全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (6): 977~982　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0202 977
收稿 2015-04-13　　修定 2015-04-30
资助 中国烟草总公司项目(110201201004JY-04和11020130-
1005JY-05)。
* 通讯作者(E-mail: liuguanshan2002@163.com; Tel: 0532-
88703168)。
烟草幼苗期耐低钾突变体的筛选及验证
徐丽娟1, 王倩2, 郑春花1, 隋炯明1, 刘光亮1, 刘贯山2,*
1青岛农业大学生命科学学院, 山东省高校植物生物技术重点实验室, 山东青岛266109; 2中国农业科学院烟草研究所, 山东
青岛266101
摘要: 为了探讨筛选烟草耐低钾突变体的最优条件, 以烟草野生型品种‘中烟100’为材料, 研究了不同钾离子浓度对其根生
长的影响, 确定了在培养基中筛选耐低钾突变体的适宜钾离子浓度为0.075 mmol·L-1。然后以EMS诱变处理获得的‘中烟
100’ M2代种子为材料, 进行了大规模的耐低钾突变体的筛选, 初步筛选出了99个M2代候选材料。选取50个材料继续进行
了验证, 其中22个M3代突变体经复选鉴定弯根率≥75%, 这些突变体在低钾培养基上长势明显好于对照, 且绝大多数突变
体的单位鲜重叶片的钾含量明显高于对照。研究结果可为烟草耐低钾突变体的筛选提供依据。
关键词: 烟草; EMS诱变; 耐低钾突变体; 弯根; 筛选
Screening and Identification of Low K+ Tolerant Mutants at the Seedling Stage
of Nicotiana tabacum
XU Li-Juan1, WANG Qian2, ZHENG Chun-Hua1, SUI Jiong-Ming1, LIU Guang-Liang1, LIU Guan-Shan2,*
1College of Life Science, Qingdao Agricultural University, Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong, Qingdao,
Shandong 266109, China; 2Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao, Shandong 266101, China
Abstract: In order to determine the optimal condition for screening of K+ tolerant mutants, a wild type variety,
Nicotiana tabacum cultivar ‘Zhongyan 100’ was selected to analyze the effect of different concentrations of K+
on the growth of roots in this experiment and the optimal K+ concentration for screening of K+ tolerant mutants
was considered to be 0.075 mmol·L-1. Then, M2-generation mutagenic seeds of ‘Zhongyan 100’ treated by EMS
were selected for screening of K+ tolerant mutants. Finally, 99 M2-generation candidate individuals were ob-
tained. We selected 50 individuals to further examine their tolerance to low K+. The results showed that 22 of
50 individuals were obtained with a higher root-bending rate (≥75%) and their growth vigor and K+ content of
fresh weight per gramme was obviously better than that of the mutagenic parent, ‘Zhongyan 100’ in low K+ me-
dium. This study can provide basis for screening of low K+ tolerant mutants in N. tabacum.
