全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (10): 1729~1734　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0254 1729
收稿 2015-05-12　　修定 2015-08-25
资助 海南省科学事业费项目(kyys-2013-12)。
* 通讯作者(E-mail: yyong3819@163.com; Tel: 189075903361)。
黄花马铃苣苔的离体培养与快速繁殖
潘梅, 黄赛, 戚华莎, 王景飞, 云勇*
海南省农业科学院热带园艺研究所, 海口571100
摘要: 本文对黄花马铃苣苔进行离体培养与快速繁殖技术研究。结果表明, 黄花马铃苣苔叶片外植体的最适初代诱导培养
基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA, pH值为6.5。最适继代增殖培养基为MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA, 培养
30 d的增殖系数为7.30。最适生根培养基为MS+0.5 mg·L-1 IBA, 生根率100%。对生根组培苗进行移栽, 成活率最高达
91.43%。
关键词: 黄花马铃苣苔; 叶片; 离体培养
In Vitro Culture and Rapid Propagation of Oreocharis flavida
PAN Mei, HUANG Sai, QI Hua-Sha, WANG Jing-Fei, YUN Yong ∗
Tropical Horticulture Research Institute of Hainan Academy of Agricultural Sciences, Haikou 571100, China
Abstract: We investigated in vitro culture and rapid propagation of Oreocharis flavida. The optimal medium
for bud induction from leaves was MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA (pH 6.5). The optimal medium for
subculture of bud multiplication was MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA, and the proliferation coefficient
was 7.30 at 30 d. The optimal rooting medium was MS+NAA 0.5 mg·L-1, the rooting rate was 100%. The root-
ing plantlets were transplanted in the matix and the highest survival rate was 91.43%.
Key words: Oreocharis flavida; leaf; in vitro culture
苦苣苔科植物为热带特有植物, 具有多重观
赏特性, 兼观花、观叶、观形一体, 可选育出不同
园林应用的类型, 是现代园林建设的重要组成部
分, 也可作为家居美化绿化的特殊种类。黄花马
铃苣苔是苦苣苔科马铃苣苔属多年生草本植物,
为海南特有种和珍稀野生花卉, 分布于海南的保
亭、乐东、定安、白沙、陵水、东方和琼海7县
市(李桭宇和王印政2005)。其株型紧凑, 叶全部基
生, 具长柄; 叶片卵形至宽卵形; 花序聚伞状, 每花
序具3~4花; 花冠斜钟状, 淡黄色, 观赏价值高, 是
极好的盆栽花卉材料, 也非常适合作为阴生地被
植物应用于园林绿地(史佑海等2011)。有关野生
苦苣苔科植物的组织培养已有一些报道, 其中付
传明等(2010)利用桂林唇柱苣苔叶片诱导出再生
植株。汤正辉等(2005a, b)对台闽苣苔和异裂苣苔
的幼叶诱导愈伤组织继而分化出不定芽获得再生
