全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 5期, 2010年 5月 493
收稿 2009-11-24 修定 　2010-02-03
资助 国家自然科学基金(30460031)和贵州省优秀科技教育人
才省长专项基金(黔省专合字[20 08 ]26 号)。
* 通讯作者(E-mail: yiyin@gznu.edu.cn; Tel: 0851-6702541)。
植物水通道蛋白的运输和调节
李军, 乙引 *
贵州师范大学生命科学学院, 贵阳 550001
Translocation and Regulation of Aquaporins
LI Jun, YI Yin*
School of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang 550001, China
提要: 水通道蛋白是细胞间和细胞内水分运输的主要通道, 其运输和调控对于植物细胞的水分稳态和胁迫响应具有重要作
用。本文综述了水通道蛋白运输的分子机制以及结构修饰、门控、膜转运和异源四聚体等调节机制。
关键词: 水通道蛋白; 选择性运输; 门控机制; 结构修饰; 膜转运; 异源四聚体
水通道蛋白(aquaporin)是一种广泛分布于动
物、植物和微生物的膜镶嵌蛋白, 属于MIP (major
intrinsic protein)蛋白家族。自 1992年发现水通道
蛋白具有介导水分跨膜运输的功能后, 有关水通道
蛋白结构和功能的研究取得了极大进展。研究表
明, 水通道蛋白不仅具有水通道活力(Beitz等2006),
而且还具有透过甘油、尿素、甲酰胺、乙酰胺、
甲基胺等中性分子(Maurel等 1993; Rivers等 1997;
Dean等 1999; Wallace和Roberts 2004)和硼、硅等
营养元素(Johanson等 2001; Quigley等 2001)的功
能, 在维持细胞水分稳态和调节植物生理过程中发
挥重要作用(Maurel等 2008)。本文综述了近年来
在水通道蛋白运输和调控方面的研究进展, 特别是
选择性运输和结构修饰、门控、膜转运和异源四
聚体等调节的分子机制。
1 水通道蛋白的运输
1.1 水通道蛋白的结构 水通道蛋白是由四聚体组
成的沙漏状结构。每个单体都具有水通道活性, 由
5个短环(A-E环)连接的 6个跨膜 α-螺旋组成, 其
N-、C- 末端及 B、D 环朝向细胞质, 而 A、C、
E环朝向细胞质外或液泡、分泌系统的内腔。B、
D环各有一段高度保守的Asn-Pro-Ala序列(NPA),
它们与其他跨膜区域共同形成通道(Fujiyoshi等
2002)。根据结构和定位, 水通道蛋白主要分为 4
类, 即质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic
proteins, PIP)、液泡膜内在蛋白(tonoplast mem-
brane intrinsic proteins, TIP)、类NOD26膜内在
蛋白(nodulin 26-like intrinsic protein, NIP)和小分子
碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins,
S I P )。
1.2 水通道蛋白的选择性运输 植物的水通道蛋白
类型多于动物。通道蛋白的类型越多, 表明通道的
选择性越强(Chaumont等 2005)。运用同源模型
(homology modelling), 拟南芥的35个水通道蛋白可
分为 8个亚组。在玉米和水稻中还存在其他类型
(Takano等 2006)。所有 PIP均高度保守, 孔道狭
窄, 为典型的高水分选择性通道蛋白。相反, TIP
和NIP具有多种孔道构象, 而 SIP的孔道构象则非
常罕见(Wallace和 Roberts 2004)。
通常使用爪蟾卵母细胞或酵母表达系统研究
植物水通道蛋白的运输特性。一般先用生长补偿
法测定水通道蛋白的选择性, 再通过脂蛋白体重组
技术在纯化膜或完整细胞中直接证实其运输活性。
研究表明, 水通道蛋白具有很高的水分运输效率, 在
1 MPa压力下每秒能运输109个水分子(Fujiyoshi等
2002)。同时, 它还具有具离子选择性, 尤其是能
