全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (4): 543–550　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0689 543
收稿 2015-12-22　　修定 2016-02-28
资助 山东省现代农业产业技术体系杂粮产业创新团队建设
项目(SDARS-15-01)、公益性行业(农业)科研专项经
费项目(201303007)、“十二五”国家科技支撑计划课题
(2013BAD01B0106)和山东省农业科学院青年科研基金
(2016YQN19)。
* 通讯作者(E-mail: dinghf2005@163.com)。
老化处理对大豆种子活力及线粒体抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响
田茜, 王栋, 张文兰, 段乃彬, 李群, 颜廷进, 戴双, 丁汉凤*
山东省农作物种质资源中心, 济南250100
摘要: 以大豆‘中黄13’为材料, 研究人工老化后大豆种子活力及线粒体抗坏血酸-谷胱甘肽(ASC-GSH)循环的变化。结果表
明, 随老化时间的延长, 大豆种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均显著下降; 老化种子的相对电导率和丙二醛
(MDA)含量随着老化时间的延长逐渐增大, 超氧阴离子(O2·
−)产生速率和过氧化氢(H2O2)含量呈现先升高后降低的趋势; 与
对照相比, 老化种子中线粒体细胞色素c氧化酶(COX)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性显著下降, 呼吸速率和呼吸控制率(RCR)
显著降低; 老化种子中线粒体超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱
氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性以及总ASC和GSH含量显著降低, 说明老化导致活性氧(ROS)代
谢异常, 线粒体呼吸功能及ASC-GSH循环紊乱。ROS的过量积累可能是导致种子活力丧失的主要原因。
关键词: 大豆; 人工老化; 线粒体; 活性氧; 抗坏血酸-谷胱甘肽循环
低温、低含水量是抑制种子老化的常用方法,
低温库是保存种质资源的理想场所(Lu等2005)。
然而, 许多研究表明, 即使在低温种质库中保存,
种子仍然会缓慢衰老, 遭受一系列生化裂变, 包括
膜透性增加、酶活性降低、贮藏物质减少等(Mc-
Donald 1999; Walters等2005; Bellani等2012)。种子
老化不仅影响种子萌发, 也会降低种子的质量和
品质, 对农业生产造成巨大的经济损失。在研究
种子老化机制时, 通常采用人工老化模拟种子老
化, 判断种子活力(Goel等2003)。
活性氧(reactive oxygen species, ROS)的积累是
导致种子老化的主要原因之一(Møller 2001), 细胞
中ROS的过量积累能够导致脂质过氧化、抗氧化
酶活性降低、蛋白质和RNA的合成受阻以及DNA
的降解(McDonald 1999; Chen等2013), 最终导致种
子活力的丧失, 这已在大豆(Sung1996)、棉花(Goel
等2003)、向日葵(Kibinza等2006)、豌豆(Yao等
2012)和燕麦(Xia等2015)等种子的老化研究中证实。
线粒体是种子萌发过程中产生和清除ROS的
主要细胞器(Møller 2001; Navrot等2007), 同时线粒
体又是进行氧化磷酸化和产生ATP的主要场所, 为
细胞的生物合成提供能量和中间物质(Macherel等
2007; Taylor等2010; Carrie等2013)。线粒体不仅是
内源ROS的主要来源, 也是ROS攻击的首要目标,
过量的ROS能够导致线粒体蛋白质、脂类和核酸
的氧化损伤(Bartoli等2004)。同时, 线粒体中也存
在着多条抗氧化途径, 包括酶促抗氧化系统和非
酶促抗氧化系统, 线粒体抗氧化系统对于线粒体
ROS的清除和减少线粒体氧化损伤具有重要作用
(Navrot等2007)。Jimenez等(1997)最早证明了豌豆
叶片的线粒体中存在完整的抗坏血酸-谷胱甘肽
(ASC-GSH)循环, 并且ASC-GSH循环在ROS的清
除中发挥重要作用。从此线粒体ASC-GSH循环成
为植物逆境研究的难点和热点。目前, 有关线粒体
ASC-GSH循环的研究已在豌豆(Jiménez等1997)、
番茄(Mittova等2004)、黄瓜(Song等2009)、玉米
(Wu等2009)、马铃薯(王芳等2014)、大豆(Xin等
2014)和花生(Zhan等2014)等植物中普遍开展。然
而, 人工老化对种子线粒体ASC-GSH循环影响的
报道还不多。
本文以大豆品种‘中黄13’为实验材料, 通过研
究人工老化对种子活力、细胞ROS积累、脂质过
氧化、线粒体呼吸速率、抗氧化酶活性以及抗氧
化剂含量的影响, 探讨线粒体在种子老化和ROS代
谢中的作用机理, 为从亚细胞水平揭示种子的衰
老机理提供参考。
材料与方法
1 材料与处理
实验材料为大豆[Glycine max (L.) Merr.]品种
‘中黄13’, 种子初始发芽率为98%, 初始含水量为
植物生理学报544
12.5%。将大豆种子密封于铝箔袋中, 置于40°C人
工老化箱中分别老化0、14、21和42 d, 然后将种
子置于−20°C冰箱内保存。
