全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (7): 715~725 715
收稿 2011-05-23　　修定 2011-06-12
资助 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2007CB-
108805)。
* 通讯作者(E-mail: kxtang1@163.com; Tel: 021-65643552)。
WD40重复蛋白家族基因At1g65030调控拟南芥种子的重量与体积
游晓慧, 李威, 陶启长, 孙小芬, 唐克轩*
复旦大学生命科学学院, 遗传工程国家重点实验室, 上海200433
摘要: 植物中WD40-repeat蛋白在细胞周期调控等方面具有重要作用。本研究鉴定了一株拟南芥WD40-repeat蛋白基因突
变体at1g65030, 与野生型植株相比种子重量增重体积变大, 营养生长长势较弱, 角果种子结实率较低。以突变体作为母本/
父本与野生型父本/母本杂交, 前者杂交后代未显示有母本的突变表型, 后者部分杂交后代显示出父本的突变表型, 统计突
变体后代分离比符合1:1。用苯胺兰(DAB)、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、碘-碘化钾花
粉染色, 发现花粉部分败育且主要为核败育。爱氏苏木精花粉染色结果显示可观察到正常减数分裂各时期形态。采取热
不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)方法确认突变基因位于第一条染色体65 030位置, 生物信息
学分析表明该基因含有DWD基序。半定量RT-PCR分析发现在拟南芥发育晚期该基因在花器官中大量表达, 过表达该基因
使种子重量减轻。推测At1g65030影响了拟南芥花粉发育细胞核有丝分裂过程, 该研究增加了人们对调控拟南芥花粉发育
分子机制的认识。
关键词: 花粉发育; 种子重量与体积; WD40-repeat蛋白
At1g65030, a WD40-Repeat Protein Gene, Regulates Seed Mass and Size in
Arabidopsis
YOU Xiao-Hui, LI Wei, TAO Qi-Chang, SUN Xiao-Fen, TANG Ke-Xuan*
State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China
Abstract: WD-repeat proteins play important roles in cell circle regulation and so on in plants. In this study, a
novel mutant of WD40-repeat protein gene causing heavier weight and larger size was identified, along with
weaker vegetative growth, as well as less seeds yield. We generated seeds with at1g65030 mutant as maternal
by crossing wild type as paternal, and vice versa. The at1g65030 mutant could not be obtained by former hy-
bridization while the mutant could be obtained by latter test partially. The segregation ratio of T1 and T2 mutant
did not comply with typical mendelian inheritance, which indicated the male gamete aborted partially. To fur-
ther investigate the mechanism, DAB, DAPI, TTC, KI-I2 and Ehrlich’s hematoxylin were employed to stain the
pollen, respectively. DAPI staining suggested abnormity in nucleus while modality of meiosis in each period
was normal. TAIL-PCR revealed its location on the first chromosome 65 030 of Arabidopsis. Bioinformatics
analysis indicated At1g65030 contained a highly conserved DWD motif. Semi-quantitative RT-PCR analysis
showed that At1g65030 expressed preferentially in the floral during the late development period. Over expres-
sion of At1g65030 caused phenotype of reduced seed weight. The results indicated At1g65030 played an impor-
tant part during the mitosis process of pollen nucleus, which is helpful for understanding the regulation of mo-
lecular mechanism regarding the pollen development in Arabidopsis.
