全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (2): 221~226　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0495 221
收稿 2014-11-07　　修定 2015-01-21
资助 国家自然科学基金 (31260169)、国家自然科学基金
(31260064)和云南师范大学研究生科研创新基金。
* 同等贡献。
** 通讯作者(E-mail: gongming6307@163.com; Tel: 0871-
65941370)。
外源ABA对低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸积累及其代谢途径的影响
邓凤飞*, 杨双龙*, 龚明**
云南师范大学生命科学学院, 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心, 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室,
昆明650500
摘要: 本文以小桐子为材料, 研究了外源脱落酸(ABA)对低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸积累的影响。结果表明, 低温胁迫(5
℃)可促进小桐子幼苗体内脯氨酸的积累, 上调脯氨酸合成关键酶Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸转氨酶(OAT)的
活性, 上调P5CS基因(JcP5CS)的表达, 及抑制脯氨酸降解酶脯氨酸脱氢酶(ProDH)的活性。用外源ABA处理低温胁迫下的
小桐子幼苗, 发现150 μmol·L-1的ABA可显著提高其低温胁迫下的脯氨酸含量, 上调P5CS的活性和JcP5CS的表达水平, 及抑
制ProDH的活性。表明外源ABA可通过活化脯氨酸合成的谷氨酸途径和抑制脯氨酸的降解途径来促进低温胁迫下小桐子
幼苗脯氨酸的积累。
关键词: 小桐子; 低温胁迫; 脱落酸; 脯氨酸; 代谢途径
Effect of Exogenous Abscisic Acid on Proline Accumulation and Metabolic
Pathways in Jatropha curcas Seedlings under Cold Stress
DENG Feng-Fei*, YANG Shuang-Long*, GONG Ming**
Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province, Engineering Research Center of Sus-
tainable Development and Utilization of Biomass Energy, Ministry of Education, School of Life Sciences, Yunnan Normal Univer-
sity, Kunming 650500, China
Abstract: Jatropha curcas seedlings were used as materials to study the effect of exogenous abscisic acid
(ABA) on proline accumulation under cold stress. The results showed that cold stress (5 ℃) led to a significant
accumulation of proline in J. curcas seedlings. It also induced a rapid increase of activities of the key enzymes
Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) and ornithine aminotransferase (OAT) of proline biosynthesis,
and an up-regulation of P5CS gene (JcP5CS) expression, and a decrease of the activity of the key enzyme pro-
line dehydrogenase (ProDH) of proline degradation. Treatment with 150 μmol·L-1 abscisic acid (ABA) could
enhance the accumulation of proline in J. curcas seedlings under cold stress. ABA also increased the activity of
P5CS, and improved the expression level of JcP5CS. Furthermore, the ABA treatment decreased the activity of