2 发芽指标的测定
种子发芽试验参照国际种子检验协会(1996)
进行, 随机选取100粒种子置于发芽床, 4次重复, 在
25°C恒温培养箱中培养7 d, 逐日检查发芽种子
数。各指标按以下公式计算:
发芽势(%)=第3天发芽数/种子总数×100% (1)
发芽率(%)=第7天发芽数/种子总数×100% (2)
发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt) (3)
活力指数(VI)=GI×DW (4)
式中, Gt为第t天发芽数, Dt为相应发芽天数,
DW为幼苗干重。
3 电导率、丙二醛(MDA)及ROS含量测定
选取10粒完整的种子用去离子水冲洗3次, 用
滤纸吸干种子表面水分 , 加入25 mL去离子水 ,
25°C保温24 h。用Mettler-Toledo Delta 326电导率
仪测定浸出液电导率(a1), 然后将种子及其浸出液
置于100°C水浴中煮沸15 min, 取出冷却至25°C, 测
定煮沸后种子浸出液的电导率(a2)。计算出浸出液
的相对电导率。
相对电导率(%)=a1/a2×100% (5)
吸胀24 h大豆胚轴中MDA含量的测定参照王
爱国等(1986)的方法, 即硫代巴比妥酸(TBA)比色
法; 吸胀24 h大豆胚轴中超氧阴离子(O2·
−)产生速率
的测定参照王爱国等(1990)的方法 ; 过氧化氢
(H2O2)含量的测定参照林植芳等(1988)的方法。
4 线粒体提取及生理生化指标测定
4.1 线粒体提取
参照Yin等(2009)的方法进行大豆胚轴线粒体
的提取。取150粒吸胀24 h的大豆胚轴加入30 mL
预冷的研磨液[50 mmol·L-1磷酸钾缓冲液(pH
8.0)、0.3 mol·L-1蔗糖、0.5% (m/V)牛血清白蛋白
(bovine serum albumin, BSA)、0.5% (m/V)聚乙烯
吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone-40, PVP-40)、2.0
mmol·L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic
acid, EDTA)和20 mmol·L-1半胱氨酸]。匀浆液经4
层纱布过滤后于2 000×g离心15 min, 所得上清于
12 000×g离心15 min, 沉淀用30 mL洗涤介质[0.3
mol·L-1蔗糖、1.0 mmol·L-1 EDTA和50 mmol·L-1
KOH, pH 7.2]悬浮, 经12 000×g离心15 min, 收集沉
淀再用上述介质洗涤1次, 沉淀即为粗制线粒体,
并悬浮于少量洗涤介质中。然后将粗制线粒体悬
浮液铺在不连续Percoll梯度上, Percoll溶液浓度自
下而上为21% (m/V)和40% (m/V), Percoll溶液由上
述洗涤介质配制, 二者比例为1:1, 40 000×g离心
1 h。收集21%和40% Percoll界面间的线粒体, 用洗
涤介质[0.3 mol·L-1蔗糖、0.5% (m/V) BSA和10
mmol·L-1三乙氧基硅烷(triethoxysilane, TES; pH 7.5)]
洗涤3次(最后一次不含BSA), 18 000×g离心15 min,
沉淀即为纯化的线粒体, 悬浮于少量洗涤介质中(不
含BSA)。所有的操作步骤都在0~4°C下进行。
4.2 线粒体呼吸活性的测定
用氧电极(Chlorolab 2, Hansateach, UK)在
25°C下测定线粒体耗氧量(Yin等2009)。取约100
μg线粒体蛋白加入总体积为1 mL的反应介质[0.3
mol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1 TES–KOH (pH 7.5)、5
mmol·L-1 KH2PO4、10 mmol·L
-1 NaCl、2 mmol·L-1
MgSO4以及0.1% (m/V) BSA]中。以还原型烟酰胺
腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-ade-
nine dinucleotide, NADH)、琥珀酸和ADP为呼吸
底物和辅助因子, 终浓度为10 mmol·L-1琥珀酸、1
mmol·L-1 NADH和0.8 mmol·L-1 ADP。呼吸控制率
(respiratory control ratio, RCR)为加入ADP后的呼
吸(即III态呼吸)速率与ADP耗尽后的呼吸(即IV态
呼吸)速率之比。
线粒体中细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxi-
dase, COX)活性测定参考Neuburger等(1985)的方
法, 通过测定由于还原性细胞色素c的氧化导致的
550 nm处吸光值的降低, 得出COX的活性。苹果
酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)活性的测定
参考Glatthaar等(1974)的方法, 利用紫外分光光度
计在340 nm处吸光值的增加来表示MDH的活性。
4.3 线粒体抗氧化酶活性测定
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、
抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)、
脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,
DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(monodehydro-
ascorbate reductase, MDHAR)和谷胱甘肽还原酶
(glutathione reductase, GR)活性的测定参照Mittova
等(2004)的方法。
田茜等: 老化处理对大豆种子活力及线粒体抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响 545
4.4 线粒体抗氧化剂含量测定
用5%磺基水杨酸提取抗氧化剂。取纯化后
的线粒体加入预冷的5%磺基水杨酸, 漩涡震荡20
min, 然后4°C、20 000×g离心20 min, 取上清分装
后保存于−80°C或直接进行抗氧化剂含量测定。
还原型抗坏血酸(ascorbate, reduced form; ASC)和
氧化型抗坏血酸(ascorbate, oxidized form; DHA)含
量的测定参照Law等(1983)的方法, 还原型谷胱甘
肽(glutathione, reduced form; GSH)以及氧化型谷
胱甘肽(glutathione, oxidized form; GSSG)含量的测
定参照Griffith (1980)的方法。
测定上述指标时以线粒体蛋白(mg)表示线粒
体量, 用Bradford(1976)的方法测定蛋白含量。
5 数据分析
各项指标测定均设置3次重复, 结果取平均
值。试验数据采用Excel 2007和SPSS 17.0软件进
行数据统计与显著性分析。
实验结果
1 人工老化对种子发芽特性的影响
表1显示, 经40°C密封老化后, 大豆种子的发
芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均呈下降趋
势, 且与对照相比呈显著差异。与对照相比, 人工
老化14、21和42 d后发芽率分别降为84%、50%和
0%。人工老化14 d后, 与对照相比, 种子的发芽
率、发芽势、发芽指数和活力指数分别下降了
14%、26%、31%和82%, 以活力指数下降最为明
显, 说明老化过程中, 种子活力先于生活力下降,
活力指数对老化处理更为敏感。由此可见, 人工
老化显著抑制了大豆种子的萌发, 降低了种子的
活力。
2 人工老化对ROS积累及脂质过氧化水平的影响
由图1可知, 老化种子的相对电导率和MDA
含量均高于对照, 且随着老化时间的延长逐渐增
大。老化14、21和42 d后, 相对电导率分别是对照
的2.3、4.0和5.9倍; 老化14 d后, MDA含量增加不
显著, 老化21和42 d后比对照分别增加了72.4%和
109.6%, 差异显著。结果表明人工老化加剧了细
胞膜脂质过氧化作用, 导致细胞膜的完整性遭到
破坏, 渗透性增加。
如图2所示, 人工老化过程中, O2·
−产生速率和
H2O2含量的变化趋势一致, 表现出先升高后降低
表1 人工老化对大豆种子发芽指标的影响
Table 1 Effect of artificial aging on germination characteristics of soybean seeds
老化时间/d 发芽率/% 发芽势/% 发芽指数 活力指数
0 98.00±2.31a 96.00±3.27a 39.83±3.57a 157.01±25.37a
14 84.00±7.83b 71.00±8.72b 27.58±1.89b 28.25±5.43b
21 50.00±6.93c 31.00±6.00c 15.42±2.47c 9.50±3.21c
42 0d 0d 0d 0d
　　同一列数据用不同小写字母标识表示差异显著(P<0.05), 表2~4同。
图1 人工老化对大豆种子相对电导率和胚轴MDA含量的影响
Fig.1 Effect of artificial aging on the relative conductances of soybean seeds and MDA contents in embryonic axes of soybean seeds
单个图各柱形上用不同小写字母标识表示数据间差异显著(P<0.05), 图2和3同。
植物生理学报546
的趋势, 在老化21 d时达到高峰, 分别高出对照
57.2%和92.5%, 差异显著。老化42 d时, O2·
−产生速
率和H2O2含量显著下降, 但仍显著高于对照水平。
结果说明在种子老化初期, ROS大量产生并积累,
到老化后期ROS产生减少, 推测是由于老化42 d种
子中线粒体活性显著下降, 导致ROS产生也随之
减少。
3 人工老化对线粒体活性的影响
为了研究人工老化对线粒体功能, 例如TCA、
电子传递链的影响, 测定了线粒体中COX、MDH
的活性和呼吸速率。线粒体COX活性和MDH活性
随老化时间的延长而呈迅速下降趋势, 且与对照
差异显著(图3)。与对照相比, 老化42 d后, 线粒体
COX活性和MDH活性分别下降了73.4%和75.4%。
表明随着老化时间的延长, 线粒体三羧酸循环受
阻, 呼吸系统损伤将导致电子传递链电子漏增加,
增加ROS产生。
线粒体呼吸速率和R C R的测定反映了以
NADH和琥珀酸为底物的耗氧量及氧化磷酸化偶
联程度。由表2可知, 线粒体呼吸速率对老化极为
敏感, 在老化14 d时, 与对照相比, 以NADH和琥珀
酸为底物的呼吸速率分别下降了52.8%和45.5%,
RCR分别下降了22.7%和16.1%。老化42 d后, 以