Key words: pollen development; seed mass and size; WD40-repeat protein
植物中WD40-repeat蛋白的相关研究较少, 仅
在拟南芥中发现部分WD40-repeat蛋白参与了光
形态建成、分生组织形成(段红英等2007)、胚发
育(Yamagishi等2005)等生理过程, 本研究在拟南芥
中新发现一种WD40-repeat蛋白基因At1g65030, 实
验表明该基因可能影响了植物花粉发育过程, 伴
随着种子重量增重体积增大的表型。花粉发育是
一个复杂过程(Mccomick 1993), 不同阶段受不同
基因调控(刘乐承等2006), At1g65030可能参与调
控花粉发育细胞核有丝分裂过程。该结果增加了
人们对调控花粉发育分子机制的认识, 同时突变
体at1g65030种子重量增重表型也具有重要的潜在
植物生理学报716
农业应用价值。
本研究通过T-DNA插入的方法, 获得了一株
拟南芥突变体at1g65030。突变体种子重量增重、
体积变大, 营养生长较弱, 角果结实率较低, 后代
分离比满足1:1, 花粉与柱头结合异常、活力较
弱、细胞核发育异常、减数分裂正常。利用
TAIL-PCR方法确认该突变基因位于拟南芥第一号
染色体65 030位置, 生物信息学分析表明其含有
DWD基序, 属于WD40-repeat蛋白家族。我们的研
究结果推测该基因可能在花粉发育的细胞核有丝
分裂过程中发挥重要作用。
材料与方法
1 材料
供试植物材料为模式植物拟南芥(Arabidopsis
thaliana L.) Columbia (Col-0)型, 由本实验室种
植。生长条件为: 光/暗时间16 h/8 h, 光照强度75
μmol·m-2·s-1, 温度为(22±1) ℃。拟南芥at1g65030
突变体种子在4 ℃黑暗下春化3 d, 均匀铺于含有40
mg·L-1卡那霉素的1/2MS (0.7%琼脂、1%蔗糖)培
养基上, 生长条件同前, 待幼苗长到2周大, 移植入
土, 相同条件继续生长。
大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α菌株用于感
受态细胞制备; 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefa-
ciens) GV3101菌株用于拟南芥遗传转化; 植物表
达载体pHB由中国科学院上海生命科学研究院植
物生理生态研究所杨洪全教授惠赠。
2 方法
2.1 At1g65030突变体的获得及表型分析
采用T-DNA插入的方法获得一株拟南芥突变
体植株at1g65030。对其T1、T2代PCR检测阳性的
植株, 分别随机选取5、15个株系的成熟干燥种子,
野生型植株同样随机选取5个株系的成熟干燥种
子称量百粒重(分析天平, sartorius) (g), 每个株系
重复3次。再选T1、T2代阳性植株及野生型成熟干
燥种子各2个株系, 分别称取各株系种子总重量,
将各株系种子经由30、35、40、45、50、60、
70、80目筛网筛选, 分别称量每一个筛网滞留种
子重量, 换算成占各株系总重量的百分比以表示
通过不同孔径筛网种子数量。
按上述培养条件播种突变体at1g65030及野生
型拟南芥, 取春化后在培养基上培养5 d 及移植入
土后4周的样本进行比对。
经过去雄、人工授粉步骤用突变体at1g65030
作为母本/父本与野生型父本/母本杂交。对突变
体at1g65030 T1、T2代植株分别选取8、16个株系,
取100粒种子播种, 按上述培养条件春化后继续培
养7 d左右, 以绿色且根较长为转化子(Km抗性), 黄
化苗或绿色无根幼苗为非转化子, 统计分离比并
做χ2检验。
对突变体at1g65030取生长5周左右成熟花蕾
雌蕊 , 复水 (70%、50%、30%、0%乙醇各10
min)、固定(乙醇 :乙酸=3:1)、软化(8 mol·L -1
NaOH)后用苯胺兰黑暗中染色2 h, 荧光显微镜下
镜检(赵世光等2008)。取刚露白花蕾解剖镜下解
剖花药释放花粉 , 分别滴加1~2滴0.5% TTC染
液35 ℃染色15 min, 1~2滴碘-碘化钾(碘化钾6
mg·mL-1, 碘3 mg·mL-1)染液常温染色15 min, 荧光
倒置显微镜可见光下观察 (孙春丽和潘延云
2008)。取刚露白花蕾固定24 h, 解剖镜下解剖花
药释放花粉, 用DAPI黑暗中染色10 min, 荧光倒置
显微镜359 nm波长下观察蓝色荧光。取植物根部
新生花骨朵固定24 h, 解剖花药释放花粉于事先滴
加爱氏苏木精染液的载波片上, 徒手压片, 荧光倒
置显微镜可见光下观察。
2.2 At1g65030插入位置确定及生物信息学分析
采取CTAB方法提取植物叶片基因组DNA。
根据T-DNA L区边界序列设计3个特异引物N1、
N2、N3, 同时选择6个随机简并引物(arbitrary de-
generate, AD) (表1), 采用TAIL-PCR的方法(Meng
表1 TAIL-PCR中用到的引物序列
Table 1 Primer sequence for TAIL-PCR
引物 序列(5→3)