完全阻止H+透过, 维持膜两侧形成的跨膜质子梯度
(Ishikawa等2005; Biela等1999; Dean等 1999)。虽
然如此, 一些 PIP、TIP和NIP没有严格的水分专
专题介绍 Special Topics
植物生理学通讯 第 46卷 第 5期, 2010年 5月494
一性, 它们也能通透中性小分子或气体(Maurel等
1993; Rivers等 1997)。
1.3 水分和溶质运输的分子机制 水通道蛋白的选
择性主要来源于排阻效应, 由以下 3个因素决定。
第 1个因素是NPA序列。分子动力学模拟实验表
明, NPA序列的Asn可以在孔道内与水分子发生反
应, 使其极化并重新定向(de Groot等 2003)。第 2
个因素是Ar/R (aromatic/Arg)结构。它位于细胞质
侧的通道口, 由4个Arg和芳香族氨基酸残基组成,
不仅可使通道具有立体构象, 而且Arg残基可对质
子产生静电排斥(Fujiyoshi等 2002)。第 3个因素
是弱相互作用。当溶质进入孔道后, 可与孔道内氨
基酸侧链形成氢键和疏水作用, 造成空间位阻。譬
如, 拟南芥AtNIP6;1对水分的渗透性较低, 对尿素
则很高。如果将NIP的Ala119用 Trp替换后, 孔
道结构即发生改变, 对水的渗透性增强, 但却不能
透过尿素(Robinson等 1996)。
2 水通道蛋白的调控机制
2.1 结构修饰
水通道在植物细胞膜中含量丰富、疏水性
强。因此, 相对于其他膜蛋白而言, 它更易于生化
分析(Niemietz和 Tyerman 2002)。通过质谱和膜
蛋白组学分析证实, 水通道蛋白具有多种结构修饰,
包括翻译修饰和翻译后修饰(Santoni等2003, 2006;
Nühse等 2004; Daniels和 Yeager 2005)。
同位素标记、质谱分析和免疫分析的实验证
明, 在菜豆种子 PvTIP3;1、大豆根瘤 GmNOD26
和菠菜叶 SoPIP2;1的N-、C-末端 Ser上发生了磷
酸化反应(Maurel等 2002)。在AtPIP2;1的 B环上
有1个保守的磷酸化位点, 在C-末端有多个相邻且
相互依赖的磷酸化位点(如 S er 2 8 0、S er 2 8 3 )
(Johansson等 1996, 1998; Santoni等 2003, 2006)。
菠菜 SoPIP2的 B环 Ser119也是磷酸化位点。此
外, 拟南芥质膜AtPIP2;1的N-末端起始Met残基
在翻译过程中被切除, 但AtPIP1;1的Met残基则被
乙酰化(Santoni等 2006)。再有, PIP2在N-末端相
邻位置发生甲基化, 如AtPIP2;1分别在 Lys3位点
和Glu6位点上发生 2次和 1次甲基化。虽然 Lys
甲基化也存在于组蛋白中, 但Glu甲基化在真核生
物中却极为罕见(Santoni等 2003, 2006)。尽管水
通道蛋白的糖基化修饰并不常见, 但在GmNOD26
和一些植物TIP中发现了糖基化, 它是水通道蛋白
在膜转运过程中亚细胞定位所必需的(Daniels和
Yeager 2005)。
2.2 门控机制
2.2.1 磷酸化 早在认识植物水通道蛋白功能之前,
人们就发现在 PvTIP3;1的 N-端以及 SoPIP2;1、
GmNOD26的C-端Ser残基都是磷酸化位点, 其磷
酸化由Ca2+依赖的蛋白激酶催化(Johnson和Chrispeels
1992; Weaver和 Roberts 1992)。以后, 用质谱和放
射性标记技术先后在拟南芥和玉米中证实了磷酸化
现象(Chaumont等 2005)。除N-或 C-末端 Ser外,
在细胞质侧第1个NPA基序元附近B环Ser也可被
磷酸化。该 Ser在所有 PIP和一些 TIP中是保守
的, 位于Arg/X-Lys-X-Ser-X-Arg序列中, Ca2+依赖
的蛋白激酶可识别此序列(Johansson等 1996)。
通常认为水通道蛋白的磷酸化是细胞信号转
导与水分运输调节的中介。已证明在所有植物
P IP 的 B 环上都存在磷酸化的位点(Tör nr o t h-
Horsefield等 2006; Johansson等 1996), 通过磷酸化
途径, 可以直接、快速、可逆地实现植物水通道
蛋白的门控调节(Johansson等1998)。通过Western
