全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (5): 449~455 449
收稿 2011-12-14　　修定 2012-02-29
资助 国家自然科学基金(31101529)和江苏省农业科技自主创新
资金[CX(11)4050]。
* 通讯作者(E-mail: cyh@jaas.ac.cn; Tel: 025-84390224)。
杜梨PbPEAMT的克隆、序列分析及表达特征
李慧1,2, 丛郁3, 常有宏1,2,*, 蔺经1, 盛宝龙1
1江苏省农业科学院园艺研究所, 南京210014; 2国家农业科技华东(江苏)创新中心——高效园艺作物遗传改良实验室, 南京
210014; 3中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室, 南京210008
摘要: 采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增法和长片段PCR技术, 从杜梨幼苗中获得1个磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因(Pb-
PEAMT), 运用生物信息学方法分析它的序列特点, 并通过跨内含子引物进行半定量RT-PCR研究其在非生物胁迫下的表达
情况。结果表明: PbPEAMT基因编码区DNA序列长为3 320 bp, 由11个外显子和10个内含子组成, cDNA序列长1 479 bp, 推
导的多肽包括2个II型甲基转移酶保守结构域, 与蓖麻PEAMT蛋白相似性最高(86%), 亲缘关系最近。PbPEAMT基因在杜
梨幼苗根和叶中均为诱导型表达, 100 mmol·L-1氯化钠、10% (W/V)聚乙二醇、180 mmol·L-1甘露醇或20 µmol·L-1脱落酸处理后
PbPEAMT表达水平上升, 表明PbPEAMT对盐碱、干旱和渗透胁迫存在表达响应, 可能参与ABA介导的逆境信号转导途径。
关键词: 杜梨; 磷酸乙醇胺N-甲基转移酶; 基因克隆; 表达特征
Cloning, Sequence Analysis and Expression Characterization of PbPEAMT
Gene in Pyrus betulaefolia Bunge
LI Hui1,2, CONG Yu3, CHANG You-Hong1,2,*, LIN Jing1, SHENG Bao-Long1
1Institute of Horticulture, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2Efficient Horticulture Crop Genetic
Improvement Laboratory, National Agricultural Science and Technology Jiangsu Innovative Center, Nanjing 210014, China;
3State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing
210008, China
Abstract: N-methylation of phosphoethanolamine, the committing step in choline biosynthesis in plants, is cat-
alyzed by phosphoethanolamine N-methyltransferase (PEAMT, EC 2.1.1.103). Herein we report the cloning
and characterization of a novel birch-leaf pear (Pyrus betulaefolia) phosphoethanolamine N-methyltransferase
gene (PbPEAMT) using a combination of homologous cloning, PCR and bioinformatics strategy. At the same
time, semi-quantitative PCR with cross-intron primers was adopted to study the expression features of this gene
under abiotic stresses. The results showed that the DNA sequence of PbPEAMT gene is 3 320 bp, which con-
sists of 11 exons and 10 introns. The cDNA sequence of PbPEAMT gene is 1 479 bp in length and encodes a
492-amino-acid peptide, which includes two conserved motifs of type II methyltransferase. Homology analysis
showed that the deduced PbPEAMT protein was highest homologous to castor PEAMT protein (86%). Further-
more, PbPEAMT was more related to castor PEAMT through phylogenetic analysis. RT-PCR analysis showed
that expression of PbPEAMT was induced by 100 mmol·L-1 NaCl, 10% (W/V) PEG6000, 180 mmol·L-1 manni-
tol or 20 µmol·L-1 ABA treatments. These data indicate that PbPEAMT expression responds to salinity, drought
and osmotic stresses, which may be involved in ABA-mediated stress signal transduction pathway.