N1 ATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTA
N2 CTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTACTA
N3 ATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTCA
AD1 NGTCGASWGANAWGAA
AD2 TGWGNAGSANCASAGA
AD3 AGWGNAGWANCAWAGG
AD4 STTGNTASTNCTNTGC
AD5 NTCGASTWTSGWGTT
AD6 WGTGNAGWANCANAGA
　　序列中W是A或T; S是G或C; N是A、T、G、C任一碱基。
游晓慧等: WD40重复蛋白家族基因At1g65030调控拟南芥种子的重量与体积 717
等2005)经3轮PCR得到特异DNA片段。序列比
对、蛋白质性质预测等在Vector NTI Suite 9.0软件
上进行, ORF查找和ORF翻译在NCBI上完成(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html), 蛋白高级结
构预测在http://www.expasy.org (Swiss-model)上完
成。
2.3 At1g65030基因克隆、载体构建及功能分析
使用植物RNA提取试剂盒(Watson)提取拟南
芥不同组织总RNA, 紫外分光光度计定浓度。以
经定量的植物不同组织R N A为模板 , 分别用
At1g65030特异性引物65030F1 (5-ATGGATC-
CTAGTATCATCG-3)/65030R1 (5-TTATTCT-
GAGTCCTCATG-3)及内参基因β-Actin特异性
引物A t A c t 2 F ( 5 - G A G G C T C C T C T TA A C -
CCAA-3)/AtAct2R (5-TACAATTTCCCGCTCT-
GC-3), 用TaKaRa公司的One step RT-PCR试剂盒
进行反应, 反应产物电泳检测。半定量RT-PCR反
应程序为: 50 ℃温育30 min, 94 ℃终止2 min; 94 ℃
变性30 s, 58 ℃复性30 s, 72 ℃延伸1.5 min, 26个循
环; 72 ℃延伸8 min。
使用植物RNA抽提试剂盒(Watson)提取拟南
芥叶片总RNA, 以拟南芥总RNA为模板, 用Toyobo
公司反转录酶进行反转得到cDNA, 反转录程序为:
72 ℃温育7 min, 冰上骤冷2 min, 42 ℃延伸1 h, 99 ℃
终止5 min。以65030F1/65030R1为引物, 以拟南芥
反转录得到的cDNA为模板, 用Toyobo公司高保真
酶KOD进行PCR, 扩增At1g65030基因编码区1 038
bp目的片段, 回收纯化, 目的片段两端加A (72 ℃
反应10 min), 再回收纯化, 连入pMD18-T载体16 ℃
连接过夜, 转化大肠杆菌DH5α, PCR检测阳性克隆
测序。该克隆载体命名为pMD18T65030。对pM-
D18T65030阳性克隆摇菌抽提质粒, 以该质粒为模
板, 用65030F2 (5-CGGGATCCATGGGTAGTAT-
CATCGCAGGCTCCTA-3, 斜体部分为引入的
BamHI酶切位点)和65030R2 (5-GAAGATCTTCT-
GAGTCCTCATGCTC-3, 斜体部分为引入的BglII
酶切位点)为引物, PCR扩增1 kb目的片段。将该目
的片段回收纯化, 连入pMD18-T载体16 ℃连接过
夜, 转化大肠杆菌DH5α, PCR检测阳性克隆测序。
该克隆载体命名为pMD18T65030plus1。将测序正
确的pMD18T65030plus1阳性克隆摇菌抽质粒, 用
BamHI和BglII双酶切质粒pMD18T65030plus1, 回
收约1 kb小片段; 用BamHI单酶切载体pHB, 回收
12 kb大片段, 连接回收的目的基因小片段和载体
大片段, 转化大肠杆菌DH5α, 在含有50 mg·L-1卡那
霉素的LB培养基上筛选转化子。提取阳性转化子
质粒, 用p35S/65030R2及p35S/65030F2分别PCR检
测At1g65030过表达及反义表达载体阳性转化子,
测序, 构建成At1g65030基因过表达及反义表达载
体(图1)。
将鉴定正确的At1g65030基因过表达及反义
表达载体质粒分别转入农杆菌GV3101中, 经卡那
霉素、硫酸庆大霉素和利福平筛选阳性转化子,
PCR及质粒DNA酶切鉴定阳性转化子。采用浸花
法(Clough和Bent 1998)转化野生型拟南芥, 收获的
种子在含有30 mg·L-1潮霉素的1/2MS培养基上进
行抗性筛选。抗性植株转土培养3周后喷洒0.1%
除草剂筛选, 4周后抽提拟南芥植株DNA进一步验
证, 对At1g65030基因过表达及反义表达转基因阳
性植株种子称重。
实验结果
1 At1g65030突变体表型分析
1.1 At1g65030突变体种子重量增重体积增大
表2所示与野生型相比突变体T1代各株系种