ProDH in J. curcas seedlings under cold stress. These results showed that the ABA-induced proline accumula-
tion in the J. curcas seedlings under cold stress might be a combined result of the activation of glutamate path-
ways of proline biosynthesis and inhibition of proline degradation pathway.
Key words: Jatropha curcas; cold stress; abscisic acid; proline; metabolic pathways
小桐子又名小油桐、麻疯树等, 是大戟科麻
疯树属重要的资源植物, 广泛分布于世界热带地
区, 在中国主要分布于云南、四川、海南等地(欧
文军等2008; 代勋等2012)。小桐子种子含油量在
40%~60%, 是理想的可再生石油植物, 此外, 小桐
子耐贫瘠、生物产量大, 是绿化荒山, 保持水土等
的良好树种(Openshaw 2000; King等2009)。作为
一种耐热喜温的植物, 小桐子对低温伤害非常敏
感(Maes等2009; Carels 2009)。Maes等(2009)进行
的调查表明 , 小桐子适宜生长的年平均温度为
19.3~27.2 ℃, 最低月均温度要高于10.5 ℃。低温
严重影响小桐子的存活和生长, 如2008年中国南
方的特大雨雪冰冻低温给贵州小油桐产业造成了
巨大损失: 海拔600 m以上的1~3年生苗木受害率
植物生理学报222
达100%, 海拔725 m以上的则全部被冻死(陈波涛
等2008)。因此, 如何提高小桐子对低温的适应性
已成为一个亟待解决的问题。
低温会造成细胞失水, 同时也会诱导植物产
生相应的渗透调节物质以适应胁迫环境(Thakura
等2010)。在众多渗透调节物质中, 脯氨酸被认为
是分布最广泛的渗透保护物质。干旱、高温和低
温等胁迫下大量积累的脯氨酸可有效提高植物对
逆境胁迫的耐受性(Trovato等2008; Szabados和
Savoure 2010)。目前, 植物体内脯氨酸的代谢途径
已基本清楚, 对影响植物体脯氨酸含量的因素也有
了较清晰的认识。一般认为, 脯氨酸有两条合成途
径——谷氨酸(glutanate, Glu)途径和鸟氨酸(ornithine,
Orn)途径, Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-
carboxylate synthetase, P5CS)是谷氨酸合成途径的
关键酶, 而调节鸟氨酸途径的核心关键酶是鸟氨酸
转氨酶(ornithine-δ-aminotransferase, OAT) (Kishor
等2005; Ashraf和Foolad 2007; Trovato等2008)。脯氨
酸的降解则由脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase,
ProDH)控制, 它将脯氨酸降解为P5C (Kishor等
2005; Ashraf和Foolad 2007)。已有研究表明, 低温
胁迫可诱发植物体内脯氨酸的大量积累, 且脯氨
酸的积累与植物的耐寒性呈正相关(Kishor等2005;
Ashraf和Foolad 2007; Trovato等2008)。虽然脯氨
酸积累在植物适应低温胁迫中的作用已得到证实,
但是低温胁迫诱发脯氨酸积累的机制尚不清楚。
已有研究证实, ABA的含量和脯氨酸合成之
间成正相关关系(Costa等2011)。赵纪东等(2006)研
究发现, ABA溶液处理可显著提高正常或胁迫下小
麦幼苗的游离脯氨酸含量。于晶等(2008)的研究
结果表明, 外源ABA处理能促进‘东农冬麦1号’体
内脯氨酸的积累, 从而增强其细胞的持水能力。
一些研究表明, 某些物质, 如信号分子NO、
H2O2、ABA和Ca
2+等均参与了逆境胁迫下脯氨酸
积累的调控过程(Trovato等2008; Yang等2009; 杨
双龙和龚明2009; Szabados和Savoure 2010)。本文
采用外源ABA处理低温胁迫下的小桐子幼苗, 研
究了ABA对低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸含量以
及脯氨酸代谢关键酶活性和P5CS基因表达的影
响, 试图初步阐明低温胁迫下ABA诱发小桐子幼
苗脯氨酸积累的机理, 为下一步阐明小桐子的抗
冷性机理提供借鉴。
材料与方法
1 材料及培养
小桐子(Jatropha curcas L.)种子采收自云南省
元谋县, 以1% (W/V)的硫酸铜溶液消毒30 min, 浸
种18 h后, 播种在垫有6层湿滤纸的白磁盘中。25 ℃
下暗萌发7 d后, 将萌发均匀的种子置于1/2Hogland
营养液、25 ℃/20 ℃ (昼/夜)、16 h (光照强度300
μmol·m-2·s-1)、75%相对湿度的人工气候箱中砂培
生长14 d。
2 低温胁迫
将上述培养21 d的小桐子幼苗置于添加不
同浓度(0、50、100、150、200和250 μmol·L-1)