Key words: birch-leaf pear (Pyrus betulaefolia); phosphoethanolamine N-methyltransferase; gene cloning; ex-
pression feature
甘氨酸甜菜碱(glycine betaine, GB)是一种季
铵盐, 它在逆境条件下能够提高植物细胞质中渗
透压、稳定蛋白质复合体和保护细胞膜结构(Ashraf
和Foolad 2007)。胆碱为植物GB合成的底物, 它的
前体磷酸胆碱由磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phos-
phoethanolamine N-methyltransferase, PEAMT; EC
2.1.1.103)催化磷酸乙醇胺连续N-甲基化来合成,
这一甲基化过程不仅是胆碱合成的起始反应也是
磷脂酰胆碱从头合成的限速步骤(Jost等2009)。由
植物生理学报450
于磷酸胆碱直接去磷酸化或磷脂酰胆碱代谢后均
能生成胆碱, 所以PEAMT在渗透调节物质GB合成
的生物化学途径中起重要作用(Jost等2009; Summers
和Weretilnyk 1993)。不同植物PEAMT的mRNA转
录水平受到盐、干旱或低温胁迫诱导上调(Sahu和
Shaw 2009; Bhuiyan等2007; Wu等2007; Tabuchi等
2005; Ye等2005; Nuccio等2000), 过量表达PEAMT
基因的转基因植株通过增加胆碱和GB的合成来提
高自身对盐胁迫的耐受能力(Wu等2007; McNeil等
2001), 表明PEAMT基因参与植物对非生物逆境的
响应。
杜梨原产我国, 为梨产区广泛应用的砧木之
一, 具备耐寒、耐旱、耐涝和耐盐碱的优良特性。
以其为砧木嫁接优良品种, 能提高梨树对逆境的
适应能力, 如以杜梨作为砧木的白梨、砂梨和西
洋梨比其他砧木上嫁接的相同品种梨树具有更强
的耐盐性(Matsumoto等2006; Okubo等2000)。梨树
在逆境条件下通过积累GB来防御胁迫(Gao等2004a,
b; 高秀萍等2002), 而其GB合成相关基因克隆及逆
境下的表达模式尚无报道, 因此克隆杜梨GB合成
途径中的上游PEAMT基因, 分析它在非生物胁迫
下的表达特点, 可为进一步阐明GB合成在杜梨抗
逆过程所起的作用提供理论基础和实验依据。
材料与方法
1 材料
杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)种子经层积后
播种于含石英砂的营养钵中, 放于光照培养箱中
培养, 培养温度(25±0.5) ℃, 光照周期14 h/10 h (光
照/黑暗), 光强为300 µmol·m-2·s-1。生长期间常规管
理, 用改良1/4MS营养液(Couturier等2007)浇灌。
氯化钠、聚乙二醇、甘露醇和脱落酸购自
Sigma公司; 总RNA提取试剂(RNAplant plus Re-
agent)、无RNA酶的DNA酶、大肠杆菌DH5α感受
态细胞和高保真DNA聚合酶(Pfu酶)购自天根生化
科技(北京)有限公司; SMARTerTM cDNA末端扩增
试剂盒、PowerScript IITM反转录酶、DNA分子量
标记和pMD®19-T克隆载体购自宝生物工程(大连)
有限公司; AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自爱思
进生物技术(杭州)有限公司; 无DNA酶和蛋白酶的
RNA酶、克隆快速检测试剂盒(EZ-lyse Rapid Col-
ony Identification Kit)和平末端DNA片段加A试剂
盒(EZ-TTM A Tailing Kit)购自北京康润诚业生物科
技有限公司; 所有引物均由上海英骏生物技术有
限公司合成, 其编号及序列见表1。
2 方法
2.1 胁迫处理
根据预实验结果, 选择100 mmol·L-1氯化钠、
10% (W/V)聚乙二醇、180 mmol·L-1甘露醇或20
µmol·L-1脱落酸为4种非生物胁迫处理。以长势健
壮、大小一致的杜梨四叶龄幼苗为处理材料, 洗
净根部石英砂后, 置于含上述浓度的氯化钠、聚
乙二醇、甘露醇或脱落酸的1/4改良MS营养液中,
于光照培养箱按原条件光照培养, 处理0、2、4、
表1 试验中采用的引物
Table 1 Primers used in this study
引物类型 引物名称 序列
