全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 7 期, 2010 年 7 月 659
收稿 2010-01-22 修定 　2010-05-07
资助 国家自然科学基金(30 7 00 5 1 9)、浙江省自然科学基金
(Y 30 90 64 5)和浙江省大学生科技创新项目。
* 通讯作者(E-mail: yangl@zjnu.cn; Tel: 0579-82282396)。
番茄 LeCIPK3的克隆及非生物胁迫诱导的表达分析
李莉, 李毅, 王长春, 王锋青, 杨玲 *
浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华 321004
提要: CIPK是植物钙感受器蛋白钙调磷酸酶B类似蛋白特定靶向的一类丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶。采用同源基因克隆法,
在番茄叶中克隆了一个与AtCIPK3处于同一亚组的基因, 命名为LeCIPK3。表达分析表明, LeCIPK3主要在根和花中表达,
在叶中的表达受脱落酸、聚乙二醇及低温的诱导, 可能在番茄多种胁迫抗性中起重要作用。
关键词: 番茄; CIPK; 克隆; 表达; 非生物胁迫
Cloning and Expression Analysis of LeCIPK3 in Tomato Seedlings under Abi-
otic Stress
LI Li, LI Yi, WANG Chang-Chun, WANG Feng-Qing, YANG Ling*
College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China
Abstract: CIPK (calcineurin B-like proteins-interacting protein kinase), a plant-specific family of serine-threo-
nine protein kinase, is specifically targeted by calcineurin B-like proteins. The degenerate primers were designed
on the basis of a highly conserved region in N terminal of CIPK family. A CIPK gene, which was assigned into
the same sub-group as AtCIPK3, was cloned from tomato leaves and named as LeCIPK3. The expression
analysis showed LeCIPK3 had highest expression level in flowers and roots under the normal condition, while
it could be induced in leaves by abscisic acid, polyethylene glycol and cold. These results suggested that LeCIPK3
might be involved in many types of abiotic stresses.
Key words: Lycopersicon esculentum; CIPK; clone; expression; abiotic stress
为适应干旱、高盐、低温等各种非生物胁
迫, 植物激活了包括信号识别、转导及特异性胁迫
相关基因的表达等分子网络级联反应, 发生一系列
分子、细胞和生理的变化, 从而提高对逆境的适应
性。这种诱导型的环境适应过程在植物中普遍存
在, 且对于植物的生存适应非常重要(Xiong等2002;
Kolukisaoglu 等 2004)。
大量证据表明Ca2+ 是参与植物环境适应普遍
的第二信使, 通过与钙感受器蛋白结合, 传递、放
大特异性的钙信号, 从而引起一系列的生理反应
(Batistic 和 Kudla 2009; Luan 2009)。钙调磷酸酶
B 类似蛋白(calcineurin B-like protein, CBL)是近年
来发现的植物所特有的一类新型EF手型钙感受器
蛋白, 结构非常保守, 当其识别钙信号后, 需与下游
的CIPK (CBL interacting protein kinase, 也称SnRK3
或PKS)结合发挥效能(Batistic和Kudla 2004; Luan
2009)。CIPK是一类具有生物活性的丝氨酸 /苏氨
酸蛋白激酶, 通常具有 N 端激酶域和 C 端调节域。
C端调节域内有一保守的 21~24个氨基酸结构, 能
有效结合CBL, 由于功能上的重要性和具有保守的
氨基酸结构 Asn-Ala-Phe, 该区域被定义为 NAF 结
