全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1333~1338 1333
收稿 2013-07-18　　修定 2013-09-25
资助 现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-14)、高等学
校博士学科点专项科研基金(20121302110002)、河北省高等
学校科学技术研究重点项目(ZD2010136)和河北省专家出国
培训项目。
* 通讯作者(E-mail: liulifeng@hebau.edu.cn; Tel: 0312-
7520200)。
一种快速、高效花生植株再生体系的建立
马彩霞, 穆国俊, 侯名语, 陈焕英, 崔顺立, 何美敬, 刘立峰*
河北农业大学农学院, 教育部华北作物种质资源实验室, 河北省作物种质资源重点实验室, 河北保定071001
摘要: 快速、高效、重复性好的植株再生体系是转基因育种的基础; 本研究以14份不同花生品种的胚小叶为外植体, 利用
不同激素浓度、组合和不同花生基因型筛选最佳芽诱导培养基、伸长培养基和高效再生基因型。结果表明最佳丛生芽诱
导培养基为MSB5+0.2 mg·L
-1 NAA+6 mg·L-1 6-BA, 诱导率为89.50%; 最佳伸长培养基为MSB5+0.2 mg·L
-1 NAA+3 mg·L-1
6-BA和MSB5+0.2 mg·L
-1 NAA+4 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 GA3交替培养, 每个丛生芽伸长数达到7.24, 时间缩短至3~4周。不同
品种再生率的变幅在25.51%~93.01%, 大于80%的品种有‘麻油1-1’、‘弗落蔓生’、‘濮花23号’、‘海花1号’。利用‘弗落蔓生’
在15 周内得到了生根组培苗。
关键词: 花生; 胚小叶; 再生; 丛生芽
A Rapid and Efficient Method for Peanut Regeneration
MA Cai-Xia, MU Guo-Jun, HOU Ming-Yu, CHEN Huan-Ying, CUI Shun-Li, HE Mei-Jing, LIU Li-Feng*
Laboratory of Crop Germplasm Resources for Northern China, Ministry of Education, Key laboratory of Crop Germplasm Re-
sources of Hebei Province, College of Agronomy, Agricultural University of Hebei, Baoding, Hebei 071001, China
Abstract: Rapid, efficient and repeatable plant regeneration method is the basis for plant transgenic breeding. In
this study, the leaflet of fourteen peanut varieties was used as explants. The effects of different hormone
concentration, combination and different peanut genotypes were analyzed to investigate the optimal method of
shoots induction medium, elongation medium and high efficiency regeneration genotypes. The results showed that
the optimal shoots induction medium was MSB5+0.2 mg·L
-1 NAA+6 mg·L-1 6-BA with inductivity of 89.50%;
optimal elongation media were MSB5+0.2 mg·L
-1 NAA+3 mg·L-1 6-BA and MSB5+0.2 mg·L
-1 NAA+4 mg·L-1
6-BA+2 mg·L-1 GA3 with the alternation of culture. The highest average elongated shoots were 7.24 per explant
and the shortest bud elongation period was 3–4 weeks. The regeneration rate of the different genotypes varied
from 25.51% to 93.01%. Genotypes with the regeneration rate over 80% were ‘MaYou 1-1’, ‘FuLuoManSheng’,
‘PuHua 23’ and ‘HaiHua 1’. Plantlets were obtained in 15 weeks using genotype of ‘FuLuoManSheng’.