5端片段扩增引物 PbPEAMT-S1 5 ATGGCTGCTTCTGCTAATGG 3
PbPEAMT-F1 5 CCTTCAACCATCCCATCATC 3
3端片段扩增引物 PbPEAMT-3-1 5 GGTGCTTTCTATGCTCCCTCCCTATG 3
PbPEAMT-3-2 5 TGGTGGAAAGGATGATGGGATGGTTG 3
UPM Long (0.4 μmol·L-1): 5 CTAATACGACTCACTATAGGGCA-
AGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3
Short (2 μmol·L-1): 5 CTAATACGACTCACTATAGGGC 3
NUP 5 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3 Control Reagents
编码区扩增引物 PbPEAMT-ORF-S1 5 ATGGCTGCTTCTGCTAATGGTGAAG 3
PbPEAMT-ORF-F1 5 TCAATTCTTCTTGGCAATGAACAGGC 3
半定量RT-PCR引物 PbPEAMT-BD-S1 5 TATGAGCGTGTCTTTGGGCT 3
PbPEAMT-BD-F1 5 CAGTTTTGCCTTCCATCCAC 3
内参引物 PbActin-BD-S1 5 GGAATGGTCAAGGCTGGGTT 3
PbActin-BD-F1 5 CAAAGCATCTGTGAGGTCACG 3
李慧等: 杜梨PbPEAMT的克隆、序列分析及表达特征 451
8 h后分别采集植株根和叶, 液氮速冻, 于-70 ℃储
藏备用。
2.2 杜梨基因组DNA和总RNA的提取
杜梨基因组DNA提取采用CTAB法(李慧等
2011), 杜梨各处理样品根或叶片的总RNA用总
RNA提取试剂提取。
2.3 PbPEAMT基因的克隆
用于PEAMT基因克隆的材料为100 mmol·L-1
氯化钠处理4 h的杜梨幼苗叶片。叶片总RNA经
DNA酶处理去除残留DNA, 取2或1 µg分别用Pow-
erScript IITM反转录酶和SMARTerTM cDNA末端扩
增试剂盒合成5端片段、编码区或3端片段扩增的
cDNA模板。
依据油菜PEAMT基因所编码的氨基酸序列
(AAP83582)为探针, 通过tblastn检索苹果EST数据
库, 选取1条含有ATG起始密码子的序列(EB140709)
作为模板, 设计引物PbPEAMT-S1/PbPEAMT-F1扩
增杜梨PbPEAMT基因的5端片段。根据获得的5
端片段设计3端基因特异嵌套引物PbPEAMT-3-1
和PbPEAMT-3-2, 分别与通用引物UPM和NUP进
行巢式PCR扩增。第1轮PCR产物稀释10倍作模板
进行第2轮巢式扩增。
比对、拼接杜梨PbPEAMT基因5端片段和3
端片段, 获得cDNA序列编码区信息, 并设计引物
PbPEAMT-ORF-S1/PbPEAMT-ORF-F1, 以杜梨叶
片cDNA和基因组DNA为模板, 用Pfu酶对其进行
扩增验证。
扩增所得各轮PCR特异产物用AxyPrep DNA
凝胶回收试剂盒进行回收后, 除Pfu酶扩增所得
PCR产物需加A再连接外, 其他PCR产物直接与
pMD®19-T克隆载体连接, 转化DH5α感受态细胞,
并进行蓝白斑筛选。挑取白斑接种于3 mL SOC
(含100 µg·mL-1氨苄青霉素)液体培养基中, 37 ℃下
200 r·min-1振荡培养过夜。菌液用克隆快速检测试
剂盒进行鉴定后, 送至上海英骏生物技术有限公
司进行序列测定。
2.4 PbPEAMT基因的序列分析
PbPEAMT基因的核苷酸翻译采用BioXM软
件, 根据它们的DNA和cDNA序列, 利用Gene Struc-
ture Display Server (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)
分析内含子和外显子组成。使用ProtParam (http://
www. expasy.ch/tools/protparam.html)分析氨基酸基
本成分。结构域分析通过InterPro (http://www.ebi.
ac.uk/InterProScan)完成。用PSORT (http://psort.
ims.utokyo.ac.jp/form.html)进行亚细胞定位预测。
氨基酸序列比对和系统进化树构建采用DNAMAN
软件完成, 所用序列来自http://www.ncbi.nlm.nih.