NADH和琥珀酸为底物的呼吸速率比对照降低了
93.6%和90.1%, RCR降低了44.7%和37.0%。由此
可见, 老化种子萌发过程中线粒体功能紊乱, 呼吸
速率下降, 老化抑制了线粒体的电子传递链和氧
化磷酸化偶联效率。
4 人工老化对线粒体抗氧化系统的影响
表3表明 , 人工老化处理后 , 种胚线粒体
图2 人工老化对大豆种子胚轴O2·
−产生速率和H2O2含量的影响
Fig.2 Effect of artificial aging on the generating rates of O2·
− and the contents of H2O2 in embryonic axes of soybean seeds
图3 人工老化对大豆种子胚轴线粒体COX和MDH活性的影响
Fig.3 Effect of artificial aging on the activities of mitochondrial COX and MDH in embryonic axes of soybean seeds
田茜等: 老化处理对大豆种子活力及线粒体抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响 547
SOD、APX、MDHAR、DHAR和GR的活性呈现
逐渐降低的趋势, 并且SOD、APX、MDHAR和
GR的活性在老化14 d时就显著低于对照水平。老
化42 d时 , 线粒体中SOD、APX、MDHAR、
DHAR和GR的活性分别高于对照86.9%、81.5%、
86.2%、38.4%和59.7%, 表明老化降低了线粒体抗
氧化酶的活性, 使其ROS清除能力受到影响。
表2 人工老化对大豆胚轴线粒体呼吸速率和RCR的影响
Table 2 Effect of artificial aging on the respiration rate and RCR of mitochondria in embryonic axes of soybean seeds
NADH 琥珀酸
老化时间/d III态呼吸速率/nmol IV态呼吸速率/nmol RCR III态呼吸速率/nmol IV态呼吸速率/nmol RCR
(O2)·min
-1·mg-1 (蛋白) (O2)·min
-1·mg-1 (蛋白) (O2)·min
-1·mg-1 (蛋白) (O2)·min
-1·mg-1 (蛋白)
0 215.53±17.73a 103.73±10.77a 2.09±0.22a 119.28±13.22 a 69.73±4.45a 1.71±0.14a
14 102.17±6.61b 63.47±4.48b 1.62±0.15b 65.00±7.55 b 45.43±6.12b 1.44±0.08b
21 57.60±4.37c 38.57±5.82c 1.51±0.14b 50.14±2.74c 37.20±1.65c 1.35±0.09c
42 14.04±4.71d 12.00±2.99d 1.15±0.10c 11.00±2.6d 10.17±2.03d 1.08±0.05d
表3 人工老化对大豆胚轴线粒体抗氧化酶活性的影响
Table 3 Effect of artificial aging on the activities of mitochondrial antioxidant enzymes in embryonic axes of soybean seeds
老化时间/d
SOD活性/ APX活性/μmol MDHAR活性/μmol DHAR活性/μmol GR活性/μmol
U·mg-1 (蛋白) (ASA)·min-1·mg-1 (蛋白) (NADH)·min-1·mg-1 (蛋白) (ASA)·min-1·mg-1 (蛋白) (NADPH)·min-1·mg-1 (蛋白)
0 44.96±1.50a 0.164±0.033a 0.130±0.006a 0.51±0.09a 0.060±0.002a
14 37.42±1.46b 0.087±0.013b 0.097±0.005b 0.49±0.06a 0.046±0.001b
21 26.01±2.16c 0.066±0.006c 0.036±0.001c 0.37±0.05b 0.039±0.025c
42 5.88±1.70d 0.030±0.006d 0.018±0.004d 0.31±0.04b 0.024±0.002d
由表4可见, 随着老化处理时间的延长, 种胚线
粒体中ASC和GSH的含量逐渐降低, 且各处理与对
照差异显著。DHA含量在老化14 d后高于对照, 是
对照的1.4倍, 老化14、21和42 d间差异不显著;
GSSG含量在老化14 d后显著低于对照, 是对照的
67.4%, 老化14、21和42 d间差异不显著。老化种子
的ASC/DHA和GSH/GSSG比值也显著低于对照, 说
明老化种子中抗氧化物质合成及再生能力下降。
表4 人工老化对大豆胚轴线粒体抗氧化剂含量的影响
Table 4 Effect of artificial aging on the contents of mitochondrial antioxidants in embryonic axes of soybean seeds
老化时间/d
ASC含量/ DHA含量/
ASC/DHA比值
GSH含量/ GSSG含量/
GSH/GSSG比值 nmol·mg-1 (蛋白) nmol·mg-1(蛋白) nmol·mg-1(蛋白) nmol·mg-1 (蛋白)