Key words: Nicotiana tabacum; EMS mutagenesis; low K+ tolerant mutant; root-bending; screening
技术与方法 Techniques and Methods
烟草叶片含钾量是评价烟叶品质的重要指标
之一(刘华山等2006; Marchand等1997), 钾能影响
烟叶中糖类、色素类、芳香类等物质合成和积累,
并与烤烟的香气质、香气量、燃烧性和阴燃持火
力等因素有着密切的关系(李佛琳等1999)。我国
烟叶钾含量普遍偏低, 特别是北方烟区, 与其他主
要产烟国相比存在很大的差距(曹志洪1991)。土
壤中的钾是植物钾素的主要来源, 目前我国土壤
缺钾严重, 钾资源相对稀缺, 严重限制了烟草产量
和品质的提高(鲁如坤1989)。因此, 选育耐低钾型
烤烟将是解决这一问题的关键途径之一(杨帆等
2012)。
本研究建立了一种高效、简便的耐低钾突变
体的筛选和验证体系, 并获得了一些耐低钾烟草
突变体, 这对于解决土壤中钾元素缺乏, 提高烟叶
品质以及K+通道基因的克隆和钾营养的生理、生
化和分子生物学机理研究具有重要的意义。
材料与方法
1 材料
试验所用材料烟草(Nicotiana tabacum L.) ‘中
植物生理学报978
烟100’及其EMS诱变后的M2代种子来自中国农业
科学院烟草研究所。
2 方法
2.1 琼脂粉本底钾的测定
将实验所用琼脂粉称取0.5 g放进坩埚中, 在
马弗炉中250 ℃炭化2 h, 然后再525 ℃灰化10 h, 冷
却后灰分用1:1的硝酸溶解, 加水定容, 用火焰光度
计进行钾离子含量的测定, 重复测定3次。
2.2 K+梯度培养基的配制
以正常MS培养基为基础, 去除KNO3以NH4NO3
替换, 去除KH2PO4, 以等浓度NH4H2PO4替换。实
验设置12个处理, 外加钾离子浓度分别为0、0.025、
0.050、0.075、0.100、0.250、0.500、1.000、
2.500、5.000、10.000、20.000 mmol·L-1, 以硝酸
钾调节K+浓度(外加K+浓度20 mmol·L-1相当于MS
培养基), 灭菌后分装到培养皿中待用。
2.3 烟草种子消毒和播种
将烟草种子用70%乙醇浸泡30 s, 再用10%双
氧水溶液处理10 min, 期间不停颠倒摇匀, 然后用
无菌水冲洗3~5次, 点播在1/2MS培养基上垂直培
养, 每皿接种30粒种子。培养条件为温度25 ℃, 光
照强度40 µmol·m-2·s-1, 光照时间12 h·d-1。
2.4 烟草耐低钾突变体筛选指标的确定
烟草幼苗在钾浓度较高的培养基中, 主根生
长速度较快, 伸长较明显, 叶片呈现正常的绿色;
随着培养基中钾浓度的降低, 烟草幼苗主根生长
速度减慢, 底叶叶缘变黄。相对于主根伸长这一
现象, 底叶叶缘变黄出现较晚。因此, 选择幼苗的
主根伸长作为筛选指标。
2.5 烟草耐低钾突变体筛选压(临界钾浓度)的确定
将在1/2MS培养基上垂直培养的‘中烟100’野
生型幼苗, 待根长长到1 cm左右时(约10 d)转接到
钾离子浓度梯度培养基上, 动作应轻柔, 避免伤根
断根。每处理3皿, 每皿15~20株, 3次重复, 置于培
养架上倒置培养。利用根的向地生长性, 根生长
时会向下弯曲。10 d后观察测量弯根长度, 根据烟
草幼苗主根生长被抑制时(平均弯根长度小于0.5
mm, 见实验结果图1)的最高钾含量确定钾离子的
临界浓度。
2.6 烟草M2代耐低钾突变体的初步筛选
在1/2MS培养基上垂直培养的EMS诱变后的
烟草M2代幼苗, 待根长1 cm左右时(约10 d)转接到
外源添加0.075 mmol·L-1钾离子的低钾MS培养基
上, 置于培养架上倒置培养, 10 d后测量弯根长度,
选择弯根长度大于5 mm的植株为可能的耐低钾突
变体。
2.7 烟草M3代耐低钾突变体的验证
将在培养基上筛选出的M2代耐低钾突变体的
后代(M3代)在外源添加0.075 mmol·L
-1钾离子的
MS培养基上进行重复筛选, 选择在该浓度下弯根
长度大于5 mm, 弯根率≥75%的材料为中选耐低
钾突变体。
2.8 叶片钾离子含量的测定
将重复筛选出的耐低钾突变体在外源添加
0.075 mmol·L-1钾离子的低钾培养基、以及MS培
养基上培养1个月后, 观察其生长情况, 取3株叶片
进行称重, 用湿法消解, 用电感耦合等离子体发射