ABA的1/2Hogland营养液中, 在16 h (光照强度300
μmol·m-2·s-1)、75%相对湿度的人工气候箱中低温
(5 ℃)胁迫4 d, 对照为25 ℃, 之后测定相关指标, 每
个处理180株。
3 测定方法
3.1 脯氨酸含量及其代谢关键酶活性的测定
实验测定时取幼苗的叶片(幼苗高约10 cm)。
脯氨酸含量按酸性茚三酮法测定(Bates等1973)。
P5CS的活性测定参照我们之前的方法(杨双龙和
龚明2009), 以单位时间内NADPH氧化量表示酶活
性。OAT和ProDH活性测定参考Sanchez等(2001)
的方法, OAT活性以单位时间内NADH氧化量表
示, ProDH活性以单位时间内NADP+消耗量表示。
蛋白质的测定按照Bradford (1976)的方法进行, 以
牛血清蛋白为标准样品。
3.2 RNA提取和RT-qPCR
总RNA提取采用TaKaRa公司的RNAiso for
Polysaccharide-rich Plant Tissue试剂盒。JcP5CS
(GenBank登录号为GU358610)基因的表达采用
ABI 7500 Fast Real-Time PCR实时荧光定量PCR
仪检测 , 以小桐子Act in (GenBank 登录号为
HM044307)基因为内参。JcP5CS的5端引物为5
GGCAGATGGACTCCTGTTAGA 3, 3端引物为5
TTTCATTTGACCGCTTGGC 3, 扩增片段大小为
164 bp; Actin的5端引物为5 GTGTTATGGTTGG-
GATGGGT 3, 3端引物为5 AAGCACTGGGT-
GTTCCTCTG 3, 扩增片段大小为188 bp。
邓凤飞等: 外源ABA对低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸积累及其代谢途径的影响 223
RT-qPCR的操作按照TaKaRa公司的One Step
SYBR® PrimeScript™ RT-PCR Kit II试剂盒说明书
进行。采用2–ΔΔCT法对目标基因进行相对定量的差
异表达分析(Livak和Schmittgen 2001)。
4 数据处理
所有实验数据至少来源于3次独立实验的结
果, 每次独立实验有2个平行重复。实验数据采用
SPSS13.0进行方差分析, 不同的小写字母表示不同
处理间差异达到P<0.05水平。统计结果用Sigma-
plot 10.0作图, 图中的数据均为平均值±标准误。
实验结果
1 不同浓度ABA对低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸
含量的影响
为了确定适宜的ABA处理浓度, 分别用0、
50、100、150、200和250 μmol·L-1的ABA溶液处
理小桐子幼苗4 d, 并对幼苗脯氨酸含量变化进行
了测定。结果如图1所示, 随着ABA浓度的增加,
低温胁迫下小桐子幼苗体内的脯氨酸含量迅速上
升。当ABA浓度为150 μmol·L-1时, 脯氨酸含量达
到最高, 与未经ABA处理的幼苗相比, 脯氨酸含量
上升了37.6% (P<0.01)。之后随着ABA浓度的增
加, 脯氨酸含量呈降低趋势, 但仍显著高于未经
ABA处理的幼苗。此外, 可以看出在常温情况下,
不同浓度的ABA处理对小桐子幼苗的脯氨酸含量
没有显著影响。综合考虑 , 我们最终选用150
μmol·L-1的ABA溶液来处理小桐子幼苗, 因为这个
浓度诱导脯氨酸积累的效应最好。
之后, 本文研究150 μmol·L-1 ABA处理4 d对小
桐子幼苗脯氨酸含量变化的影响。由图2可知, 低
温胁迫下小桐子幼苗的脯氨酸含量呈逐渐上升趋
势, 与对照相比, 低温胁迫4 d可使小桐子幼苗的脯
氨酸含量上升213.3% (P<0.01); 150 μmol·L-1 ABA
处理4 d能显著增加低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸
的积累(P<0.05), 表明适宜浓度的外源ABA可促进
低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸的积累。
2 ABA对低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸代谢关键
酶活性的影响
P5CS和OAT分别是脯氨酸合成的谷氨酸途径
和鸟氨酸途径的关键酶(Kishor等2005; Ashraf等
2007; Trovato等2008)。结果(图3)表明, 5 ℃低温胁
迫能大幅上调P5CS的活性, 其中处理0~3 d的上升
速度较快, 3 d后上升幅度减缓, 4 d内小桐子幼苗的
P5CS活性上升了75.3% (P<0.01)。150 μmol·L-1 ABA
处理可进一步上调低温胁迫下P5CS的活性(P< 0.01)。
图4显示, 5 ℃低温胁迫能显著增强OAT的活
性, 4 d内小桐子幼苗的OAT活性上升了102.9% (P<
0.01)。但是, 150 μmol·L-1 ABA处理对低温胁迫下
小桐子幼苗的OAT活性变化影响不大(P>0.05)。
图1 不同浓度ABA对低温胁迫下小桐子
幼苗脯氨酸含量的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of ABA on proline