0 6.06±0.27a 1.05±0.11a 6.47±0.39a 0.67±0.12a 0.52±0.08a 1.04±0.13a
14 5.54±0.20b 1.42±0.24ab 4.28±0.26b 0.19±0.03b 0.20±0.02b 0.93±0.22a
21 4.79±0.22c 1.48±0.10b 3.24±0.34c 0.11±0.01c 0.23±0.04b 0.49±0.06b
42 4.03±0.14d 1.51±0.10c 2.69±0.27c 0.05±0.01d 0.25±0.02b 0.19±0.06c
讨　　论
种子老化是种子贮藏过程中影响种子质量和
活力的主要因素。在种子贮藏过程中, 保持较高
水平的种子质量和活力至关重要(Deepa等2013)。
在本研究中, 大豆种子经40°C老化后, 种子的发芽
率、发芽势、发芽指数和活力指数均显著下降,
说明老化降低了种子的活力。MDA是膜脂过氧化
的主要产物之一, 其含量高低是衡量老化过程中
膜脂过氧化程度的重要指标(Willson和McDonald
1986)。种子活力的降低伴随着电导率和MDA含
量的显著升高, 说明人工老化影响了种子萌发过
程中细胞膜的完整性。我们的结果也证明了老化
导致ROS含量的积累, 这表明种子萌发过程中ROS
的积累启动了膜脂过氧化, 破坏了细胞膜的完整
植物生理学报548
性, 使电解质大量外渗, 从而导致种子活力的丧失,
这也进一步证明ROS的积累是导致种子老化的主
要原因之一(McDonald 1999; Goel等2003)。
MDH和COX是和呼吸作用相关的线粒体标
志酶(潘瑞炽2004)。本研究中, 种子老化过程中,
MDH和COX酶活性的逐渐降低, 说明老化影响了
线粒体电子传递和TCA循环, 呼吸底物的供给受
到限制(Song等2001)。呼吸酶活性的降低可能是
由于被氧胁迫条件下产生的NO所抑制(Macherel
等2007), 另一方面可能是由于被过量ROS攻击, 发
生了蛋白质氧化损伤。大豆种子萌发过程中, 胚
轴不含有叶绿体, 线粒体ATP是主要的能量来源。
本研究结果表明, 老化种子线粒体的呼吸速率和
RCR显著低于对照, 这与对大豆(Amable和Oben-
dorf 1986)、甘蓝(Bettey等1996)和豌豆(Benamar等
2003)的研究结果一致, 说明人工老化严重抑制了
线粒体膜的电子传递能力和氧化磷酸化偶联作用,
其利用氧化释放能量转化ATP的效率明显降低
(Xin等2014; Yin等2009), 这可能是由于老化导致
电子传递障碍, 使ROS大量积累, 过量的O2·
−和H2O2
攻击线粒体膜系统, 启动膜脂质过氧化, 使线粒体
膜的完整性降低, 呼吸酶活性降低, 最终导致线粒
体氧化损伤, 呼吸功能遭到破坏, 使老化种子萌发
过程中ATP供应不足。
SOD和ASC-GSH循环在线粒体ROS的清除和
减少线粒体损伤中发挥重要作用。总的来说, 我
们的结果表明随着老化时间的延长, SOD、APX、
MDHAR、DHAR和GR的活性降低, ASC含量、
ASC/DHA比值以及GSH含量、GSH/GSSG比值均
下降, 说明SOD和ASC-GSH循环清除ROS能力降
低, ROS的产生与清除失去平衡, 导致细胞中ROS
的积累, 引发氧化胁迫, 引起线粒体蛋白质、脂类
和DNA氧化损伤, 使线粒体功能受损(Mittova等
2004; Xin等2014)。SOD是抗氧化系统的第一道方
向, 它可以把O2·
−歧化成H2O2。del Río等(2003)研究
发现衰老降低了线粒体Mn-SOD转录水平, 这可能
是导致SOD活性降低的原因之一。ASC-GSH循环
中, APX、MDHAR和GR活性随着老化时间的延
长持续降低, 而DHAR活性降低缓慢, 说明DHAR
是清除H2O2以及ASC再生的主要酶, 这与Jiménez
等(1997)的结果相一致。
总之, 我们的结果表明人工老化降低了线粒
体的呼吸功能和ASC-GSH循环的抗氧化能力, 使
细胞中ROS和MDA含量升高, ROS的积累进一步
导致线粒体发生氧化损伤, 电子传递和氧化磷酸
化产生ATP的效率降低, 导致种子萌发过程中线粒
体不能提供足够的ATP和中间物质。
参考文献
Amable RA, Obendorf RL (1986). Soybean seed respiration during
simulated preharvest deterioration. J Exp Bot, 37 (182): 1364–
1375
Bartoli CG, Gómez F, Martínez DE, Guiamet JJ (2004). Mitochondria
are the main target for oxidative damage in leaves of wheat (Trit-
icum aestivum L.). J Exp Bot, 55 (403): 1663–1669
Bellani LM, Salvini L, Dell’Aquila A, Scialabba A (2012). Reactive
oxygen species release, vitamin E, fatty acid and phytosterol
contents of artificially aged radish (Raphanus sativus L.) seeds
during germination. Acta Physiol Plant, 34: 1789–1799
Benamar A, Tallon C, Macherel D (2003). Membrane integrity and
