全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (11): 1075~1078 1075
收稿 2011-06-01　　修定 2011-08-11
资助 广东省自然科学基金(8151063101000011)。
* 通讯作者(E-mail: lilab@scnu.edu.cn; Tel: 020-85211378)。
AhCYCB1基因的克隆和在ABA抑制花生侧根发生过程中的表达
郭栋梁1,2, 乔燕春3, 梁建华2, 李玲2,*
1广东省农业科学研究院果树研究所, 广州510641; 2华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广
州510631; 3广州市农业科学研究院, 广州510308
摘要: 根据水稻、拟南芥和玉米等植株的CYCB基因序列设计引物, 以花生根系成熟区总RNA逆转录得到的cDNA为模板,
用PCR扩增克隆花生CYCB1基因片段, 命名为AhCYCB1 (GenBank登录号为GQ868755)。该基因编码的蛋白具有CYCB1蛋
白序列的特征区, 与拟南芥的AtCYCB1蛋白聚类关系最近。半定量RT-PCR分析表明, ABA处理后, 侧根起始部位的AhCY-
CB1基因表达水平降低, ABA合成抑制剂萘普生(naproxen)处理使AhCYCB1基因表达水平明显上调。推测ABA抑制侧根发
生与其降低侧根发生部位由G2期进入M期的细胞数目有关。
关键词: 花生; ABA; 侧根发生; AhCYCB1
Cloning of AhCYCB1 Gene and Its Expression during Lateral Root For-
mation Inhibited by ABA in Peanut (Arachis hypogaea L.)
GUO Dong-Liang1,2, QIAO Yan-Chun3, LIANG Jian-Hua2, LI Ling2,*
1Fruit Tree Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510641, China; 2Guangdong Key Labo-
ratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631,
China; 3Guangzhou Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510308, China
Abstract: A peanut (Arachis hypogaea) CYCB1 gene, named AhCYCB1 (GenBank accession number:
GQ868755), was cloned from peanut root using a pair of primers, which were designed according to the homol-
ogous sequences in Arabidopsis thaliana, Oryza sativa and Zea mays. Comparative primary structure analysis
of the deduced AhCYCB1 with CYCBs from other species identified a conserved domain that the CYCB family
contains. Phylogenetic tree analysis indicated that the AhCYCB1 protein had the closest relationship with At-
CYCB1 proteins from A. thaliana plants. The expression of AhCYCB1 in the mature roots of peanut seedlings
treated with abscisic acid (ABA) was inhibited by semi-quantitative RT-PCR, while seedlings treated with
naproxen, an ABA biosynthesis inhibitor, caused an increase in AhCYCB1 expression. Taken together, the rea-
son for ABA inhibiting lateral root formatiom in peanut involved a decrease in cell number during the G2/M
transition.
Key words: peanut (Arachis hypogaea); ABA; lateral root formation; AhCYCB1
植物侧根原基在不断分裂过程中, “建成细
胞”需要通过细胞周期G1/S和G2/M关键调控点。
Beeckman等(2001)和Casimiro等(2003)指出, 在侧
根发生过程中, 生长素在特定部位的中柱鞘细胞
中的高量流入(依赖生长素内向运输载体AUX1)可