blot技术, 用小麦 PIP2中含磷酸化 Ser多肽制备的
抗体可以识别玉米提取物中的 PIP2。如果将该提
取物中 PIP2 用磷酸酶处理后, 则抗体不能识别
(Azad等 2004)。在爪蟾卵母细胞的异源表达系统
中, 以Ala替代 Ser, 可降低 SoPIP2;1和 PvTIP3;1
的水通道活性(Johansson等1998); 加入蛋白激酶A
的激活剂 cAMP, 增强了 PvTIP3;1的水通道活性
(Maurel等 1995); 加入磷酸酶抑制剂冈田酸, 同样
可增加SoPIP2;1和GmNOD26的活性(Johansson等
1998; Guenther等 2003)。此外, Törnroth-Horsefield
等(2006)在研究菠菜叶片植物水通道蛋白晶体结构
变化后发现, 干旱胁迫使SoPIP2;1的2个保守的丝
氨酸位点(Ser115和 Ser274)脱磷酸化, 导致水通道
处于关闭状态, 从而阻止了胞内水分流失。
SoPIP2;1是目前唯一已知原子结构的植物水
通道蛋白。当 SoPIP2;1孔道处于关闭状态时, D
环通过离子键和 H 键锚定在 N- 末端尾部, 其上
Leu197残基可作为疏水性栓塞在孔道的细胞质入
口处堵塞孔道, 进而阻止水分子运输。但是, 当 B
环 Ser115残基或D环 C-末端 Ser274残基磷酸化
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后, 破坏了该残基与相邻亚基D-环上氨基酸残基之
间所形成的氢键, 改变了 helix 5和D环的构象, 使
L eu 1 9 7 残基从孔道移出, 从而迫使孔道打开
(Törnroth-Horsefield等 2006)。
2.2.2 pH和二价阳离子 游离Ca2+和 /或低pH可降
低拟南芥悬浮细胞或根细胞质膜的水分通透性
(Alleva等 2006; Gerbeau等 2002)。pH值对门控的
调节机制在于它能使D环His193质子化, 导致其与
N-末端Asp28紧密连接, 有助于锁定孔道关闭状
态。在爪蟾卵母细胞中, 当细胞质 pH值从 7.0下
降到 6.0后, 拟南芥AtPIP2;1、AtPIP2;2、AtPIP2;
3和AtPIP1;2均关闭孔道。研究表明, AtPIP2;2的
D环His193残基在pH感受和门控调节中起关键作
用。以Ala替代His197, 减少了细胞质酸化对孔道
的影响(Tournaire-Roux等 2003)。AtPIP2;2在细胞
质侧不仅有酸性的N-末端(pI 3.8), 还有大量碱性
氨基酸, 使该侧膜表面带负电荷。当细胞质 pH 为
7.0时, 孔道处于开放状态, 所有His残基不带电荷;
当细胞质酸化(pH 6.0)后, His197和暴露于细胞质
的其他His残基全部质子化, 带正电荷。值得一提
的是, His103在内在膜蛋白中高度保守, 是孔道的
关键部分; 而His197和His264则在植物PIP中高度
保守。此时, D环折叠并堵塞孔道的细胞质口, 其
上 Lys190、Arg191、Arg194等碱性氨基酸残基
和质子化His197残基与酸性N-末端发生相互作用,
稳定D环构象, 保证孔道关闭。在AtPIP2;2的突
变体实验中, 突变体H197D始终保持孔道处于开放
状态, 而突变体H197K则使水分通道活力低下, 对
pH值不敏感。前者是由于负电荷Asp的存在干扰
了D环与带负电荷的N-末端之间的离子相互作用;
后者是由于带正电荷的Lys削弱了 pH值对D环与
N-末端之间相互作用的影响, 使孔道处于关闭状态
(Tournaire-Roux等 2003)。此外, 突变体 R194A和
D195A也降低了 pH敏感性, 但双突变体 R194A/
H197A和D195A/H197A则对 pH不敏感。由此可
见, 所有 PIP 的D环上都有保守的His残基, 它可
感受H+。虽然His197不是唯一的 pH感受位点, 但
它与Arg194和Asp195等氨基酸残基构成了水通道
蛋白的电荷网络系统, 并在稳定水通道关闭状态中
起关键作用(Tournaire-Roux 等 2003)。
一般认为, Ca2+和其他二价阳离子的调节机制
与H+相似。N-末端Asp28和Glu31是二价阳离子
的作用位点, 它们与二价阳离子结合后, 可稳定孔
道的关闭构象, 降低纯化质膜囊泡的水分运输活性