oxidative properties of mitochondria isolated from imbibing
pea seeds after priming or accelerated ageing. Seed Sci Res, 13:
35–45
Bettey M, Finch-Savage WE (1996). Respiratory enzyme activities
during germination in Brassica seed lots of differing vigor. Seed
Sci Res, 6: 165–173
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the quantita-
tion of microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248–254
Carrie C, Murcha MW, Giraud E, Ng S, Zhang MF, Narsai R, Whel-
an J (2013). How do plants make mitochondria? Planta, 237:
429–39
Chen H, Osuna D, Colville L, Lorenzo O, Graeber K, Küster H, Leub-
ner-Metzger G, Kranner I (2013). Transcriptome-wide mapping
of pea seed ageing reveals a pivotal role for genes related to
oxidative stress and programmed cell death. PLoS ONE, 8 (10):
e78471
Deepa GT, Chetti MB, Khetagoudar MC, Adavirao GM (2013). Influ-
ence of vacuum packaging on seed quality and mineral contents
in chilli (Capsicum annuum L.). J Food Sci Technol, 50 (1):
153–158
del Río LA, Sandalio LM, Altomare DA, Zilinskas BA(2003). Mito-
chondrial and peroxisomal manganese superoxide dismutase:
differential expression during leaf senescence. J Exp Bot, 54
(384): 923–933
Glatthaar BE, Barbarash GR, Noyes BE, Banaszak LJ. Bradshaw RA
(1974). The preparation of the cytoplasmic and mitochondrial
forms of malate dehydrogenase and aspartate aminotransferase
from pig heart by a single procedure. Anal Biochem, 57 (2):
432–451
Goel A, Goel AK, Sheoran IS (2003). Changes in oxidative stress en-
zymes during artificial ageing in cotton (Gossypium hirsutum L.)
seeds. J Plant Physiol, 160: 1093–1100
田茜等: 老化处理对大豆种子活力及线粒体抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响 549
Griffith OW (1980). Determination of glutathione and glutathione
disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine. Anal
Biochem, 106: 207–212
ISTA (1996). International Rules for Seed Testing. Beijing: China
Agriculture Press, 187–188 (in Chinese) [国际种子检验协会
(1996). 国际种子检验规程. 北京: 中国农业出版社, 187–188]
Jiménez A, Hernández JA, del Río LA, Sevilla F (1997). Evidence for
the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria
and peroxisomes of pea leaves. Plant Physiol, 114: 275‒284
Kibinza S, Vinel D, Côme D, Bailly C, Corbineau F (2006). Sunflow-
er seed deterioration as related to moisture content during age-
ing, energy metabolism and active oxygen species scavenging.