抑制细胞周期抑制剂家族(kip-related proteins,
KRPs)基因的表达。KRPs在G1/S期的转变中强烈
负调节; 抑制KRPs基因的表达, 侧根原基的发育继
续。拟南芥中细胞周期由G2期向M期的转移过程
受到细胞周期B型蛋白Arath;CYCB1;1和细胞周期
蛋白依赖性蛋白激酶AtCDC2α调控(Andersen等
2008; Burssens等2000)。对模式植物拟南芥的研究
发现, CYCB在G2期表达量开始上升, 至M期早期达
到最高 , 随后下降直至消失(Menges和Murray
2002); 根系中CYCB1;1基因在G2/M过渡期表达, 可
以推测侧根原基的位置(Doerner等1996)。
花生是我国重要的油料、能源和经济作物,
花生植株根系对干旱做出最早的反应, 在干旱条
件下促进主根伸长, 抑制侧根生长。脱落酸(absci-
sic acid, ABA)具有抑制花生种子萌发和幼苗侧根
植物生理学报1076
生长的作用(郭栋梁等2008)。我们在以前的研究
中发现外源ABA处理可推迟花生种子的发育, 通
过降低侧根原基的发生减少侧根数目 (Guo等
2009)。本文研究ABA调控花生侧根发生过程中对
细胞周期关键调控点G1/S和G2/M的影响, 为认识
ABA抑制侧根发生的作用机制提供依据。
材料与方法
1 材料
花生(Arachis hypogaea L.)品种为‘粤油7号’,
由广东省农业科学院作物研究所提供。筛选同一
收获日期、大小接近的花生种子, 用75%乙醇浸泡
1 min, 10% NaClO3浸泡10 min, 无菌水泡洗3次, 去
掉种皮, 将其分为两半, 取带有胚芽的花生子叶置
于1/2MS培养基表面, 每个培养皿(直径10 cm)播8
粒 , 分为两排 , 在光照16 h·d-1 (光照强度2 500
μmol·m-2·s-1)、日温度26 ℃和夜温度22 ℃下培养。
培养2、4、6 d后, 取已萌发胚根的成熟区部位备
用。
2 方法
2.1 花生总RNA的提取
花生种子培养6 d后, 切取已萌发胚根的成熟
区部位备用。用改进的酚/氯仿法(Wan和Li 2005)
提取花生根系成熟区部位的总RNA, 得到的RNA
沉淀溶于适量的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中, 用分
光光度计定量RNA样品并电泳检测其完整性。
2.2 克隆AhCYCB1基因片段
以2 μg总RNA为模板, 逆转录为cDNA, 根据
同源基因序列保守区设计兼并引物AhCYCB1F
(5-GTNGARTAYGTNGARGAYATCTACAART-
TC-3)和AhCYCB1R (5-ATTNACCTCNGGNGC-
CCADATYTCYTCRTA-3)、基因特异性引物Ah-
CYCB1GF (5-GTGGAGTACGTGGAGGATAT-
CTACAAGTTC-3)和AhCYCB1GR (5-ATTCA-
CCTCGGGGGCCCAGATCTCCTCGTA-3), 分别用
primary和nested PCR扩增AhCYCB1基因的3′端。
2.3 ABA及其抑制剂处理
根据前期浓度筛选试验结果, 选定ABA处理
浓度为5 μmol·L-1, ABA合成抑制剂萘普生(naprox-
en)处理浓度为25 μmol·L-1 (戴艳红等2011)。将带
有胚芽的花生子叶分别置于加入5 μmol·L-1 ABA或
25 μmol·L-1 naproxen溶液的1/2MS培养基上培养;
以不加任何激素的1/2MS培养基上的子叶为对照。
实验使用的ABA及naproxen 均为Sigma公司
的产品。
2.4 原生质体的提取与细胞周期检测
采用黄玲等(2009)的方法提取花生原生质体,
使原生质体的浓度达到1×106个·mL-1。采用流式
细胞仪检测细胞周期。
取原生质体提取液1 mL, 1 500×g离心5 min。
用0.01 mol·L-1磷酸缓冲液(PBS)洗涤、离心2次后,
加入1 mL的PBS于试管中, 置快速混匀器上充分振
荡成单原生质体悬液, 加入4 ℃预冷的无水乙醇2
mL, 立即振荡混匀, 用封口膜封口, 置4 ℃冷藏室
24 h, 1 000×g离心5 min, 用PBS洗涤、离心2次。
0.5 mL PBS重悬原生质体, 加入碘化丙啶(propidi-
um iodide, PI)和RNase A至终浓度50 µg·mL-1, 37 ℃
温浴30 min。流式细胞仪检测原生质体细胞周期
所用的激光波长为488 nm, 发射波长为525 nm。
每份标本均检测5 000个原生质体, 用DNA Multi-
Cycle软件进行统计分析。
2.5 花生根系中AhCYCB1基因的PCR扩增
采用TaKaRa PrimeScriptTM One Step RT-PCR
Kit, 进行半定量RT-PCR, 检测基因的转录表达水
平。PCR反应的内标为18S rRNA, 用于扩增18S
rRNA的引物为18S-F (5-ATTCCTAGTAAGCGC-
GAGTCATCAG-3)和18S-R (5-CAATGATCCTTC-
CGCAGGTTCAC-3) (Wan和Li 2005)。目标基因
的特异性PCR引物为AhCYCB1GF和AhCYCB-
1GR。
实验结果
1 花生AhCYCB1基因片段的克隆与分析