子百粒重增重35.4%~66.7%不等, 平均增重53.1%。
图1 At1g65030过表达/反义表达载体基本结构示意图
Fig.1 Schematic structure of the At1g65030 over-expression/anti-expression vector
A: 过表达At1g65030载体结构示意图; B: 反义表达At1g65030载体结构示意图。BamHI和BglII是同尾酶, 基因片段和载体片段连接后
原有BamHI和BglII酶切位点消失; LB、RB分别表示T-DNA的左、右边界。
植物生理学报718
表3所示T2代各株系种子百粒重增重39.9%~71.0%
不等, 平均增重60.6%。野生型种子体积主要分布
于孔径180~250 μm, 其中又以212 μm所占百分比
最高。突变体种子体积主要分布于孔径180~355
μm, 在212、250、300 μm分布较为平均(图2)。
1.2 At1g65030突变体营养生长长势较弱
与野生型相比, 光照培养5 d后突变体小苗子
叶大小近似, 但根系明显较短(图3-A), 5周后突变
表2 突变体at1g65030 T1代种子百粒重
Table 2 100-seed weight of at1g65030 T1 generation
植株 百粒重/g (方差) 突变体比野生型重量重百分比/%
WT1 1.7 (0.2)
WT2 2.0 (0.1)
WT3 1.7 (0.2)
WT4 2.2 (0.2)
WT5 2.0 (0.1)
Bn10-1 3.1 (0.2) 61.5
Bn10-2 3.2 (0.2) 66.7
Bn10-3 3.0 (0.1) 56.3
Bn10-4 2.6 (0.2) 35.4
Bn10-5 2.8 (0.1) 45.8
　　WT表示随机选取野生型5个株系; Bn表示随机选取突变体
at1g65030 T1代植株5个株系。
表3 突变体at1g65030 T2代种子百粒重
Table 3 100-seed weight of at1g65030 T2 generation
植株 百粒重/g (方差) 突变体比野生型重量重百分比/%
WT1 1.9 (0.2)
WT2 2.0 (0.1)
WT3 1.9 (0.1)
WT4 2.0 (0.1)
WT5 1.9 (0.2)
WT6 1.9 (0.2)
Bn10-1-1 3.0 (0.3) 55.4
Bn10-1-3 2.7 (0.2) 39.9
Bn10-1-5 3.0 (0.2) 55.4
Bn10-2-2 3.1 (0.1) 60.6
Bn10-2-3 3.3 (0.2) 71.0
Bn10-2-4 3.1 (0.2) 60.6
Bn10-5-2 2.8 (0.3) 45.1
Bn10-5-3 2.8 (0.1) 45.1
Bn10-5-4 3.3 (0.1) 71.0
Bn10-6-1 3.3 (0.2) 71.0
Bn10-6-2 3.2 (0.1) 65.8
Bn10-6-4 3.1 (0.1) 60.6
Bn10-7-1 3.0 (0.1) 55.4
Bn10-7-2 2.9 (0.2) 50.3
Bn10-7-5 3.2 (0.1) 65.8
Bn10-7-8 3.2 (0.1) 65.8
　　WT表示随机选取野生型6个株系; Bn表示随机选取突变体
at1g65030 T2代植株16个株系。
图2 突变体at1g65030种子体积大小的分布
Fig.2 Seed size distribution of at1g65030
A、B: 野生型1、2; C: T1代突变体Bn10-11; D: T1代突变体Bn10-13; E: T2代突变体Bn10-1-3; F: T2代突变体Bn10-5-3。
游晓慧等: WD40重复蛋白家族基因At1g65030调控拟南芥种子的重量与体积 719
体植株地上部分以及角果、莲座叶均较小, 整体
长势较弱(图3-B~D)。
1.3 At1g65030突变体角果种子结实率较低
成熟未开裂角果中野生型种子沿花柱排列整
齐, 结实率高, 平均为70% (以60为拟南芥子房胚囊
基数)。突变体at1g65030角果种子排列不规则, 结
实率低, 平均为34.4%, 与野生型相比角果种子结
实率明显较低(表4)。
表型, 后者部分杂交后代显示出父本的突变表型,
说明突变的雌蕊与正常的雄蕊杂交产生的后代全
都正常, 突变的雄蕊与正常的雌蕊杂交产生部分
突变后代, 可推测突变体的雄蕊发生了异常, 雄配
子出现部分败育(表5、6)。在置信度为95%时, 突
变体at1g65030 T1代植株实际分离比与假设的1:1
分离比差异不显著(表7), T2代植株实际分离比与
假设的1:1分离比大部分株系差异不显著, 但1、
2、3、13、15号株系差异显著(表8)。
图3 突变体at1g65030植株种子萌发及幼苗生长阶段表型
比较
Fig.3 Phenotypic comparison of at1g65030 and wild type
during the germination and growth
A: 光照培养5 d野生型与突变体小苗; B: 播种5周后野生型与
突变体地上部分植株; C: 野生型与突变体角果; D: 野生型与突变
体莲座状叶片。