植株。黄宁珍等(2010)对桂林小花苣苔的叶片离
体培养获得再生芽。韦啸等(2011)以三苞唇柱苣
苔带腋芽花梗为外植体, 研究了不定芽诱导、增
殖和生根技术, 组培苗移载成活率达到95%。康冼
华等(2014)以文采唇柱苣苔肉质叶作为外植体, 建
立起再生植株快速繁殖体系。目前对黄花马铃苣
苔的研究只有资源的分布与评价方面, 其组织培
养与快速繁殖的研究尚未见报道, 马铃苣苔属植
物组织培养与快速繁殖研究也未见有报道。本研
究以黄花马铃苣苔叶片作为外植体诱导不定芽,
进而对不定芽的增殖和生根以及幼苗移栽管理技
术进行研究, 以期建立黄花马铃苣苔的离体快速
繁殖技术, 为其应用繁殖和保护提供技术保障。
材料与方法
1 试验材料
所用植物材料黄花马铃苣苔(Oreocharis flavida
Merr.)采自海南省保亭县, 取叶片作为外植体。
2 试验方法
2.1 外植体消毒
剪取黄花马铃苣苔中上部健康叶片, 用棉花
球醮洗洁精液擦拭叶片两面, 然后用自来水清洗
干净。在超净工作台上用70%酒精浸泡20 s, 0.02%
HgCl2溶液消毒3 min, 无菌水漂洗3次, 最后用2%
植物生理学报1730
NaClO消毒15 min, 无菌水漂洗5次。
2.2 培养基制备
以MS为基本培养基, 根据实验目的添加不同
浓度的6-BA、KT、TDZ、NAA、IBA和IAA, 附
加30 g·L-1食用蔗糖和8 g·L-1卡拉胶, 灭菌前pH 6.5,
配制分装后, 于温度121 ℃灭菌20 min。
2.3 初代培养
将表面消毒好的叶片切除边缘组织, 切成1
cm×1 cm的小块, 以叶面朝上接种于初代培养基
MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA和MS+0.5
mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA中, 每袋接种1块, 接
种后每周观察1次, 记录材料生长情况, 及时清除
污染材料。
2.4 增殖培养
以MS+0.1 mg·L-1 NAA作为基本培养基, 分别
添加0.5 mg·L-1的6-BA、KT和TDZ 3种细胞分裂
素, 筛选适宜增殖培养的细胞分裂素。
以MS作为基本培养基, 设置6-BA 0.1、0.5、
1.0、2.0 mg·L-1和NAA 0.1、0.2、0.3、0.5 mg·L-1
各4个浓度水平的配比, 共16种处理, 筛选增殖培
养最佳生长调节剂组合。将生长状况、大小基本
一致的芽团接入培养基, 每袋接种3块材料, 每种
处理接种10袋, 重复3次, 定期观察记录, 培养30 d
后统计不定芽增殖系数。
2.5 生根培养
以MS作为基本培养基, 设置NAA、IBA和
IAA各0.5 mg·L-1, 筛选适宜组培苗生根的生长素。
在MS培养基中添加不同浓度 (0.2、0.5、
0.8、1.0和1.5 mg·L-1)的IBA, 以不加IBA的培养基
作为对照, 筛选适宜组培苗生根的最佳IBA浓度。
将高约1.5 cm的继代增殖苗从基部切下接入培养
基, 每袋接种3个材料, 每种处理接种10袋, 重复3
次, 定期观察记录, 30 d后统计生根率和生根数。
2.6 培养条件
材料接种后, 在光照强度40 μmol·m-2·s-1的光
照下培养, 光照时间9 h·d-1, 温度(26±2) ℃。
2.7 生根苗移栽
将根系发达和生长良好的袋苗移入拱棚内炼
苗7 d, 从培养袋中取出小苗, 用清水洗净根部附着
的培养基, 栽植于珍珠岩、河沙、表土和珍珠岩:
河沙:表土(1:1:1) 4种基质中, 30 d后统计成活率。
2.8 数据处理分析
实验所得数据均用Excel 2007数据分析库进
行数据统计、方差分析, 新复极差法进行均数间
多重比较。
实验结果
1 黄花马铃苣苔的不定芽诱导
黄花马铃苣苔叶片外植体对HgCl2非常敏感,
较高浓度和较长的消毒时间, 叶片容易褐化死亡,
组合式消毒程序较单一消毒方法好, 污染率和褐
化率均较低。消毒成功的叶片培养15 d后, 叶片开
始膨大隆起, 面积增大近1倍; 20 d左右最先由叶片
边缘长出绿色的愈伤组织, 然后逐渐向叶面扩展
(图1-A); 继续培养至35 d时, 愈伤组织分化出小叶
片(图1-B); 50 d不定芽达到高峰, 在叶片边缘、主