gov。
2.5 PbPEAMT表达特点研究
杜梨各处理样品根或叶片的总RNA用DNA酶
处理去除残留DNA, 在SmartSpec Plus核酸蛋白检
测仪(BioRad公司)上进行定量, 以1 µg RNA为模
板, 根据PowerScript IITM反转录酶说明书合成
cDNA第一链, 用RNA酶去除残留RNA。采用跨内
含子引物PbPEAMT-BD-S1/PbPEAMT-BD-F1扩增
PbPEAMT, 同时以PbActin-BD-S1/PbActin-BD-F1
为引物扩增PbActin基因作为内参基因, 进行半定
量RT-PCR, 分析PbPEAMT的表达情况。
实验结果
1 PbPEAMT基因的克隆与序列分析
以100 mmol·L-1 氯化钠处理4 h的杜梨四叶龄
幼苗叶片cDNA为模板 , 用PbPEAMT-S1/Pb-
PEAMT-F1为引物, 进行杜梨PEAMT基因5-端片段
的PCR扩增, 获得与预期片段(451 bp)大小一致的
条带(图1-A); 以PbPEAMT-3-1和PbPEAMT-3-2分
别与通用引物UPM和NUP结合, 对5端片段的3端
进行巢式PCR扩增, 得到1条大小为1 050 bp的特异
片段(图1-B)。用DNAMAN软件比对所获得的5端
片段和3端片段, 发现它们存在一段重叠区域, 证
明它们为同一基因的不同位置片段, 最终获得了1
条cDNA序列; 利用引物PbPEAMT-ORF-S1/Pb-
PEAMT-ORF-F1进行编码区cDNA序列的RT-PCR
扩增验证(图1-C), 测序结果与所拼接序列的开放
阅读框完全一致(GenBank登录号JF968605);用相
同引物对杜梨基因组DNA进行扩增, 获得该基因
编码区的DNA序列(图1-D), 其GenBank登录号
JF968606。
所获得基因的编码区DNA序列长为3 320 bp,
由11个外显子和10个内含子组成, cDNA序列长1
479 bp, 编码一个含有492个氨基酸残基的蛋白, 预
测的等电点(pI)为5.07, 估计的相对分子质量为
植物生理学报452
55.75 kDa, 分子式为C2494H3837N653O753S23。该基因
推导的多肽包括2个II型甲基转移酶保守结构域,
它们分别位于蛋白的N末端(58~157位氨基酸)和C
末端(287~384位氨基酸), 均由甲基转移酶基序I及
post-I、II和III组成(图2)。基于NCBI数据库BlastP
程序的分析结果表明, 所获得基因编码的蛋白与
其他植物PEAMT基因所推导的氨基酸序列间存在
较高的相似性, 如蓖麻(XM_002532051)为86%, 拟
南芥(NM_112681) 83%, 油菜(AY319479) 82%, 菠
菜(AF237633) 82%, 大洋洲滨藜(AB196771) 82%,
甜菜(AB221008) 80%。对植物PEAMT蛋白进行
系统进化分析的结果表明, 所获得基因的编码蛋
白与蓖麻PEAMT蛋白亲缘最近, 与碱菀PEAMT蛋
白的亲缘关系最远(图3)。综合上述特点, 认为本
研究克隆获得的基因属于植物PEAMT家族, 编码
杜梨PEAMT, 并将其命名为PbPEAMT。
2 PbPEAMT基因的表达特点
采用跨内含子引物对杜梨PbPEAMT基因在
非生物胁迫下的表达情况进行半定量RT-PCR分
析, 结果表明: 未处理前PbPEAMT在叶片中的表达
几乎检测不到; 施加氯化钠、聚乙二醇、甘露醇
或脱落酸处理后, PbPEAMT的表达丰度先上升后
下降, 并且均在处理4 h达到表达高峰(图4-A)。未
处理前PbPEAMT在杜梨根中有表达; 施加氯化钠
或聚乙二醇处理后, PbPEAMT的表达丰度持续上
升, 并且延续到处理8 h; 施加甘露醇或脱落酸处理
后, PbPEAMT的表达丰度先上升后下降, 均在处理
4 h达到表达高峰(图4-B)。
讨　　论
杜梨PbPEAMT推导的多肽包括2个II型甲基
转移酶保守结构域(图2), 符合显花植物PEAMT的
典型结构特点(Wu等2007; Tabuchi等2005; Ye等
2005; Nuccio等2000)。小麦PEAMT蛋白的N-末端
区域催化将磷酸乙醇胺转化为磷酸胆碱的三步甲