表4 野生型与突变体at1g65030角果种子结实率统计
Table 4 Seeding ratio of siliques between WT and at1g65030
植株 种子数量/粒 种子结实率/%
WT1 47.0 78.3
WT2 39.0 65.0
WT3 40.0 66.7
野生型平均值 42.0 70.0
Bn10-6-1 23.0 38.3
Bn10-5-4 20.0 33.3
Bn10-5-2 19.0 31.7
突变体平均值 20.7 34.4
　　WT表示随机选取野生型3个株系; Bn表示随机选取突变体
at1g65030 T2代植株3个株系。
表5 突变体母本/野生型父本杂交结果
Table 5 Hybridization with at1g65030 maternal/WT paternal
重复 具突变表型杂交后代数/株 具野生型表型杂交后代数/株
1 0 12
2 0 6
3 0 13
4 0 5
表6 突变体父本/野生型母本杂交结果
Table 6 Hybridization with at1g65030 paternal/WT maternal
重复 具突变表型杂交后代数/株 具野生型表型杂交后代数/株
1 11 12
2 1 8
3 3 10
4 27 18
5 14 13
6 1 2
7 9 5
8 7 4
1.4 At1g65030突变体后代分离比
突变体at1g65030作为母本/父本与野生型父
本/母本杂交, 前者杂交后代未显示有母本的突变
1.5 At1g65030突变体花粉和花柱结合异常
野生型花粉与柱头结合时花粉管可以被正常
牵引进入花柱(图4-A、B), 突变体花粉与花柱结合
力较弱, 有的甚至完全不能结合(图4-D), 即使可以
结合的花粉与花柱, 某些花粉管也不能被柱头正
常牵引入花柱(图4-C)。推测At1g65030的突变可
能引起了某些信号通路的阻断, 导致雌蕊柱头对
花粉管的吸引、结合能力变弱。
1.6 At1g65030突变体花粉活力弱
TTC染色结果显示野生型花粉粒细胞质红色
着色明显, 活力强(图5-A、B), 突变体花粉粒红色
着色不明显, 活力较弱(图5-C、D)。碘-碘化钾染
色结果显示大部分野生型花粉粒深褐色着色明显,
植物生理学报720
活力强(图6-A、B), 而多数突变体花粉粒呈淡黄着
色, 活力较弱, 常能观察到完全败育的花粉粒(图
6-C、D)。我们认为这可能由两种原因造成: 一种
是花粉细胞质发育不正常而核发育正常导致的败
育; 另一种是由于核发育不正常导致细胞整体活
力较弱而染不上色, 与细胞质发育关联较小。
表7 突变体at1g65030 T1代植株分离比χ
2检验
Table 7 The χ2 analysis of at1g65030 T1 plant
重复 对照 T1代/株数 阳性/株数 阴性/株数 χ
2 遗传比例
1 O 67 32 35 0.1343 +
E 67 33.5 33.5
2 O 68 39 29 1.4706 +
E 68 34 34
3 O 91 42 49 0.5385 +
E 91 45.5 45.5
4 O 90 44 46 0.0444 +
E 90 45 45
5 O 65 31 34 0.1385 +
E 65 32.5 32.5
6 O 69 40 29 1.7536 +
E 69 34.5 34.5
7 O 90 42 48 0.4000 +
E 90 45 45
8 O 93 48 45 0.0968 +
　 E 93 46.5 46.5 　
　　O代表实际值, E代表理论值; χ2检验, P=0.05, χ21,0,95=3.84, 当X
2==∑(|O-E|)2/E＜χ21,0,95 时, 分离比例符合1:1; +: χ2检验, P=0.05时分离比例
符合1:1; -: χ2检验, P=0.05时分离比例不符合1:1。表8同。
图4 苯胺蓝花粉与花粉管染色
Fig.4 Aniline blue staining of pollen and tube
A、B: 野生型; C、D: at1g65030。
图5 TTC 花粉粒染色
Fig.5 TTC staining of pollen
A、B: 野生型; C、D: at1g65030。
1.7 At1g65030突变体花粉细胞核发育异常
野生型花粉粒DAPI染色可见2个精细胞细胞
核蓝色亮点清晰、透亮, 花粉整体染色均匀, 花粉
与花粉间着色程度一致(图7-A、B)。而突变体花
粉粒精细胞细胞核染色亮度较弱(图7-C、D), 部分
染色弥散, 有的甚至不能着色, 花粉间着色程度相
游晓慧等: WD40重复蛋白家族基因At1g65030调控拟南芥种子的重量与体积 721
表8 突变体at1g65030 T2代植株分离比χ
2检验
Table 8 The χ2 analysis of at1g65030 T2 plant
重复 对照 T2代/株数 阳性/株数 阴性/株数 χ
2 遗传比例
1 O 82 32 50 3.9512 -
E 82 41 41
2 O 79 13 66 35.5570 -
E 79 39.5 39.5
3 O 66 22 44 7.3333 -
E 66 33 33