叶脉基部和叶片的上下表面均分化出大量的不定
芽(图1-C)。
叶片外植体在培养基MS+0.1 mg·L-1 6-BA+
0.1 mg·L-1 NAA上诱导出愈伤组织的时间较晚, 21
d才有愈伤组织长出, 诱导出的再生芽较少, 生长
较好。而培养基MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1
NAA上的叶片外植体培养17 d就长出了愈伤组织,
诱导出的再生芽多且生长良好。因此, MS+0.5
mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA宜作为黄花马铃苣苔
初代诱导培养基。
2 不同细胞分裂素对黄花马铃苣苔不定芽增殖的
影响
从表1可以看出, 3种细胞分裂素对黄花马铃
苣苔不定芽的增殖影响极大。其中以6-BA的效果
最好, 诱导出的芽绿色健康, 生长速度快, 30 d增殖
系数达到6.77; KT的效果次之, 丛芽绿色, 生长也
较快, 增殖系数为6.00; TDZ不定芽的增殖效果差,
不定芽较细小, 略黄, 增殖系数只有5.18。3种细胞
分裂素对黄花马铃苣苔不定芽增殖系数的影响达
到极显著性水平, 因此, 宜选用6-BA进行不定芽的
增殖培养。
3 6-BA与NAA组合对黄花马铃苣苔不定芽增殖的
影响
由表2看出, 16种培养基对黄花马铃苣苔的芽
增殖效果不同, 增殖系数介于3.67~7.30。6-BA与
NAA没有表现出明显的规律性, 组合0.5 mg·L-1
潘梅等: 黄花马铃苣苔的离体培养与快速繁殖 1731
6-BA+0.5 mg·L-1 NAA的不定芽增殖系数最低, 只
有3.67; 6-BA和NAA均为0.1 mg·L-1时有最好的增
殖效应, 芽分化多, 培养30 d增殖系数最高, 达到
图1 黄花马铃苣苔的离体培养和快速繁殖
Fig.1 In vitro culture and rapid propagation of O. flavida
A: 叶片外植体培养20 d后诱导的愈伤组织; B: 培养35 d后分化的小芽; C: 培养50 d后分化的芽丛; D: 再生芽增殖; E: 生根苗; F: 移栽
成活小苗。
表1 不同细胞分裂素对黄花马铃苣苔不定芽增殖的影响
Table 1 Effects of different cytokinins on bud
propagation of O. flavida
细胞分裂素 增殖系数 芽的生长情况
6-BA 6.77Aa 芽绿色健康, 生长速度快
KT 6.00Bb 芽绿色, 生长速度较快
TDZ 5.18Cc 芽较细小, 略黄
　　同一列数据后不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05), 不
同大写字母表示差异达极显著水平(P<0.01)。下表同此。
7.30, 而且不定芽生长状态好, 叶片鲜绿, 生长均
匀, 苗高多为1 cm左右(图1-D)。方差分析的结果
表明, 0.1 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA的组合与其
它组合处理间的差异达到极显著性水平, 因此, 黄
花马铃苣苔芽增殖培养生长调节剂最优组合为0.1
mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA。
4 不同生长素对黄花马铃苣苔不定芽根系分化的
影响
从表3看出, 3种生长素对黄花马铃苣苔小苗
根系的诱导效果差异极大, 其中IBA极显著优于
IAA和NAA。在含IBA的培养基中生长10 d, 植株
开始生根; 30 d诱导的生根率100%, 生根数达到
植物生理学报1732
7.27条, 根系粗长, 植株生长势好且健壮(图1-E)。
在IAA培养基中, 植株14 d开始生根, 30 d的生根率
93.33%, 生根数为5.60条, 根系较长, 植株长势一
般。含NAA的培养基, 植株发根最慢, 15 d才有根
系长出, 30 d生根率为90.0%, 平均每株生根4.11条,
根粗短, 植株较细弱, 因此宜选用IBA进行黄花马
铃苣苔的生根培养。
表3 不同生长素对黄花马铃苣苔不定芽根系分化的影响
