4F掩蔽法要求在加入掩蔽剂
NH4F之前必须需将pH调节至3以下, 因为F
-的存在
会有利于Fe2+的氧化, 而pH≤3时会使先加入的F-
以HF的形式存在, 等加入显色剂和缓冲溶液之后,
F-再离解与Fe3+络合, 同时邻菲罗啉与Fe2+发生显
色反应(姚群峰等2000)。但是有研究表明, 即使将
溶液pH调节至2.5以下, 也不能避免残留的F-加速
Fe2+的氧化(高勇等2013), 且表1原NH4F掩蔽法的
结果也证明了这点。由于植物组织提取液对酸碱
度具有一定缓冲效能, 在加入掩蔽剂之前加酸调
节pH并不能完全解决Fe2+氧化的问题, 虽然该方法
用于水中铁的价态分析时结果较好, 但对植物组
织提取液仅用酸调节其pH并不能达到理想的分析
结果。因此, 作者认为测定植物组织中的二价铁
可以不加酸调节pH。
2 遮光对测定效果的评价
从表2可以看出, 遮光对Fe2+含量测定结果的
决定系数、变异系数和回收率均不存在显著性影
响。改良NH4F掩蔽法不需要在遮光条件下进行显
色反应。
因此从决定系数、变异系数和回收率三个方
面综合考虑, 适合用于测定植物组织中二价铁的
方法是处理A3B4。具体方法为: (1)称取1 g叶片鲜
样, 加入1 mol·L-1盐酸50 mL浸提, 静置24 h后过滤
备用; (2)取1 mL浸提液, 先加入2 mL邻菲罗啉
(0.15%)溶液, 然后加入2 mL NH4F (3 mol·L
-1)溶液,
再加入5 mL NaAc (1 mol·L-1)缓冲溶液, 定容至25
mL, 显色30 min; (3)利用紫外可见分光光度计于
510 nm波长处测定其吸光度。
参考文献
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表1 不同NH4F溶液浓度和加入顺序对决定系数、变异系数和回收率的影响
Table 1 Effects of different NH4F solutions and adding orders on determination coefficient, coefficient of variation and recovery

NH4F浓度/
处理A1 处理A2 处理A3
编号
mol·L-1
(同时加入NH4F和邻菲罗啉) (先加NH4F后加邻菲罗啉) (先加邻菲罗啉后加NH4F)
决定系数(R2) 变异系数/% 回收率/% 决定系数(R2) 变异系数/% 回收率/% 决定系数(R2) 变异系数/% 回收率/%
B1 0.1 0.9996 40.91
d 142.97 0.9996 70.61c 169.04 1.0000 37.64e 142.22
B2 1.0 0.9995 26.03
g 116.51 0.9856 30.03f 164.87 0.9997 37.84e 136.64
B3 2.0 0.9999 16.93
j 111.13 0.9677 24.36h 171.52 0.9991 29.40f 108.20
B4 3.0 0.9997 17.29
j 103.14 0.9032 114.29b 144.42 0.9998 10.23m 100.82
B5 5.0 0.9997 14.58
k 106.15 0.5389 1 099.59a 113.31 0.9996 12.73l 100.58
对照 2.0 0.9161 19.37i 215.40
　　不同小写字母表示5%水平的显著差异。对照为原NH4F掩蔽法。
表2 遮光对Fe2+含量测定效果的评价
Table 2 Evaluation of effect of shading on ferrous iron content
　处理 决定系数(R2) 变异系数/% 回收率/%
对照 0.9998a 10.23a 100.82a
遮光处理 0.9997a 10.83a 101.33a
　　不同小写字母表示在5%水平的显著差异。