光谱仪测定钾离子含量(杨远等2013)。
将上述筛选出的耐低钾突变体移栽到田间。
田间管理: 基底肥施硫酸钾22.5~30.0 g·m-2, 后期追
肥硝酸钾7.5 g·m-2。在成熟期, 取3株突变体, 每株
取1叶, 去除主叶脉, 自然风干, 混合后用火焰光度
计测定钾离子含量。
植物全钾的计算公式如下: ω(K)=ρ(K)×V×D×
10-4/m; 式中, ω(K): 植物钾的质量分数, %; ρ(K): 从
校准曲线或回归方程求得的测读液中K的浓度 ,
mg·L-1; V: 显色液体积, mL; D: 消煮液定容体积/吸
取测定的消煮液体积; m: 称样量, g。
实验结果
1 临界钾离子浓度的确定
烟草幼苗冠部的生长受环境钾浓度变化的影
响较小, 而根部生长对环境钾浓度的变化比较敏
感。野生型烟草幼苗在1/2MS培养基上垂直培养
约10 d后, 分别转移到钾离子梯度培养基上(在无
外源施加钾的培养基中 , 钾的本底含量为0.05
mmol·L-1)。通过测量幼苗弯根长度发现: 在培养
基外加钾离子浓度小于或等于0.075 mmol·L-1时,
野生型幼苗根的生长受到严重抑制, 弯根长度几
乎都小于5 mm。随着培养基中钾离子浓度的提
高, 野生型烟草幼苗根的生长速度加快, 根的弯曲
程度更加明显。因此选取外源施加0.075 mmol·L-1
的钾离子作为钾的临界浓度, 在该钾离子浓度下
以幼苗弯根长度5 mm作为耐低钾突变体的筛选临
界值(图1)。
徐丽娟等: 烟草幼苗期耐低钾突变体的筛选及验证 979
2 烟草耐低钾突变体的筛选及验证
将‘中烟100’ M2代突变体种子和野生型种子
(对照)灭菌, 单粒点播到1/2MS培养基上, 垂直培养
至根长1 cm左右时, 将其分别转接到外加钾离子浓
度为0.075 mmol·L-1的低钾培养基上, 倒置培养10
d后测量弯根长度。选择弯根长度大于5 mm的植
株为可能的耐低钾突变体。本实验已对2 000份烟
草M2代突变体进行筛选, 每份材料选择弯根长度
最长的3株幼苗进行测量, 共筛选出99个材料, 平
均弯根长度在5 mm以上, 明显长于对照(平均弯根
长度为0.3 mm) (图2)。之后将这99个烟草突变体
下部叶片更为严重, 而筛选出的绝大多数突变体
在低钾处理下叶片没有出现黄化现象, 这表明突
变体更能适应低钾胁迫的环境, 能充分利用培养
基中有限的钾素维持正常的生长发育。在0.075
mmol·L-1的低钾培养基上, 耐低钾突变体的生物量
明显高于对照; 除630-2外, 每克鲜重叶片的含钾量
明显高于对照(图4-A~C、表2)。
在MS培养基上, 对照和耐低钾突变体的生物
量明显增加, 耐低钾突变体的生物量明显高于对
照, 但只有16-5和1043-1的每克鲜重叶片的含钾量
显著高于对照(图4-D~F、表2)。
为进一步明确在正常栽培条件下耐低钾突变
体的叶片钾含量, 将上述筛选出的耐低钾突变体
移栽到田间后, 在成熟期, 选取15份材料用火焰光
图1 烟草幼苗在K+梯度培养基上的弯根根长情况
Fig.1 Root-bending analysis of wild type seedlings of tobaco
in various K+ media
图2 M2代耐低钾突变体的筛选
Fig.2 Screening of M2-generation low K
+ tolerant mutants
A: 16号突变体; B: 568号突变体; 箭头示弯根明显的突变体。
每份选择弯根较长的幼苗转移至MS培养基中缓苗
培养, 进行驯化移栽, 获得M3代种子。
随机选取 5 0个M 3代种子 , 在外加 0 . 0 7 5
mmol·L-1钾离子的低钾培养基上进行复选, 倒置培
养10 d后, 弯根长度大于5 mm, 弯根率在75%及以
上的材料有22个(图3、表1)。
3 M3代突变体的生长情况和钾含量测定
将复选后弯根率在75%及以上的22个材料的
M3代种子, 分别在外加0.075 mmol·L
-1钾离子的低
钾培养基上和MS培养基上培养1个月, 以野生型材
料为对照, 观察植株生长情况, 并进行叶片含钾量
测定, 确定钾积累和利用的情况。
试验中发现在外加0.075 mmol·L-1 K+的低钾
培养基上, 对照植株出现叶片黄化的症状, 尤其是
植物生理学报980
度计测定干重叶片的钾离子含量。由表3可以看
出, 除16-5、16-6和568-2外, 其余耐低钾突变体的