Physiol Plantarum, 128: 496–506
Law MY, Charles SA, Halliwell B (1983). Glutathione and ascorbic
acid in spinach (Spinacia oleracea) chloroplasts. The effect of
hydrogen peroxide and of paraquat. Biochem J, 210: 899‒903
Lin ZF, Li SS, Lin GZ, Guo JY (1988). The accumulation of hydrogen
peroxide in senescing leaves and chloroplasts in relation to lipid
peroxidation. Acta Phytophysiol Sin, 14 (1): 16–22 (in Chinese
with English abstract) [林植芳, 李双顺, 林桂珠, 郭俊彦(1988).
衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与脂质过氧化的关系. 植物
生理学报, 14 (1): 16–22]
Lu XX, Chen XL, Guo YH (2005). Seed germinability of 23 crop spe-
cies after a decade of storage in the National Genebank of China.
Agr Sci China, 4 (6): 408–412
Macherel D, Benamar A, Avelange-Macherel MH, Tolleter D (2007).
Function and stress tolerance of seed mitochondria. Physiol
Plantarum, 129: 233–241
McDonald MB (1999). Seed deterioration: physiology, repair and as-
sessment. Seed Sci Technol, 27 (1): 177–237
Mittova V, Guy M, Tal M, Volokita M (2004). Salinity up-regulates
the antioxidative system in root mitochondria and peroxisomes
of the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii. J
Exp Bot, 55 (399): 1105–1113
Møller IM (2001). Plant mitochondria and oxidative stress: electron
transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen
species. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 52 (1): 561–591
Navrot N, Rouhier N, Gelhaye E, Jacquot JP (2007). Reactive oxygen
species generation and antioxidant systems in plant mitochon-
dria. Physiol Plantarum, 129: 185–195
Neuburger M (1985). Preparation of plant mitochondria, criteria for
assessment of mitochondrial integrity and purity, survival in
vitro. In: Douce R, Day DA (eds). Higher Plant Cell Respiration.
Berlin: Springer-Verlag, 7–24
Pan R (2004). Plant Physiology. 5th edn. Beijing: Higher Education
Press (in Chinese) [潘瑞炽(2004). 植物生理学(第5版). 北京:
高等教育出版社]
Song SQ, Fredlund KM, Möller IM (2001). Changes in low-molecular
weight heat shock protein 22 of mitochondria during high-tem-
perature accelerated ageing of Beta vulgaris L. seeds. Acta Phy-
tophysiol Sin, 27 (1): 73–80
Song XS, Wang YJ, Mao WH, Shi K, Zhou YH, Nogués S, Yu JQ
(2009). Effect of cucumber mosaic virus infection on electron
transport and antioxidant system in chloroplasts and mitochon-
dria of cucumber and tomato leaves. Physil Plantarum, 135:
246–257
Sung JM (1996). Lipid peroxidation and peroxide-scavenging in soy-
bean seeds during aging. Physiol Plantarum, 97: 85–89
Taylor NL, Howell KA, Heazlewood JL, Tan TYW, Narsai R, Huang S,
Whelan J, Millar AH (2010). Analysis ofthe rice mitochondrial
carrier family reveals anaerobic accumulation of a basic amino
acid carrier involved in arginine metabolism during seed germi-
nation. Plant Physiol, 154: 691–704
Walters C, Wheeler LM, Grotenhuis JM (2005). Longevity of seeds stored
in a genebank: species characteristics. Seed Sci Res, 15 (1): 1–20
Wang AG, Luo GH (1990). Quantitative relation between the reaction
of hydroxylamine and superoxide anion radicals in plants. Plant
Physiol Commun, (6): 55–57 (in Chinese) [王爱国, 罗广华
(1990). 植物的超氧自由基与羟胺反应的定量关系. 植物生理
学通讯, (6): 55–57]
Wang AG, Shao CB, Luo GH (1986). Inquiry into malondialdehyde as
index of peroxidation of plant lipids. Plant Physiol Commun, (2):
55–57 (in Chinese) [王爱国, 邵从本, 罗广华(1986). 丙二醛作
为植物脂质过氧化指标的探讨. 植物生理学通讯, (2): 55–57]
Wang F, Sun ZP, Liu YL(2014). Effects of anoxia and post-anoxia on
reactive oxygen species (ROS) and antioxidant enzymes in tuber
mitochondria of potato (Solanum tuberosum L.). Plant Physiol J,
50 (3): 283–289 (in Chinese with English abstract) [王芳, 孙周
平, 刘义玲(2014). 缺氧及氧恢复对马铃薯块茎线粒体中活性
氧及抗氧化酶的影响. 植物生理学报, 50 (3): 283–289]
Willson DO Jr, McDonald MB Jr (1986). The lipid peroxidation