基化反应, C末端区域仅起调节三步甲基化速度和
平衡的作用, N末端或C末端甲基域缺失的PEAMT
蛋白丧失催化磷酸乙醇胺甲基化的能力, 它们分
别只能催化磷酸二甲基乙醇胺或磷酸甲基乙醇胺
甲基化(Charron等2002)。C末端甲基域缺失的菠
菜PEAMT截短蛋白只能催化将磷酸乙醇胺甲基化
的第一步反应(Nuccio等2000)。不同植物间PEAMT
蛋白2个甲基转移酶保守结构域所行使功能的差
异表明该酶在进化过程中产生不同功能的演变,
而杜梨PEAMT蛋白中2个结构域所起的具体作用
仍需进行氨基酸序列的删除和突变实验来加以证
明。
半定量RT-PCR结果显示, 杜梨PbPEAMT的表
达受到盐胁迫(100 mmol·L-1氯化钠)诱导上调(图
4), 菠菜、油菜、大洋洲滨藜和玉米的PEAMT基
因表现出类似的情况(Wu等2007; Tabuchi等2005;
Ye等2005; Nuccio等2000), 表明植物中PEAMT基
图1 杜梨PbPEAMT基因的PCR扩增产物
Fig.1 PCR amplification products of PbPEAMT from birch-leaf pear
A: 5端片段; B: 3端片段; C: 编码区cDNA; D: 编码区DNA。DNA分子量标记为250 bp DNA Ladder Marker (TaKaRa)。
李慧等: 杜梨PbPEAMT的克隆、序列分析及表达特征 453
因的表达普遍受到盐胁迫调节。而盐胁迫下盐生
植物大洋洲滨藜和甜土植物菠菜PEAMT基因表达
水平和酶活性增加, 证明PEAMT参与植物对盐胁
迫的响应(Tabuchi等2005; Summers和Weretilnyk
1993), 虽然杜梨PbPEAMT基因表达水平同样受到
盐胁迫诱导上升, 但其所起的具体作用仍需结合
酶活性分析和转基因实验来进一步证实。此外,
杜梨PbPEAMT的表达也受到干旱和渗透胁迫的诱
导而上调[10% (W/V)聚乙二醇或180 mmol·L-1甘露
醇处理], 它们的表达规律与盐胁迫下该基因的表
图2 PbPEAMT基因所推导蛋白氨基酸序列多重比对
Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequence of the deduced protein of PbPEAMT with those from other plants
图中序列依次为: PbPEAMT, 杜梨, JF968605; RcPEAMT, 蓖麻, XM_002532051; AtPEAMT, 拟南芥, NM_112681; BnPEAMT, 油菜,
AY319479; SoPEAMT, 菠菜, AF237633; AnPEAMT, 大洋洲滨藜, AB196771; BvPEAMT, 甜菜, AB221008。甲基转移酶基序I及post-I、II和
III用粗线标记, 相同的氨基酸用黑框标注。
植物生理学报454
达特点类似(图4), 表明杜梨PbPEAMT基因在植株
响应盐碱、干旱和渗透胁迫的过程中均起作用。
脱落酸是植物应对环境胁迫的重要信号转导
因子, 它介导植物对非生物胁迫(干旱、盐碱、冷
害和高温等)的响应(Agarwal和Jha 2010)。施加外
源脱落酸后, 小麦PEAMT和杜梨PbPEAMT mRNA
在根和叶片中迅速积累(Charron等2002; 图4), 暗
示着PEAMT基因可能参与脱落酸介导的植物逆境
信号转导途径。
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图3 PEAMT蛋白系统进化树分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of PEAMT proteins
图4 杜梨PbPEAMT基因在非生物胁迫下的表达检测
Fig.4 Expression detection of PbPEAMT gene under abiotic stresses in birch-leaf pear
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