根据已报道的CYCB1基因设计简并引物Ah-
CYCB1F和AhCYCB1R进行PCR, 扩增出同源基因
片段, 经测序获得350 bp大小的RT-PCR产物(图1),
其中含编码区333 bp, 编码111个蛋白(图2)。用
BLASTn和BLASTp分析序列, 发现其具有CYCB1
基因家族所具有的保守蛋白区(LTDVHTKF), 推测
属于该家族的成员, 命名为AhCYCB1 (图2)。经过
与水稻OsCYCB1;1 (GenBank登录号: Q0JIF2), 拟
南芥AtCYCB1;1 (AEE86801)、AtCYCB1;2
郭栋梁等: AhCYCB1基因的克隆和在ABA抑制花生侧根发生过程中的表达 1077
(NP_196233)、AtCYCB1;3 (NP_187759)、AtCYCB1;4
(AEC07883), 玉米ZeCYCB1;1 (NP_001105363)等
物种的同源氨基酸序列相比较, 构建系统进化树,
发现该氨基酸序列与拟南芥的AtCYCB1亲缘关系
最近(图3)。根据已知序列设计基因特异性引物用
于基因转录本水平分析。
2 AhCYCB1基因在花生侧根发生部位的表达
由图4可见, 对照幼苗在侧根起始阶段(第2
天), 侧根发生部位AhCYCB1基因表达量较低, 随着
侧根原基进入发育阶段(第4天)和伸出阶段(第6
天), 其表达量增加。ABA处理2、4和6 d的侧根,
在发生部位AhCYCB1基因的表达比对照降低 ,
naproxen处理使基因的表达量上调。其中ABA处
理4 d的基因表达量受抑制明显 , 与对照相比 ,
naproxen处理4 d时AhCYCB1基因表达水平上调最
为显著。
3 ABA和naproxen对花生根系成熟区细胞周期变
化的影响
图5显示, ABA处理6 d的花生, 在侧根发生部
位处于细胞分裂间期G1期的细胞数目占细胞总数
的79.9%, 比对照增加5.8%; naproxen处理的占
图1 AhCYCB1基因片段的RT-PCR产物
Fig.1 RT-PCR production of AhCYCB1 gene
图2 AhCYCB1测序结果及保守域分析
Fig.2 The sequence and the search result of AhCYCB1 conserved region
图3 AhCYCB1蛋白的系统进化树分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of AhCYCB1 and
other CYCB1 proteins
图4 ABA对花生侧根发生过程中AhCYCB1表达的影响
Fig.4 Effect of ABA on AhCYCB1 expression during
lateral root formation in peanuts
1: 对照; 2: ABA处理; 3: naproxen处理。
图5 ABA处理6 d对花生根系成熟区细胞时相的影响
Fig.5 Effect of ABA on the cell phases in mature
areas of peanut roots for 6 d
植物生理学报1078
67.5%, 比对照降低11.9%。ABA处理使主根成熟
区部位处于细胞分裂间期S期的细胞数目比对照
降低1 8 % , n a p r o x e n处理的比对照植株增加
31.8%。ABA处理和对照花生植株的主根成熟区
部位, 没有处于G2期的细胞, naproxen处理使细胞
分裂时期G2期的细胞数目占细胞总数的0.16%。
讨　　论
植物侧根原基起始于中柱鞘细胞, 经过细胞
周期G2/M期进入侧根起始阶段(Verkest等2005)。
植物中B类细胞周期蛋白在细胞周期的G2/M转换
过程中起到重要作用。CYCB1;1基因只在G2/M过
渡期表达, 通过检测其表达了解细胞的分裂状态
(Doerner等1996)。为了证实ABA抑制花生侧根原
基发生的机制, 本研究用ABA和ABA合成抑制剂
naproxen处理幼苗, 观察其侧根发生部位中柱鞘细
胞的分裂以及G1/S和G2/M时期细胞数目变化。结
果发现, ABA处理6 d增加了G1期的细胞数目, 降低
了S期的细胞数目; naproxen处理后的结果相反。
表明在ABA抑制侧根发生的过程中, 侧根分生部
位由细胞周期关键调控点G1期向S期的转移受到
抑制, 使部分建成细胞不能启动分裂, 形成侧根原
基, 从而降低侧根数目。
不管ABA是否处理花生主根, 其成熟区部位
细胞都没有进入G2期; naproxen处理后, G2期的细
胞数目占细胞总数的0.16%。分析G2/M期特异基
因AhCYCB1的表达后发现, ABA处理2、4和6 d, 侧
根发生部位的AhCYCB1基因表达比对照降低, 而
naproxen处理的表达量上调。推测ABA处理降低
了由G2进入M期的细胞数目, 尤其是处理4 d的降
低效果最明显; 这与我们前期研究结果——ABA
在处理4 d使侧根原基数目大量减少相符合(Guo等
2009)。
拟南芥侧根原基的起始发生在平周分裂和垂
周分裂之前, 中柱鞘细胞经过细胞周期G1/S期。在
侧根起始过程中, ABA通过抑制KRPs水平对G1/S
期转变过程起调控作用(De Veylder等2001), 过表
达KRP2基因, 抑制木质部中柱鞘细胞的分裂, 通过