Key words: peanut; leaflet; regeneration; multiple shoots
花生是世界上重要的经济作物以及油料作物
(魏丽奇等2008)。我国花生产量居世界第一, 种植
面积居世界第二, 在世界花生生产上具有举足轻
重的地位(刘学忠2008)。传统育种可以有效的提
高花生在产量、抗旱等方面的特性, 但是其他一
些重要的农艺性状如抗线虫、抗病毒、抗真菌
(Kochert等1996)等性状也有待提高。花生的遗传
基础较弱, 可用的有效资源有限(Kokalis-Burelle等
2002), 利用基因工程技术进行花生遗传转化, 对花
生分子遗传学基础研究及育种应用具有重要意义
(闫新甫2003)。
成功获得转基因植株的关键在于建立一个高
效的受体系统, 花生作为一种大粒豆科植物, 通过
组织培养获得再生植株存在很多困难, 尽管如此,
国内外仍有成功实现花生离体再生的报道, 已用
的外植体包括成熟的胚轴(Ozias-Akins 1989; Baker
等1995; 温世杰等2010)、子叶(Gao等2007; Burns
等2012; Tiwari和Tuli 2008; Sharma和Anjaiah
2000)、子叶节(Verma等2009; Srinivasan等2010)和
叶片(Fontana等2009)。McKently等(1990)以带胚
子叶以及去胚子叶为外植体诱导丛生芽, 发现带
胚子叶为最适外植体, 经过258 d长成完整植株。
上述研究中外植体取材过程复杂且对种子需求量
植物生理学报1334
较大。Baker和Wetzstein (1992)和Venkatachala等
(1999)分别以胚小叶为外植体, 通过体细胞胚再生
途径成功诱导出胚性愈伤组织, 但是均存在分化
成株困难的问题。Mroginski等(1981)以3~5 d苗龄
的不成熟小叶为外植体诱导丛生芽并获得完整植
株。Tiwari和Tuli (2009)以未成熟胚小叶为外植体
研究预培养时间、培养基及基因型对胚小叶再生
的影响, 整个过程耗时4个月, 再生率可达80%。上
述以胚小叶为外植体的再生体系依然存在着成株
困难以及重复性低的问题, 同时在再生频率的提
高以及周期的缩短等技术瓶颈上还有待突破。有
研究表明植株离体再生对基因型有很强的依赖性
(Banerjee 2007), Akasaka等(2000)研究6种基因型
花生的胚小叶在3种培养基上的芽诱导效果, 结果
表明, 基因型间的芽诱导率差异显著, 因此筛选高
效再生基因型具有重要意义。
本研究以成熟花生胚小叶为外植体, 利用不
同激素浓度、组合和不同花生基因型筛选最佳芽
诱导培养基、伸长培养基和高效再生基因型, 以
期建立一套快速、高效、重复性好的花生植株再
生体系, 为今后的转基因育种工作奠定基础。
材料与方法
1 材料
供试的14份不同花生(Arachis hypogaea L.)品
种来自河北农业大学花生研究所种质资源库, 品
种及所属类型如表1所示:
2 培养基
基本培养基为: MSB5+30 g·L
-1蔗糖+7 g·L-1琼
脂, pH为5.8; 丛生芽诱导培养基为: MSB5添加0.2
mg·L-1 NAA和6-BA(8、6、5、4.5和4 mg·L-1); 芽伸
长培养基为: MSB5添加GA3 (2、4、6、2、2、2和
0 mg·L-1)、NAA (0、0、0、0.2、0.2、0.2和0.2
mg·L-1)和6-BA (0、0、0、2、3、4和3 mg·L-1); 生
根培养基为: MSB5+1 mg·L
-1 NAA。
3 方法
3.1 种子处理
将成熟荚果去果皮 ,先后浸于75%酒精中1
min、0.1% HgCl2 溶液中10 min, 进行表面消毒, 再
用无菌水漂洗4~5次, 剥去种皮, 浸泡于无菌水中
7 h备用。
3.2 培养过程
芽诱导培养: 于超净工作台中, 用镊子小心将
浸泡7 h后的花生2片子叶去除, 得到完整体胚, 再用
镊子轻轻将胚小叶分离, 接种于芽诱导培养基中(图
1-A), 置于光照培养箱中培养; 各处理重复3次, 每重
复110~120个外植体, 接种15 d后统计芽诱导率。
伸长培养: 切取诱导出的丛生芽转接到伸长
培养基中, 对丛生芽进行伸长和增殖培养, 每3周
继代一次; 各处理重复3次, 每重复70~90个丛生芽,
当丛生芽伸长至2~3 cm统计每丛生芽伸长数。
生根培养: 切取经伸长培养至2~3 cm再生苗
转至生根培养基中, 经2周长出健壮的根(图1-F);
开盖炼苗并移栽入蛭石中, 得到以胚小叶为外植
体的组培苗(图1-G)。
以上过程培养条件均为: 温度(26±0.5) ℃, 光
照16 h·d-1, 光照强度18.75~25 μmol·m-2·s-1。
3.3 数据统计与分析
芽诱导率=(诱导出丛生芽的外植体数/接种总