Table 3 Effects of different auxins on differentiation
of rooting in O. flavida
生长素 生根率/% 生根数/条 生长状况
IBA 100.00Aa 7.27Aa 健壮、根粗长
IAA 93.33Bb 5.60Bb 较壮、根细长
NAA 90.00Cc 4.11Cc 较弱、根粗短
表2 不同6-BA与NAA组合对黄花马铃苣苔不定芽增殖的影响
Table 2 Effects of different combinations of 6-BA and NAA on bud propagation of O. flavida
6-BA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 增殖系数 芽的生长情况
0.1 0.1 7.30Aa 芽均匀、高、粗壮、
0.1 0.2 5.59EFef 芽较均匀、壮, 偶有长根
0.1 0.3 4.40Ii 芽较均匀、细
0.1 0.5 4.93GHgh 芽均匀、矮小, 有少量长根
0.5 0.1 5.78DEde 芽较均匀、壮
0.5 0.2 6.71Bb 芽均匀、细小、有少量长根
0.5 0.3 5.63DEFe 芽较均匀、细小, 有少量长根
0.5 0.5 3.67Jj 芽细弱、小, 有少量长根
1.0 0.1 4.63HIhi 芽均匀、细小, 偶有长根
1.0 0.2 6.37BCbc 1/3的芽较粗、2/3细小, 偶有长根
1.0 0.3 5.56EFef 芽均匀、较粗
1.0 0.5 5.15GFg 芽均匀、细小
2.0 0.1 5.22FGfg 芽较均匀, 略细, 偶有长根
2.0 0.2 5.22FGfg 2/3的芽较大、1/3细小
2.0 0.3 5.96CDEde 芽较均匀、矮小, 有少量长根
2.0 0.5 6.15CDcd 芽均匀、矮小, 长根较多
5 不同浓度IBA对黄花马铃苣苔不定芽生根的
影响
结果(表4)表明, IBA对黄花马铃苣苔不定芽
的生根有明显的促进作用, 各处理的生根率和生
根数均显著高于不加生长素的对照。在不添加
IBA的培养基中, 不定芽的生根效果差, 生根率只
有59.26%, 平均每株生根3.25条, 苗细弱。添加
IBA之后, 生根率有极明显的提高。低浓度的IBA
生根效果较差, 0.2 mg·L-1 IBA的生根率96.67%, 生
根数为3.48条; 0.5~1.5 mg·L-1 IBA的生根率均达到
100%, 小苗生长势良好, 其中0.5 mg·L-1 IBA诱导的
根数最多, 平均每株生根7.51条, 与其它处理的差
异达到显著性水平。因此, 黄花马铃苣苔的生根
培养最佳的IBA浓度是0.5 mg·L-1。
表4 不同IBA浓度对黄花马铃苣苔不定芽根系分化的影响
Table 4 Effects of different concentrations of IBA on differentiation of rooting of O. flavida
IBA浓度/mg·L-1 生根率/% 生根数/条 生长状况
0 (对照) 59.26Cc 3.25Ce 细弱、叶淡绿
0.2 96.67Bb 3.48Bd 苗壮、枯叶较多
0.5 100.00Aa 7.51Aa 健壮、叶深绿
0.8 100.00Aa 5.10Ab 健壮、叶深绿
1.0 100.00Aa 4.76Abc 较壮、叶绿、基部分生较多小苗
1.5 100.00Aa 4.14Acd 较壮、叶绿、基部分生较多小苗
潘梅等: 黄花马铃苣苔的离体培养与快速繁殖 1733
表5 不同移栽基质对黄花马铃苣苔成活率的影响
Table 5 Effects of different matixs on survival rate of O. flavida
基质 移栽株数/株 成活株数/株 成活率/%
珍珠岩 35 31 88.57
河沙 35 22 62.86
表土 35 10 28.57
珍珠岩:河沙:表土 35 32 91.43
6 黄花马铃苣苔的移栽
从表5看出, 表土不适宜作为黄花马铃苣苔组
培苗的移栽基质, 组培苗成活率低, 30 d的成活率
只有28.57%, 这可能是由于表土通透性较差, 不利