contents of J. curcas seedlings under cold stress
不同小写字母表示不同处理间差异达到P<0.05水平, 下图同此。
图2 ABA对低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸含量的影响
Fig.2 Effect of ABA treatment on proline contents of
J. curcas seedlings under cold stress
植物生理学报224
植物体内脯氨酸的积累还依赖于降解途径, 控
制降解途径的关键酶是ProDH (Kishor等2005; Ashraf
和Foolad 2007)。低温胁迫可显著降低ProDH的活
性。与对照相比, 5 ℃胁迫4 d可使小桐子幼苗的
ProDH活性下降40.9% (P<0.01), 而150 μmol·L-1 ABA
可使下降幅度达60.6% (P<0.01) (图5), 说明外源ABA
可抑制低温胁迫下小桐子幼苗的ProDH活性。
3 ABA对低温胁迫下小桐子幼苗JcP5CS基因表达
的影响
研究表明, 植物体中, 逆境胁迫诱导的脯氨酸
积累与P5CS基因的转录活化密切相关(Trovato等
2008; Yang等2009)。结果(图6)表明, 低温可大幅
上调小桐子JcP5CS基因的表达, 与25 ℃培养的幼
苗相比, 经5 ℃胁迫4 d的小桐子幼苗JcP5CS的表
达上调了2.28倍(P<0.01)。150 μmol·L-1 ABA处理
可进一步上调低温胁迫下JcP5CS的表达水平
(P<0.01), 表明ABA可促进低温胁迫下小桐子幼苗
JcP5CS基因的表达。
图3 ABA对低温胁迫下小桐子幼苗P5CS活性的影响
Fig.3 Effect of ABA treatment on P5CS activities of
J. curcas seedlings under cold stress
图4 ABA对低温胁迫下小桐子幼苗OAT活性的影响
Fig.4 Effect of ABA treatment on OAT activities of
J. curcas seedlings under cold stress
图5 ABA对低温胁迫下小桐子幼苗ProDH活性的影响
Fig.5 Effect of ABA treatment on ProDH activities of
J. curcas seedlings under cold stress
图6 ABA对低温胁迫下小桐子幼苗JcP5CS基因表达的影响
Fig.6 Effect of ABA treatment on the expression of JcP5CS
gene in J. curcas seedlings under cold stress
邓凤飞等: 外源ABA对低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸积累及其代谢途径的影响 225
讨　　论
脯氨酸被认为是分布最广和最重要的渗透调
节保护物质(Trovato等2008; Szabados和Savoure
2010)。已有不少研究表明, 低温胁迫可大幅提高
植物体内脯氨酸的含量(Ashraf和Foolad 2007; Tro-
vato等2008; Habibi等2011; Azymi等2012)。然而,
低温导致脯氨酸积累的具体机理还不清楚。本文
的结果显示, 低温胁迫可促进小桐子幼苗体内脯
氨酸的积累, 且这种积累作用是低温胁迫上调了
脯氨酸合成关键酶P5CS和OAT的活性, 上调了
P5CS基因(JcP5CS)的表达水平及抑制了脯氨酸降
解酶ProDH活性的综合结果(图 1~6)。
许多物质, 如聚乙二醇、ABA、Ca2+、Cd2+、
NO和H2O2等均可诱发植物体内脯氨酸的积累
(Ruan等2004; Ahmad等2007; Trovato等2008; 杨双
龙和龚明2009; 文锦芬等2011), 暗示着脯氨酸的积
累受到诸多因素的调控和涉及较复杂的信号转导
过程。ABA作为胁迫激素在感受温度胁迫信号、
提高植物的抗冷性中起着重要作用(于晶等2008;
Popko等2010)。
近年来已有一些研究显示, ABA可提高低温
胁迫下植物体内脯氨酸的水平, 但不清楚其具体
机理 (赵纪东等2006; 于晶等2008; Costa等2011)。
本文的结果表明, 150 μmol·L-1的ABA可显著提高
低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸的含量, 上调谷氨
酸途径关键酶P5CS的活性和JcP5CS基因的表达水
平, 并抑制了降解酶ProDH的活性(图2、3、5和
6)。但是, ABA处理对鸟氨酸合成途径关键酶OAT
的活性无显著影响(图4)。这些结果表明ABA参与
了低温胁迫下小桐子幼苗脯氨酸积累的调控过程,
且ABA通过活化脯氨酸合成的谷氨酸途径和抑制
脯氨酸的降解途径促进了低温胁迫下小桐子幼苗
脯氨酸的积累, 而对脯氨酸合成的鸟氨酸途径则
无显著影响。
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