外植体数)×100%。
每丛生芽伸长数=再生苗总数/接种丛生芽
总数。
全部数据采用Microsoft Excel 2003与统计分
析软件SAS 9.0进行分析。
实验结果
1 不同激素浓度对丛生芽诱导的影响
同一供试品种‘弗落蔓生’胚小叶在相同处理
下接种于5种不同丛生芽诱导培养基上, 研究不同
激素浓度对丛生芽诱导的影响。经过7 d的培养胚
小叶开始膨大, 培养至15 d时大部分外植体顶端产
生嫩绿色的丛生芽(图1-B、C)。不同激素组合及
浓度对丛生芽的诱导影响显著。从表2看到, 在
表1 供试材料
Table 1 Materials
品种 类型 品种 类型
‘弗落蔓生’ 珍珠豆型 ‘狮头企’ 珍珠豆型
‘麻油1-1’ 多粒型 ‘邢花1号’ 普通形
‘濮花23’ 普通型 ‘RHP12’ 普通型
‘海花1号’ 普通型 ‘花育19’ 普通型
‘佛州巨人’ 珍珠豆型 ‘白沙1016’ 珍珠豆型
‘兰娜(大)’ 多粒型 ‘LH花生’ 普通型
‘冀花5号’ 普通型 ‘花育25’ 普通型
马彩霞等: 一种快速、高效花生植株再生体系的建立 1335
NAA浓度相同的条件下, 6-BA浓度为6 mg·L-1时,
得到了最大芽诱导率89.25%, 6-BA浓度为5 mg·L-1
时次之, 诱导率为86.99%; 而6-BA浓度过高或过低
都会抑制丛生芽的诱导。本试验确定MSB5+0.02
mg·L-1 NAA+6 mg·L-1 6-BA为最佳芽诱导培养基。
2 不同激素组合对丛生芽伸长的影响
以‘弗落蔓生’胚小叶诱导的丛生芽为材料, 分
别接种于只添加不同浓度GA3、添加NAA与6-BA
和添加不同浓度的GA3、NAA与6-BA等3大类7种
伸长培养基上, 研究不同激素组合对丛生芽伸长
的影响(表3)。结果表明, 添加0.2 mg·L-1 NAA与3
mg·L-1 6-BA的伸长培养基上得到最大每丛生芽伸
长数7.24, 明显高于表中其他处理, 丛生芽经过2到
3次继代培养伸长至2~3 cm同时不断膨大分化出
新的芽点(图1-D), 可经再次继代伸长成苗。单独
添加GA3与GA3同6-BA和NAA结合使用对丛生芽
的伸长效果差异显著; 单独添加GA3的情况下, 随
着GA3浓度的升高对丛生芽的伸长产生了抑制, 浓
度为2 mg·L-1最为适宜; GA3同6-BA和NAA结合使
用的情况下, 当GA3和NAA浓度不变, 随着6-BA浓
度的增大每丛生芽伸长数变化不显著, 2 mg·L-1
GA3与0.2 mg·L
-1 NAA、4 mg·L-1 6-BA组合每丛生
芽伸长数最多0.35。试验中观察到, GA3会抑制丛
生芽周围组织分化新的芽点, 但是能够快速的促
进已分化丛生芽的伸长(图1-E), 缩短伸长时间。
3 基因型对胚小叶直接诱导丛生芽的影响
利用芽诱导培养基MSB5+0.2 mg·L
-1 NAA+6
mg·L-1 6-BA从14个供试品种中筛选高效再生基因
型, 结果表明不同基因型对植株再生的影响显著,
且同一类型的不同品种之间再生率差异显著。供
试品种‘麻油1-1’获得了最大丛生芽诱导率93.01%,
‘弗落蔓生’、‘濮花23’、‘海花1号’次之, 芽诱导率
分别为89.50%、80.47%、80.34%, 丛生芽诱导率
最小的是花生品种‘花育25’以及‘LH花生’, 丛生芽
诱导率仅为26%左右(表4)。
表4 不同基因型花生品种的诱导率
Table 4 Induction rates of different genotypes
品种 类型 再生率/%
‘麻油1-1’ 多粒型 93.01±0.01A
‘弗落蔓生’ 珍珠豆型 89.25±0.00A
‘濮花23’ 普通型 80.47±0.07AB
‘海花1号’ 普通型 80.34±0.04AB
‘佛州巨人’ 珍珠豆型 74.91±0.06BC
‘兰娜(大)’ 多粒型 62.94±0.05DC
‘冀花5号’ 普通型 60.97±0.03D
‘狮头企’ 珍珠豆型 53.76±0.07D
‘邢花1号’ 普通型 51.58±0.11D
‘RHP12’ 普通型 49.13±0.02D
‘花育19’ 普通型 29.86±0.04E
‘白沙1016’ 珍珠豆型 29.02±0.01E
‘LH花生’ 普通型 26.26±0.03E
‘花育25’ 普通型 25.51±0.02E
表2 不同激素浓度对丛生芽诱导的影响
Table 2 Effect of different combinations of hormone on the
induction of multiple shoots
培养基编号
激素浓度/mg·L-1
芽诱导率/%
6-BA NAA
I 8 0.2 10.20±0.01D
II 6 0.2 89.25±0A
III 5 0.2 86.99±0.03A
IV 4.5 0.2 50.06±0.05B