GUS标记, 证实侧根原基数目明显减少。中柱鞘
细胞由G1转至S期, 细胞开始第一次分裂前, 侧根
起始基因表达水平发生变化, ABA抑制部分侧根
起始基因AIR12和IAA19的表达(De Veylder等
2001)。在花生侧根原基起始过程中, ABA通过调
控G1/S和G2/M, 降低中柱鞘侧根原基的数目。至
于ABA对花生侧根原基的抑制作用是否与拟南芥
相同, 还需要进一步研究。
参考文献
戴艳红, 郭栋梁, 李玲(2011). ABA 抑制花生侧根发生. 植物生理学
通讯, 47 (1): 75~79
郭栋梁, 王静杰, 万小荣, 李玲(2008). 外源脱落酸抑制花生种子发
芽的生理机制. 植物生理学通讯, 44 (5): 936~938
黄玲, 赵凯, 孔贺, 周红梅, 王晶珊(2009). 花生原生质体分离与培
养. 中国农学通报, 25 (14): 47~50
Andersen SU, Buechel S, Zhao Z, Ljung K, Novak O, Busch W,
Schuster C, Lohmann JU (2008). Requirement of B2-type
cyclin-dependent kinases for meristem integrity in Arabidopsis
thaliana. Plant Cell, 20: 88~100
Beeckman T, Burssens S, Inzé D (2001). The peri-cell-cycle in Arabi-
dopsis. J Exp Bot, 52: 403~411
Burssens S, Himanen K, van de Cotte B, Beeckman T, Montagu MV,
Inzé D, Verbruggen N (2000). Expression of cell cycle regulato-
ry genes and morphological alterations in response to salt stress
in Arabidopsis thaliana. Planta, 211 (5): 632~640
Casimiro I, Beeckman T, Graham N, Bhalerao R, Zhang HM, Casero P,
Sandberg G, Bennett MJ (2003). Dissecting Arabidopsis lateral
root development. Trends Plant Sci, 8 (4): 165~171
De Veylder L, Beeckman T, Beemster GT, Krols L, Terras F, Landrieu
I, van der Schueren E, Maes S, Naudts M, Inzé D (2001). Func-
tional analysis of cyclin-dependent kinase inhibitors of Arabi-
dopsis. Plant Cell, 13 (7): 1653~1667
Doerner P, Jergensen JE, You R, Steppuhn J, Lamb C (1996). Control
of root growth and development by cyclin expression. Nature,
380: 520~523
Guo DL, Liang JH, Li L (2009). Abscisic acid (ABA) inhibition of
lateral root formation involves endogenous ABA biosynthesis in
Arachis hypogaea L. Plant Growth Regul, 58: 173~179
Inze D, De Veylder L (2006). Cell cycle regulation in plant develop-
ment. Annu Rev Genet, 40: 77~105
Menges M, Murray JAH (2002). Synchronous Arabidopsis suspen-
sion cultures for analysis of cell-cycle gene activity. Plant J, 30
(2): 203~212
Verkest A, Weinl C, Inze D, De Veylder L, Schnittger A (2005).
Switching the cell cycle. Kip-related proteins in plant cell cycle
control. Plant Physiol, 139: 1099~1116
Wan XR, Li L (2005). Molecular cloning and characterization of a
dehydration-inducible cDNA encoding a putative 9-cis-epoxy-
carotenoid dioxygenase in Arachis hypogaea L. DNA Seq, 16 (3):
217~223