4 O 67 28 39 1.8060 +
E 67 33.5 33.5
5 O 70 35 35 0.0000 +
E 70 35 35
6 O 79 40 39 0.0127 +
E 79 39.5 39.5
7 O 73 36 37 0.0137 +
E 73 36.5 36.5
8 O 83 39 44 0.3012 +
E 83 41.5 41.5
9 O 82 35 47 1.7561 +
E 82 41 41
10 O 86 46 40 0.4186 +
E 86 43 43
11 O 70 40 30 1.4286 +
E 70 35 35
12 O 72 39 33 0.5000 +
E 72 36 36
13 O 83 32 51 4.3494 -
E 83 41.5 41.5
14 O 83 50 33 3.4819 +
E 83 41.5 41.5
15 O 70 48 22 9.6571 -
E 70 35 35
16 O 81 43 38 0.3086 +
　 E 81 40.5 40.5 　 　
图6 碘-碘化钾花粉粒染色
Fig.6 KI-I2 staining of pollen
A、B: 野生型; C、D: at1g65030。箭头所指深褐色花粉粒活力强, 淡黄色花粉粒活力弱。
差较大, 即使提高曝光度部分花粉仍然完全不能
染上色, 且观察到一定数量完全败育花粉粒(图
7-E、F), 可见突变体花粉细胞核发育发生异常。
爱氏苏木精染色后, 在Olympus荧光显微镜油镜下
植物生理学报722
图7 DAPI花粉粒染色
Fig.7 DAPI staining of pollen
A、B: 野生型; C~F: at1g65030。
观察到突变体at1g65030减数分裂几个典型时期形
态, 发现染色体在减数分裂双线期、终变期、中
期、中后期、后期、减数分裂第二次时期均形态
正常, 初步推测花粉细胞核发育异常发生在有丝
分裂周期(图8-A~F)。
2 At1g65030插入位置确定及生物信息学分析
TAIL-PCR扩增获得800 bp左右条带, 将该条
带进行回收, 通过TA克隆连接至pMD18-T载体, 进
行DNA序列测定后将该序列中的T-DNA旁侧序列
图8 爱氏苏木精突变体at1g65030花粉染色体染色
Fig.8 Ehrlich hematoxylin stained chromosomes of at1g65030
A: 终变期; B: 中期; C、D: 双线期, 中后期; E: 后期; F: 有丝
分裂周期。箭头所指为花粉染色体减数分裂各时期典型形态。
与TAIR (The Arabidopsis Information Resource,
http://arabidopsis.org)网站中的拟南芥基因组数据
库中的序列进行比对, 发现该T-DNA插入位置位
于拟南芥第一号染色体65 030位置处 (Locus:
At1g65030)。对At1g65030位置处的预测基因序列
进行分析, 发现该基因编码一个由345个氨基酸(图
9)组成的蛋白, 理论分子量为37.5 kDa, 预测等电点
pI=6.9。同源比对分析发现, 该蛋白序列中含有丰
富的WD40重复序列, 属于WD40-repeat蛋白基因
图9 At1g65030氨基酸序列
Fig.9 The amino acids sequence of At1g65030
绿色为DWD基序; 红色氨基酸分别为D: 天冬氨酸; W: 色氨酸; R: 精氨酸。
游晓慧等: WD40重复蛋白家族基因At1g65030调控拟南芥种子的重量与体积 723
家族。该类蛋白含有一个反应必须的DWD基序,
该基序由16个氨基酸组成, 有4个高度保守的残基:
Asp-7 (或Glu), Trp-13 (或Tyr), Asp-14 (或Glu)及
Arg-16 (或Lys), Arg-16的突变可能造成WD40-re-
peat蛋白不能与CUL4-DDB1蛋白复合体互作(He
等2006)。对At1g65030三维结构模拟观察到
β-propeller结构(箭头所示), 与Lee等(2008)报道的
DWD基序可形成β-propeller结构, 通过1或2个片层
参与WD40-repeat蛋白和其他蛋白间的互作相符
(图10)。
果中几乎没有表达(图11)。我们认为这可能是由
于At1g65030 RNA剪接不完全导致2 kb含有内含子
基因序列转录本与1 kb仅含有外显子基因序列转
录本同时被扩增得到。
图11 拟南芥发育不同时期At1g65030组织表达差异
Fig.11 Temporal and spatial expression patterns of At1g65030
in Arabidopsis
A: 生长早期; B: 生长晚期。
3.2 At1g65030基因过表达/抑制表达特征
如方法2.3节中所述, 获得两个载体, 分别为
CaMV35S启动子驱动的At1g65030编码区正向/反
向序列, 作为At1g65030基因过表达和反义抑制载
体, 测序验证载体序列与设计序列完全一致。将
这两个载体分别转化农杆菌菌株GV3101, 利用该
工程菌, 用浸花法转化拟南芥植株(用空载体pHB
作为对照)。经过转化的拟南芥种子在含有潮霉素