V 4 0.2 33.13±0.04C
同列不同的大写字母表示差异达到显著水平(P≤0.05)。表3
和表4同此。
表3 不同激素组合对丛生芽伸长的影响
Table 3 Effect of different phytohormone combinations on the
elongation of multiple shoots
培养基编号
激素浓度/mg·L-1
每丛生芽伸长数
6-BA NAA GA3
I 0 0 2 0.21±0.03B
II 0 0 4 0.07±0.01C
III 0 0 6 0.09±0.04C
IV 2 0.2 2 0.22±0.03B
V 3 0.2 2 0.19±0.04B
VI 4 0.2 2 0.35±0.01A
VII 3 0.2 0 7.24±0.85
　　仅将GA3对丛生芽伸长的影响做方差分析。
讨　　论
胚小叶作为外植体具有取材简单和种子消耗
量小的优点, 不需要经过种子萌发等预培养阶段,
且每个成熟的花生种子能分离出6~8个可用胚小
叶。本试验结果表明外植体的基因型和不同激
素组合及适宜的浓度是植物离体再生的关键因
素 , 这与前人的研究结果一致(雷萍萍等2009;
McKently 1995; Matand和Prakash 2007; Tiwari等
植物生理学报1336
图1 胚小叶为外植体的花生再生过程
Fig.1 The protocol for regeneration of peanut from leaflet
所用材料为花生品种‘弗落蔓生’, A: 以胚小叶为外植体进行丛生芽诱导培养; B、C: 经过15 d的诱导培养大部分外植体诱导出丛生芽,
每丛生芽含有多个芽点(箭头所示); D: 丛生芽伸长为再生苗, 同时周围分化出新的芽点(箭头所示); E: 丛生芽直接伸长为小苗; F、G: 经过
2周的生根培养长出健壮的根, 经过炼苗移栽入蛭石中。
马彩霞等: 一种快速、高效花生植株再生体系的建立 1337
2008)。在李小东等(2008)的研究中, 不同的花生
品种分别有其适宜的芽丛诱导以及芽丛伸长培养
基, 在3 mg·L-1 6-BA+0.7 mg·L-1 NAA以及4.53 mg·L-1
6-BA+0.2 mg·L-1 NAA的培养基上得到的芽丛诱导
率分别为81.49%和72.33%; 在何晔等(2007)与李春
娟等(2005)的研究中, 以胚小叶为外植体诱导愈伤
组织, 通过愈伤组织诱导丛生芽至成苗, 最后成苗
率仅为20%。而本试验在6-BA与NAA的结合下,
将丛生芽诱导率提高到93.01%, 且每丛生芽出苗
数最大为7.24, 远高出前人的研究。
赤霉素(GA3)是一种能够促进细胞伸长的植
物激素。Sankhla等(1993)的研究结果表明GA3的
加入会抑制芽的形成, 但是GA3可以有效促进已分
化芽的伸长, 并且在马铃薯组织培养中有很好的
应用, 使用浓度在0.05~1.0 mg·L-1范围内, 以0.1
mg·L-1居多(张富荣等2009)。已有的花生植株再生
的报道中鲜有使用GA3的报道, 近期的研究中Shan
等(2009)以花生下胚轴为外植体, 发现在丛生芽伸
长阶段6-BA与少量(2 mg·L-1) GA3结合使用比单独
使用6-BA伸长效果更好。
本研究以丛生芽伸长环节为切入点, 探讨了
单独使用GA3以及GA3结合6-BA与NAA对丛生芽
伸长的影响。结果表明GA3与6-BA、NAA结合使
用得到的每丛生芽伸长数低于6-BA与NAA组合得
到的每丛生芽伸长数, GA3不能促进丛生芽的进一
步分化, 却能有效的促进已分化丛生芽的伸长, 在
短时间内(2~3周)使苗伸长至2~3 cm, 该结论与GA3
应用于马铃薯组织培养中的效果一致 (李凤云
2008; 耿玉娴2005; 李天然1998); 而在只有6-BA与
NAA的伸长培养基上, 丛生芽在伸长的同时其周
围组织可以继续分化出新的芽点, 这个过程相对
于前述伸长过程较缓慢, 需经过2~3次继代培养才
可得到苗。GA3的加入可以有效的缩短伸长周期,
在组织快繁中有很好的应用前景, 因此对GA3在花
生离体培养中的作用还将继续研究。
用于转基因受体系统的再生体系应该具有
80%~90%以上的再生频率, 同时要结合考虑受体
基因型对农杆菌的敏感度(贾世荣和曹冬东1992),
近期的研究结果也表明再生率高的基因型不一定
转化效率就高(徐勤青等2008), 所以本试验筛选出
4个再生率大于80%的品种, 将用于后续转基因工
作的研究。
本研究以胚小叶为外植体建立了一种快速、
高效、重复性好的花生植株再生体系。筛选出4
种高效再生品种, 为今后花生育种奠定了基础并
为花生离体再生的研究提供参考。
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