于根系的生长。基质河沙和珍珠岩的成活率也偏
低, 分别为62.86%和88.57%。在等体积的表土、
珍珠岩和河沙混合基质中, 黄花马铃苣苔组培苗
生长良好(图1-F), 成活率最高达到91.43%, 可见,
黄花马铃苣苔宜选用等体积的表土、珍珠岩和河
沙混合基质移栽组培幼苗。
讨　　论
在植物的组织培养与快速繁殖过程中, 植物
生长调节剂的种类及使用浓度是最为主要的影响
因子, 决定着培养材料的培养方向、数量和质量。
主要使用的细胞分裂素有6-BA、KT、ZT和TDZ,
生长素有NAA、IBA和IAA。
TDZ是已被广泛用于植物组织培养形态发生
的高效生物调节剂。它能诱导外植体从愈伤组织
形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应, 具有
细胞分裂素和生长素双重作用的特殊功能, 在组
织细胞培养中TDZ是通过单独或与其他生长调节
物质共同对植物细胞起作用 (徐晓峰和黄学林
2003)。目前TDZ在苦苣苔科植物组织培养中未见
有应用。本研究采用0.5 mg·L-1的TDZ对黄花马铃
苣苔不定芽的增殖效果并不理想, 增殖率小, 芽也
较细小。这也许与浓度不适有关, 也许是不同植
物对细胞分裂素的需求不同。
6-BA与NAA组合使用, 黄花马铃苣苔再生芽
的发生频率极显著高于其它几种植物生长物质组
合, 最适浓度为0.1 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA。
这一结果与桂林唇柱苣苔(付传明等2010)和台闽
苣苔(汤正辉等2005b)的增殖培养结果一致。菱叶
唇柱苣苔不定芽增殖所需的6-BA和NAA浓度相对
较高, 0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA为最佳组合
(李翠等2010)。与桂林唇柱苣苔同属的文采唇柱
苣苔中, 冼康华等(2014)所筛选出的最佳组合为0.5
mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA; 另一同属植物烟叶
唇柱苣苔中, 潘梅等(2014)选出的最优组合为0.5
mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA。刘伟和黄勇(2010)
在吊石苣苔的研究表明, 较高浓度的6-BA利于芽
的增殖, 最佳组合为3.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1
NAA; 在汤正辉等(2005a)的研究中发现, 3.0 mg·L-1
6-BA+0.1 mg·L-1 IBA组合的异裂苣苔不定芽再生
频率最高。可见, 不同的苦苣苔科植物, 即使是亲
缘关系比较接近的同属种, 植物生长调节剂的使
用存在一定的差异, 使用的种类与浓度主要取决
于不同外植体的反应。
本实验过程中, IBA诱导根系分化的能力极显
著优于NAA和IAA。在含有不同浓度IBA培养基
中诱导根系形成时发现, 随着IBA浓度的升高, 小
苗分化根系的能力有所增强, 但当IBA浓度超过0.5
mg·L-1时, 根系分化能力反而下降, 平均根数减少,
1.0~1.5 mg·L-1 IBA还容易诱发产生较多的无效小
苗。说明IBA浓度过高会抑制根系的再生能力, 可
能是外源生长物质超过本身适应极限, 从而影响
自身根的形成与生长。与张占江等(2013)对于条
叶唇柱苣苔组织培养的研究结果相比较, 诱导植
株生根的IBA浓度有明显降低。在培养基中添加
0.5 mg·L-1 NAA, 烟叶唇柱苣苔(潘梅等2014)和吊
石苣苔(刘伟和黄勇2010)的生根效果最佳。桂林
唇柱苣苔(付传明等2010)和异裂苣苔(汤正辉等
2005a)的再生芽生根均无需添加任何生长素。这
些差别可能是由于不同植株外植体对于外源生长
物质刺激的反应能力不同而造成的。
黄花马铃苣苔组培幼苗移栽基质使用等体积
表土、珍珠岩和河沙的混合基质为好, 表土可以
提供较好的营养和保持水量, 河沙和珍珠岩使得
基质疏松透气, 有利于根系的生长和吸收营养, 移
栽成活率最高。
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