烟叶钾含量都低于对照, 这说明我们筛选到的绝
图3 M3代耐低钾突变体在低钾培养基上的弯根情况
Fig.3 Root-bending analysis of M3-generation low K
+ tolerant mutants in low K+ medium
A: 16-5突变体; B: 568-2突变体。
表1 M3代突变体弯根率分析
Table 1 Analysis on root-bending rate of M3-generation mutants
材料名称
重复I 重复II 平均弯
总苗数 弯根苗数 总苗数 弯根苗数 根率/%
CK 13 1 20 2 9.0
16-5 14 14 18 16 93.8
16-6 20 18 18 16 89.5
31-3 20 16 17 17 89.2
51-3 10 8 14 13 87.5
113-2 18 17 11 10 93.1
132-1 16 13 20 19 88.9
132-2 18 17 12 10 90.0
204-1 20 20 20 14 85.0
568-1 20 11 16 16 75.0
568-2 20 16 16 13 80.6
619-1 19 16 18 15 83.8
619-2 19 17 17 16 91.7
619-4 19 16 18 16 86.5
619-5 18 15 9 9 88.8
630-1 12 8 18 18 86.6
630-2 20 13 16 14 75.0
721-1 20 15 15 12 77.1
736-2 20 18 12 12 93.8
756-1 18 16 16 16 94.1
1043-1 16 13 12 12 89.3
1045-1 13 9 15 15 85.7
1045-2 18 16 14 13 90.6
大多数突变体只是钾利用高效型突变体, 而不是
钾高效积累型突变体。
讨　　论
我国土壤缺钾严重, 选育耐低钾的烟草品种
可缓解这一问题。目前, 可以通过两个途径获得
耐低钾材料; 一是通过基因工程技术将K+通道和
高亲和K+转运体蛋白基因转入野生型品种中, 使
之高效表达(唐劲驰和曹敏建2001)。植物根细胞
K+通道基因AKT1 是植物细胞从土壤中吸收钾离
子的主要执行者(Hirsch等1998)。Xu等(2006)在拟
南芥植物中过量表达LKS1、CBL1/9基因后, 转基
因植株中AKT1 基因的表达量也得到提高, 最终使
转基因植株对低钾胁迫的耐受性增强。Shi等
(1997)将K+通道基因KAT1和AKT1导入烟草, 获得
了钾高效利用型转基因烟草株系, 使烟草的吸钾
能力提高了18%~22%, 证明外源K+通道基因的导
入不仅可提高土壤中缓效态钾的利用率, 而且可
显著提高烟叶的含钾量, 从而改良烟草产量和品
质。郭兆奎等将拟南芥的AtKupl基因和AtNHX1基
因转入烟草, 获得了钾的吸收利用率明显提高的
转基因植株(郭兆奎等2005, 2007)。二是筛选耐低
钾突变体。本研究以烟草野生型品种‘中烟100’为
材料, 研究了不同钾离子浓度对其根生长的影响,
确定了在培养基中外源施加0.075 mmol·L-1钾离子
为筛选耐低钾突变体的适宜浓度。然后以EMS诱
徐丽娟等: 烟草幼苗期耐低钾突变体的筛选及验证 981
图4 野生型植株(对照)与突变体在0.075 mmol·L-1 K+的低钾培养基和MS培养基中处理1个月后的表型比较
Fig.4 Phenotype comparison of wild type plant (CK) and mutants grown in 0.075 mmol·L-1 K+ medium or MS medium for one month
A~C: 野生型植株(A)和突变体植株16-5 (B)、132-2 (C)在0.075 mmol·L-1 K+的低钾培养基上的生长情况; D~F: 野生型植株(D)和突变
体植株16-5 (E)、132-2 (F)在MS培养基上的生长情况。
表2 野生型植株和耐低钾突变体在低钾培养基和MS培养基上生长1月后的叶片K+含量
Table 2 K+ content of wild type plant (CK) and low K+ tolerant mutants grown in low K+ medium or MS medium for one month
材料名称
外加0.075 mmol·L-1 K+的低钾培养基 MS培养基