(Gerbeau等 2002)。拟南芥质膜的水分运输对Ca2+
不敏感, 其 Ca2+半抑制浓度为 50~100 μmol·L-1, 但
甜菜根质膜囊泡却很敏感, 其Ca2+半抑制浓度仅为
10 nmol·L-1 (Alleva等 2006; Gerbeau等 2002)。但
也有研究表明, Ca2+的调控机制与 pH不同。它通
过钙调蛋白与 C-末端结合, 识别孔道周围水分子,
从而限制水流通过(Németh-Cahalan和Hall 2004)。
比较拟南芥野生型和突变体AtPIP2;2的水分通道
活性, 有助于阐明 Ca2+依赖的通道关闭的分子机
制。此外, 有研究指出在水分和温度等环境胁迫下
游离 Ca2+通过直接抑制水通道蛋白而降低水分运
输活性(Maurel 2007), 但由盐胁迫诱导的水分运输
抑制则可被 Ca2+解除, 表明存在复杂的调节机制
(Cabańero等 2006)。
2.2.3 其他调节机制 用压力探针研究轮藻细胞膜
渗透性, 发现增加溶质体积和渗透压, 降低水分通
道活性, 表明内聚力 /张力是高浓度溶质存在下水
通道蛋白门控调控的另一机制(Ye等 2004)。根据
这一模型, 当溶质从孔道中排除时, 会在孔道中产
生负压张力, 导致蛋白质变形, 最终关闭孔道(Maurel
等 1995)。同样, 在轮藻细胞中还发现, OH-也可
诱导不可逆的水分运输抑制, 表明氧化作用也参与
了水通道蛋白的门控机制(Alleva等 2006)。
在玉米幼根中还发现一种门控的机械抑制机
制(Wan等 2004)。用压力探针研究膨压脉冲对皮
层细胞膜水分传导率的影响, 当压力小于 0.2 MPa
时, 产生可逆的水分传导抑制; 继续增加压力, 则造
成不可逆抑制, 除非有 ABA存在。由此可见, 植
物可利用能量输入和张力调节的门控机制来感受膨
压和周围水分的变化。水分在通过孔道时会造成
孔道构象变化, 其大小受水流速度影响。ABA可
直接连接孔道, 快速进行水通道蛋白门控的正调节,
从而保证膜水分渗透性。由于计算机模拟结果表
明水通道蛋白能忍受超高水压和渗透压, 因此, 该
模型需要得到进一步实验证实。
已有研究发现重金属、营养元素、温度和活
性氧等因子都可影响水通道蛋白活性(Chaumont等
2005; Lee等2004; Niemietz和Tyerman 2002)。Hg2+
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可与孔道口 Cys结合, 从而抑制水通道蛋白活性。
除此之外, 其他因子调控的分子机制仍不清楚。
2.3 膜转运调控
不同的植物水通道蛋白分布在不同膜上。采
用免疫化学和GFP融合蛋白表达技术发现, 大多数
PIP和 TIP分别定位在质膜和液泡(或囊泡)膜上
(Reisen等 2003), NIP存在于非豆科植物的质膜和
细胞内膜中(Johanson等 2001), 3种拟南芥 SIP则
存在于内质网中(Sakurai等 2005)。此外, 一些通
道蛋白在细胞中的分布较复杂。例如拟南芥质膜
PIP1也存在于由质膜内陷形成的质膜体(plasmalem-
masome)中, 它可加速质外体与液泡间的水分交
换(Robinson等 1996)。在拟南芥子叶中也可见
AtTIP1;1存在于液泡的亚结构中(Saito等 2002)。
玉米 ZmPIP1;2和 ZmPIP2;5不仅存在于质膜上, 而
且存在于细胞内膜和核周组分中, 它们可能是分泌
系统中 PIP运输的不同阶段(Chaumont等 2000)。
松叶菊水通道蛋白的定位也很复杂, McPIP2;1存在
于质膜, 而McPIP1;4却存在于液泡膜和其他中密
度组分中(Kirch等 2000; Vera-Estrella等 2004)。对
质膜水通道蛋白定位分析表明, 在植物中存在3种
不同类型液泡膜, 与其上 TIP类型相吻合(Jauh等
1999)。
大量研究表明, 水通道蛋白的膜转运是水通道
蛋白调节的重要机制。在根中, 该转运过程在盐胁
迫 1 h后即被诱导(Boursiac等 2005)。同样, PIP
的定向转运也见于环境胁迫后的更长时间(Maurel
2007)。低渗胁迫可诱导松叶菊McTIP1;2重新定
位, 从液泡膜组分转运到较高密度的内体(endosome)
组分。该转运过程为膜运输抑制剂所抑制, 与水通