的抗性培养基上进行筛选, 阳性植株移栽后进行
PCR验证确认。结果发现转化过表达载体获得13
株阳性植株(图12), 将这些植株繁殖后进行后续分
图12 过表达At1g65030转基因植株PCR检测
Fig.12 PCR analysis of At1g65030 over-expression
transgenic line
+: 上图为pMD18T65030plus1, 下图为pHB; -: 水; 1~8: 过表达
At1g65030转基因阳性植株。
图10 At1g65030三维结构
Fig.10 The 3D structure of At1g65030
箭头所指为DWD基序形成的β-propeller结构。
3 At1g65030基因克隆、载体构建及功能分析
3.1 At1g65030基因时空表达特征
对At1g65030基因结构分析发现, 该基因全长
1 719 bp, 含有两个内含子, 分别为574 bp和107 bp,
编码区全长1 038 bp, 编码一个含345个氨基酸的
蛋白。半定量RT-PCR结果表明, 野生型拟南芥生
长早期At1g65030 1 kb转录本在叶中表达量最高,
在根中较低, 2 kb转录本在花中表达量最高, 同样
根中较低, 同时, 存在可能的mRNA剪接中间体。
生长晚期At1g65030 1 kb转录本在花中表达量最
高, 在茎中较低, 2 kb转录本在根中表达量最高, 在
植物生理学报724
析。但转化反义抑制载体的转化组中, 经过多次
重复转化, 仍然未能获得转基因阳性植株, 我们推
测, 由于At1g65030基因受到抑制, 可能导致含有
At1g65030反义抑制载体的植株不能正常生长。
进一步对At1g65030基因过表达的拟南芥植
株进行分析发现, 与野生型植株相比, At1g65030过
表达载体转基因阳性拟南芥种子T0代各株系种子
百粒重减轻65.5%~127.5%不等, 平均减轻99.92%
(表9)。这与之前观察到的突变体at1g65030种子重
量增大的现象一致, 提示At1g65030基因的表达可
能与种子重量呈负相关。
个通道蛋白功能。生物信息学分析发现该蛋白不
属于细胞膜上通道蛋白的种类, 本研究又提示了
该蛋白可调控雄配子发育过程中的有丝分裂周期,
故推测该蛋白可能在有丝分裂中参与微管微丝的
动力学组装过程从而最终影响有丝分裂的正常进
程。Zeng等(2009)文章表明拟南芥中一种WD40-
repeat蛋白NEDD1通过与γ-tubulin复合体互作影响
了微管的正常组装过程进而影响到有丝分裂的正
常进行。突变体nedd1细胞中央不能形成正常细胞
板, 有丝分裂异常。这一结论有力支持了我们关
于At1g65030也是通过参与微管组装过程调控有
丝分裂周期的推论。其次, 本研究也揭示了由于
At1g65030基因突变造成某些信号通路被阻断的现
象 , 比如雌蕊柱头不能正常牵引花粉管进入花
柱。我们推测这可能是由于该蛋白在泛素化过程
中扮演的底物接收蛋白角色(Ravid和Hochstrasser
2008)的原因, 该蛋白的突变使得E3泛素-蛋白连接
酶与本该被降解的调控蛋白之间的联系被阻断,
这些调控蛋白存活下来引起了信号通路异常(Zhou
等2009)。
3 反义表达At1g65030载体拟南芥转化阳性苗无法
获得原因探讨
我们先后重复了3次反义表达At1g65030载体
转化拟南芥的实验, 每次在可获得同样转化、培
养条件下的过表达At1g65030阳性转基因植株的情
况下却不能得到反义表达At1g65030阳性转基因植
株。我们认为这可能与At1g65030基因以剂量效应
方式作用有关, 在多代(6代以上)筛选突变体后代
过程中始终无法获得纯系, 突变体以杂合子形式
存在, 推测At1g65030的完全突变严重影响拟南芥
生长发育。反义抑制技术的原理会导致出现两种
结果: 一是降低靶基因表达量但未达完全抑制程
度, 此种情况下反义转基因植株无法得到的原因
可能是构建的反义载体中将基因编码区的全长作
为反义片段, 包含了WD-repeat蛋白基因家族的保
守序列DWD基序, 所以导入拟南芥后, 该反义片段
干扰的不是一个基因的表达, 很可能是干扰了一
批WD-repeat蛋白基因的表达, 拟南芥生长发育因
此严重受阻; 另一种情况是反义RNA完全抑制靶
mRNA(35S强启动子理论上可以避免反义RNA剂
量不够)表达, 此种情况下无法获得反义转基因植
表9 过表达At1g65030植株T0代种子百粒重
Table 9 100-seed weight of T0 over expression At1g65030
transgenic line
植株 百粒重/g (方差) 突变体比野生型重量轻的百分比/%
WT1 1.8 (0.2)
WT2 2.0 (0.1)
WT3 1.7 (0.2)
WT4 1.9 (0.2)
WT5 1.7 (0.3)
On1 1.1 (0.1) 65.5
On2 0.9 (0.3) 102.2
On3 0.9 (0.2) 102.2
On4 0.9 (0.2) 102.2
On5 0.8 (0.3) 127.5
　　WT表示随机选取野生型5个株系, On表示随机选取过表达
At1g65030转基因植株T0代5个株系。