3株样品叶片鲜重/g K+含量/µg·g-1 (FW) 3株样品叶片鲜重/g K+含量/µg·g-1 (FW)
CK 0.2021 222.63±7.42 0.8270 4 933.60±39.43
16-5 0.3812 273.73±6.45** 1.5323 5 267.43±67.98**
16-6 0.2690 410.47±10.78** 1.7999 4 436.81±55.35**
31-3 0.3258 399.21±1.95** 2.1271 4 260.16±40.53**
51-3 0.4010 321.32±9.36** 2.1300 4 146.41±32.44**
113-2 0.3468 348.37±0.48** 1.9070 3 850.39±25.31*
132-1 0.4076 275.18±10.85** 3.7575 3 817.83±34.42**
132-2 0.3752 338.28±11.14** 1.9242 4 897.06±64.60
204-1 0.3486 317.92±2.33** 1.9858 4 784.87±72.21
568-1 0.3960 266.55±2.08** 1.6800 4 853.57±62.28
568-2 0.4911 275.58±8.43** 1.6553 4 896.81±55.59
619-1 0.3924 325.43±6.58** 2.0969 4 340.01±14.04**
619-2 0.3086 368.43±5.67** 1.5505 4 717.40±34.17*
619-4 0.3500 280.59±10.65** 4.0128 3 593.14±57.50**
619-5 0.3102 294.67±6.56** 1.6116 4 436.81±49.88**
630-1 0.3214 319.77±7.72** 1.7443 3 047.53±62.62**
630-2 0.5113 214.19±3.92 2.4960 4 493.21±27.37**
721-1 0.3232 272.32±9.62** 1.2864 1 435.90±78.36**
736-2 0.3470 323.88±3.32** 0.9024 4 139.18±53.81**
756-1 0.3629 270.01±8.80** 1.1212 4 579.39±27.29**
1043-1 0.3809 320.01±4.48** 1.7512 5 232.37±53.15*
1045-1 0.4628 285.05±6.43** 1.4763 3 899.48±62.83**
1045-2 0.5339 423.80±1.57** 1.0824 4 528.23±26.70**
　　*表示与对照相比差异显著, **表示与对照相比差异极显著; 下表同。
植物生理学报982
表3 野生型植株和耐低钾突变体成熟后叶片钾含量
Table 3 K+ content of wild type plant (CK) and low K+
tolerant mutants after harvest
材料名称 样品干重/g K+含量/%
CK 0.5045 1.97±0.03
16-5 0.5010 1.97±0.08
16-6 0.5060 1.98±0.06
31-3 0.5051 1.50±0.04**
51-3 0.5009 1.15±0.10**
132-1 0.5003 1.68±0.03*
132-2 0.5045 1.30±0.10**
204-1 0.5032 1.94±0.06
568-1 0.5045 1.64±0.07*
568-2 0.5049 1.97±0.10
619-2 0.5056 0.89±0.08**
630-1 0.5073 1.01±0.07**
721-1 0.5052 1.76±0.10
736-2 0.5057 1.22±0.03**
756-1 0.5025 1.54±0.04
1043-1 0.5073 1.25±0.06**
变处理获得的‘中烟100’ M2代种子为材料, 进行了
大规模的耐低钾突变体的筛选和验证, 并初步筛选
出了一部分M2代候选材料。对M3代突变体继续进
行验证后, 50个材料中有22个M3代突变体弯根长度
大于5 mm, 弯根率在75%以上; 这些突变体在外源