molde of seed ageing. Seed Sci Technol, 14 (2): 269–300
Wu JH, Wang WQ, Song SQ, Cheng HY (2009). Reactive oxygen
species scavenging enzymes and down-adjustment of metabo-
lism level in mitochondria associated with desiccation-tolerance
acquisition of maize embryo. J Integr Plant Biol, 51 (7): 638–645
Xia F, Chen L, Sun Y, Mao P (2015). Relationships between ultra-
structure of embryo cells and biochemical variations during
ageing of oat (Avena sativa L.) seeds with different moisture
content. Acta Physiol Plant, 37 (4): 1–11
Xin X, Tian Q, Yin G, Chen X, Zhang J, Ng S, Lu X (2014). Reduced
mitochondrial and ascorbate–glutathione activity after artificial
ageing in soybean seed. J Plant Physiol, 171 (2): 140–147
Yao Z, Liu L, Gao F, Rampitsch C, Reinecke DM, Ozga JA, Ayele BT
(2012). Developmental and seed aging mediated regulation of
antioxidative genes and differential expression of proteins during
pre- and post-germinative phases in pea. J Plant Physiol, 169 (15):
1477–88
Yin G, Sun H, Xin X, Qin G, Liang Z, Jing X (2009). Mitochondrial
damage in soybean seed axis during imbibition at chilling tem-
peratures. Plant Cell Physiol, 50 (7): 1305–1318
Zhan J, Li W, He HY, Li CZ, He LF (2014). Mitochondrial alterations
during Al-induced PCD in peanut root tips. Plant Physiol Bio-
chem, 75: 105–113
植物生理学报550
Effect of artificial aging on soybean seed vigor and ascorbate-glutathione cycle
in mitochondria
TIAN Qian, WANG Dong, ZHANG Wen-Lan, DUAN Nai-Bin, LI Qun, YAN Ting-Jin, DAI Shuang, DING Han-Feng*
Shandong Center of Crop Germplasm Resources, Jinan 250100, China
Abstract: Using soybean seed (Glycine max L. cv. Zhonghuang No. 13) as material, changes in soybean seed
vigor and mitochondrial ascorbate-glutathione (ASC-GSH) cycle after artificial aging were investigated. The
results show that with the increase of aging time, the germination rate, germination potential, germination and
vigor indices of soybean seeds were decreased significantly. Moreover, with prolonged aging, the relative elec-
tric conductivity and the contents of malondialdehyde (MDA) in aged seeds increased gradually, and the gener-
ating rate of superoxide anion (O2·
−) and the contents of hydrogen peroxide (H2O2) presented the trend of first
increased and then decreased. In comparison with the control, the cytochrome c oxidase (COX) and malate de-
hydrogenase (MDH) activities, respiratory rate and respiratory control ratio (RCR) of mitochondria in aged
seeds were remarkably decreased. Furthermore, the activities of superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxi-
dase (APX), monodehydroascorbate reductase (MDHAR), dehydroascorbate reductase (DHAR) and glutathi-
one reductase (GR), and the total ascorbic acid (ASC) and glutathione (GSH) contents in mitochondria were re-
duced dramatically in aged seeds. These results indicate that reactive oxygen species (ROS) metabolism,
mitochondrial respiratory function and ASC-GSH cycle were disordered in aged seeds, suggesting that the ac-
cumulation of ROS may be the key factor in the loss of seed vigor.
Key words: soybean; artificial aging; mitochondria; reactive oxygen species; ascorbate-glutathione cycle
Received 2015-12-22 Accepted 2016-02-28
This work was supported by the Grain Industry Innovation Team Building of Modern Agricultural Industry Technology System of Shandong Prov-
ince (Grant No. SDARS-15-01), Public Sector (Agriculture) Special Fund Project of Scientific Research (Grant No. 201303007), “Twelfth Five-
Year” National Science and Technology Support Plan (Grant No. 2013BAD01B0106), and Youth Scientific Research Fund Project of Shandong
Academy of Agriculture Sciences (Grant No. 2016YQN19).
*Corresponding author (E-mail: dinghf2005@163.com).