讨　　论
1 突变体at1g65030巨型花粉粒的形成
爱氏苏木精染色拟南芥花粉染色体时, 观察
到部分巨型花粉粒的存在。分析形成原因, 我们
认为可能源于: (1)在花粉发育到小孢子四分体阶
段, 四分体重新融合形成一个大细胞, 花粉细胞核
不再是4×1个, 而是以一个大型融合细胞的形式存
在(1×4); (2)每个四分之一小孢子体不能进行正常
有丝分裂, 染色体本身复制但核不分裂, 从而形成
了超大花粉。
2 At1g65030编码蛋白起到结构蛋白与调控蛋白双
重作用
从At1g65030三维结构模拟及DWD基序以
β-propeller作用来看, WD40-repeat蛋白更类似于一
游晓慧等: WD40重复蛋白家族基因At1g65030调控拟南芥种子的重量与体积 725
株的原理与无法筛选到突变体纯系原理一致。该
结果提示At1g65030基因对拟南芥正常生理过程影
响重大。
参考文献
段红英, 丁笑生, 卢龙斗(2007). WD-repeat 蛋白及其在植物中的作
用. 安徽农业科学, 35: 1007~1008
刘乐承, 张弢, 曹家树(2006). 植物花粉发育的分子生物学研究进
展. 长江大学学报, 3: 174~178
孙春丽, 潘延云(2008). 拟南芥花粉活力的测定及其在花粉发育研
究中的应用. 植物学通报, 25: 268~275
赵世光, 徐敏, 陈义红, 阮龙(2008). 拟南芥花粉体外和体内2种萌发
差异的比较研究. 安徽农业科学, 36: 15472~15473, 15488
Clough SJ, Bent AF (1998). Floral dip: a simplified method for
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thali-
ana. Plant J, 16: 735~743
He YJ, McCall CM, Hu J, Zeng YX, Xiong Y (2006). DDB1 functions
as a linker to recruit receptor WD40 proteins to CUL4-ROC1
ubiquitin ligases. Genes Dev, 20: 2949~2954
Lee JH, Terzaghi W, Giuliana G, Charron JBF, Yoon HJ, Chen HD, He
YZ, Xiong Y, Deng XW (2008). Characterization of Arabidopsis
and rice DWD proteins and their roles as substrate receptors for
CUL4-RING E3 ubiquitin ligases. Plant Cell, 20: 152~167
Mccomick S (1993). Male gametophyte development. Plant Cell, 5:
1265~1275
Meng HJ, Xu J, Guo WW, Xu Q, Li DL, Deng XX (2005). A protocol
for rapid isolation of flanking regions from short known se-
quences. Plant Mol Biol Rep, 23: 75a~75g
Ravid T, Hochstrasser M (2008). Diversity of degradation signals
in the ubiquitin-proteasome system. Nat Rev Mol Cell Biol, 9:
679~690
Yamagishi K., Nagata N, Yee KM, Braybrook SA, Pelletier J, Fu-
jioka S, Yoshida S, Fischer RL, Goldberg RB, Harada JJ (2005).
TANMEI/EMB2757 encodes a WD repeat protein required
for embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol, 139:
163~173
Zeng T, Lee J, Liu B (2009). The WD40 repeat protein NEDD1 func-
tions in microtubule organization during cell division in Arabi-
dopsis thaliana. Plant Cell, 21: 1129~1140
Zhou Y, Zhang XJ, Kang XJ, Zhao XY, Zhang XS, Ni M (2009).
SHORT HYPOCOTYL UNDER BLUE1 associates with MINI-
SEED3 and HAIKU2 promoters in vivo to regulate Arabidopsis
seed development. Plant Cell, 21: 106~117