道蛋白的糖基化有关(Vera-Estrella等 2004)。事实
上, 糖基化是水通道蛋白的定向转运及靶向膜插入
的关键, 它可能是植物水通道蛋白的另一个调节机
制(Hendriks等 2004; Vera-Estrella等 2004)。
此外, 磷酸化也是调节水通道蛋白膜转运的一
种方式。加压素(antidiuretic hormone, ADH)可提
高细胞内 cAMP水平, 继而激活蛋白激酶 A, 使
AQP2的 Ser256磷酸化, 启动AQP2囊泡与质膜融
合, 最终增加膜的通透性(Maurel等 2008)。
2.4 异源四聚体调控(heteromerization)
水通道蛋白四聚体的组装对于蛋白的折叠、
稳定以及膜向定位转运至关重要。在植物质膜上,
PIP1和PIP2共同调节水分通道(Martre等2002)。在
爪蟾卵母细胞表达系统中, 植物PIP1不能表达水通
道活性, 部分原因是它不能被运输到质膜上。如果
共表达 PIP1和 PIP2, 则可形成异源四聚体, 加速
PIP1的膜转运(Suga和Maeshima 2004; Zelazny等
2007)。Temmei等(2005)研究了含羞草 PIP1和 PIP2
的功能, 指出 B环磷酸化是 PIP1调节的关键, 但它
对 PIP1和 PIP2间的相互作用没有影响。只有当
PIP1和PIP2共表达时, PIP1的磷酸化才能促进水分
运输。在拟南芥PIP1和 PIP2的反义抑制实验表明,
它们作用于相同的水分运输单位(Fetter等 2004)。
使用不同的 ZmPIP进行共表达实验发现, 当
ZmPIP1;1与 ZmPIP1;2各自表达时, 通道活性均不
高, 但当其共表达后, 活性增加, 表现出协同效应,
可能是蛋白的质膜定向位移得到加强的结果(Fetter
等 2004)。该效应也见于 ZmPIP1;2与ZmPIP2;5的
共表达, 但在未见于 ZmPIP1;1与 ZmPIP2;5的共表
达。突变体 ZmPIP1;1LE是具有 ZmPIP1;2的 E环
结构的ZmPIP1;1, 其E环的4个氨基酸残基被替换
(V246I、Q250R、H251D和A255N)。研究表明,
ZmPIP1;1LE在共表达系统中失去了 ZmPIP1;1的
特征, 而表现出 ZmPIP1;2的行为(Fetter等 2004)。
此外, 用同源模型比较 ZmPIP1;1、ZmPIP1;1LE、
ZmPIP1;2和ZmPIP2;5的结构, 发现V246I位于HE
(hemi-helix E)尾部, 并朝向脂双层, 由于氨基酸的疏
水侧链较大, 可以将HE挤压到孔道中; Q250R和
H251D位于E环中部, 它们使水通道蛋白表面带上
相反的电荷, 可相互或与相邻极性氨基酸侧链形成
离子键; A255N位于 helix 6的N-端, 由于非极性
氨基酸被分子量较大的极性氨基酸所取代, 其侧链
更易于暴露于溶剂中。由此可见, E环在将多亚基
结构变化信息从 helex 6传递到NPA HE上起重要
作用, 它要么通过改变NPA HE结构影响通道活性,
要么通过改变 helix 6结构影响通道蛋白的聚合
(Maurel等 2008)。
3 结语
水通道蛋白是细胞间和细胞内水分运输的主
要通道。水通道蛋白的调控是植物保持细胞水分
稳态和对环境胁迫快速响应的重要途径, 因此, 深
入研究水通道蛋白运输及其活性调节有助于增强对
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植物水分运输整合机制的认识。细胞膜上植物水
通道活性的调节涉及到很多不同的机制。除基因
表达调控外, 水通道蛋白参与水分和中性小分子的
跨膜流动过程还受到结构修饰、门控、膜转运和
异源四聚体等各种机制的调控。近年来在这些方
面的研究取得了很大进展, 初步建立了 PIP水通道
蛋白的门控调节模型, 鉴定了一些必需氨基酸残基
和一些结构基序, 但是, 水通道蛋白开闭的分子机
制仍未完全阐明, 对水通道蛋白原子结构的分析及
其门控构象的精确调控机制、异源四聚体亚基间
的相互作用及其生理作用、蛋白磷酸化介导的水
分运输调节机制以及水通道蛋白在植物细胞、组
织和器官等层次的表达等方面均缺乏足够认识, 均
有待于进一步深入研究。
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