添加0.075 mmol·L-1钾离子的低钾培养基上长势明
显好于对照, 且绝大多数突变体的单位鲜重叶片的
钾含量也明显高于对照, 进一步证实烟草幼苗期耐
低钾突变体筛选体系的有效性。由于烟草的生命
周期很长, 烟草成熟期的基因表达种类、数量及表
达模式与幼苗期相比会发生显著变化, 即苗期耐低
钾的突变体在成熟期不一定继续保持耐低钾特
性。因此对于在幼苗期筛选出的耐低钾突变体, 还
需设计一定的低钾栽培条件, 在整个生育期观察其
生长状况。
据牛佩兰等(1996)的研究: 烟草基因型的钾效
率可以分为钾积累高效利用高效、钾积累低效利
用高效和钾积累低效利用低效3种类型, 其中钾积
累高效基因型具有单位干重含钾量高的特点, 可
用于提高烟叶含钾量, 继而提高烟叶的品质。我
们选择了部分耐低钾突变体移栽到田间, 在正常
栽培条件下叶片成熟时测定了其干重的钾含量,
结果发现个别突变体的叶片钾含量在苗期明显高
于对照, 但在成熟期和对照差不多。我们设想, 如
果继续扩大筛选群体, 有可能会筛选到既耐低钾,
叶片中钾含量又明显高于对照的突变体。这种突
变体可以同时解决生产中的两大问题, 具有广阔
的应用前景。
参考文献
曹志洪(1991). 优质烤烟生产的土壤与施肥. 南京: 江苏科学技术
出版社, 17~28
郭兆奎, 杨谦, 姚泉洪, 万秀清, 颜培强(2007). 转拟南芥AtNHXl基
因促进烟草对钾吸收的研究. 高技术通讯, 17 (11): 1174~1179
郭兆奎, 杨谦, 姚泉洪, 万秀清, 颜培强(2005). 转拟南芥AtKupl基因
高含钾量烟草获得. 中国生物工程杂志, 25 (12): 24~28
李佛琳, 彭桂芬, 萧风回, 杨焕文(1999). 我国烟草钾素研究的现状
与展望. 中国烟草科学, (1): 22~25
刘华山, 王方, 韩锦峰, 黄元炯, 孟凡庭(2006). 烟草钾素营养的研究
进展. 安徽农业科学, 34 (19): 4961~4962
鲁如坤(1989). 我国土壤氮、磷、钾的基本状况. 土壤学报, 26 (3):
280~286
Marchand M, Etourneaud F, Bourrrie B (1997). 不同钾肥品种对烟
草产量与化学成分的影响研究. 中国烟草科学, 18 (2): 6~11
牛佩兰, 石屹, 刘好宝, 梁洪波, 申国明, 孙玉和(1996). 烟草基因型
间钾效率差异研究初报. 烟草科技, (1): 33~35
唐劲驰, 曹敏建(2001). 作物耐低钾营养研究进展. 沈阳农业大学学
报. 32 (5): 382~385
杨帆, 戴林建, 潘著, 吴成林(2012). 钾高效基因型烟草的选育及研
究进展. 作物研究, 26 (2): 183~188
杨远, 邓飞跃, 肖立青, 闵晓芳(2013). 湿法消解-电感耦合等离子
体发射光谱法测定烟叶中22种元素. 中国烟草学报, 19 (3):
11~17
Hirsch RE, Lewis BD, Spalding EP, Sussman MR (1998). A role for
the AKT1 potassium channel in plant nutrition. Science, 280:
918~921
Shi WM, Su YH, Fujiwara T, Hayashi H, Goto K, Komeda Y, Shaff
JE, Kochian LV, Chino M (1997). Transfer of potassium channel
genes into tobacco. In: Ando T, Fujita K, Mae T, Matsumoto
H, Mori S, Sekiya J (eds). Plant Nutrition for Sustainable Food
Production and Environment. Dordrecht: Kluwer Academic Pub-
lishers, 195~196
Xu J, Li HD, Chen LQ, Wang Y, Liu LL, He L, Wu WH (2006). A
protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins,
regulates K+ transporter AKT1 in Arabidopsis. Cell, 125 (7):
1347~1360