构域(Albrecht 等 2001)。在拟南芥、水稻和银杨
中相继发现分别有 26、30 和 27 个 CIPK 基因, 各
有10个CBL基因(Kolukisaoglu等2004; Yu等2007;
Batistic 和 Kudla 2009)。
虽然CBL和CIPK各自家族内成员间结构非常
保守, 但这些相似蛋白的功能却并非相同。由于
CBL与 CIPK互作才能将信号向下游传递, 理论上
它们的组合将会产生数以百计的信号通路来充分应
对各种胁迫及生长发育的要求, 这预示存在着复杂
多样、信号间交叉传导的网络系统。目前已部分
解析了 CBL/CIPK 信号途径在植物盐害、低钾、
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硝酸盐等胁迫抗性中的生物学功能(Xu 等 2006;
Cheong 等 2007; Mahajan 等 2008; 张俊文等 2008;
Hu 等 2009; Luan 2009)。CIPK 序列保守, 在同一
植物中序列高度相似的CIPK间存在一定的功能冗
余, 但不同个体CIPK可能介导特殊的抗逆反应; 在
不同的植物中, 高度相似的CIPK其功能可能相同,
也可能不同(Mahajan等 2006; Martinez-Atienza 等
2007), 这就要求必须对不同物种CIPK功能进行详
细的研究, 从而揭示CIPK介导的复杂网络机制, 为
通过基因工程手段改良作物抗逆性提供可能。
番茄是研究基因功能的模式植物之一。虽然
CBL-CIPK部分信号途径研究在拟南芥和水稻中获
得重大突破, 但番茄中的相关研究尚未见报道。本
研究根据拟南芥 CIPK 的保守区设计简并引物, 以
低温处理的番茄叶片cDNA为模板, 克隆得到一个
CIPK 基因, 并分析了其在非生物胁迫下的表达。
材料与方法
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) ‘中蔬四号’
种子用 1% 次氯酸钠溶液消毒 5 min, 水清洗干净,
均匀播种于铺有湿滤纸的培养皿内, 置 28 ℃培养
箱培养。当胚根萌发后, 移至营养土中培养, 昼夜
温差为 28 ℃/22 ℃, 相对湿度约 70%, 光照时间 14
h·d-1, 光照强度 300 μmol·m-2·s-1。当植株长至三叶
期时用Hoagland营养液培养, 四叶一心期时分别转
移至 15% 聚乙二醇(PEG-6000)、20 μmol·L-1 ABA
溶液和 4 ℃冷室中处理, 分别于处理 0、2、6、12
和 24 h 时取样; 剪取番茄四叶期的根、茎、叶及
成熟期的花、果实。快速液氮冷冻, 保存于-80 ℃
中备用。
根据已报道的多个拟南芥CIPK基因保守区序
列, 设计简并引物1, 1-F为: 5 CA(A/G)ATAA(A/G)-
GCGGGAGAT 3, 1-R为: 5 ATG(C/T)TT(A/G)AA-
(C/T/A)CCTTTCTT(G/A)AAC 3。TRIzol 试剂法
提取冷处理的番茄叶片总 RNA, 逆转录为 cDNA,
PCR 扩增基因片段。反应条件为：94 ℃预变性
4 min; 94 ℃变性 30 s, 53 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s,
30 个循环; 然后 72 ℃延伸 10 min。在推测的 ORF
序列两侧设计特异引物 2, 2-F 为: 5 ATGAATC-
AGGCAAAAATCAAGC 3, 2-R 为: 5 CTACC-
TAGCTTGCATGTCCTC 3。以冷处理番茄叶片
cDNA为模板, 60 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 2 min, 其
余步骤同上, 扩增得到该基因的 ORF 序列。扩增
产物用 H.Q.&.Q 凝胶回收试剂盒割胶回收后连接
pMD18-T 载体上, 测序。
在NCBI数据库进行番茄CIPK序列的BLASTx
检索, 将其氨基酸序列与同源性较高的 CIPK 和功
能明确的 AtCIPK3 通过 Clustalx1 软件比对, 用
GeneDoc 软件输出结果。运用 MEGA 4.1 软件进
行进化树分析。在拟南芥基因组网站(http://mips.
gsf.de/proj/thal/db/Index.html)得到拟南芥CIPK的氨
基酸序列, 在网站(http://www.expasy.org/prosite)进
行番茄 CIPK 氨基酸序列的结构分析。
半定量RT-PCR分析基因转录水平时, 以不同
逆境处理和不同组织的cDNA为模板, 根据所得序
列非保守区设计特异引物3, 3-F为: 5 TCAGTTAT-
ACGAGGTGTTGGC 3, 3-R 为: 5 ACATCATCC-
AGGTTGGCATCTC 3, PCR 循环数为 28。以番
茄Actin为内参, Actin-F为: 5 GAACTGGAATGGT-
GAAGGCTG 3, Actin-R 为: 5 ACACGAAGCTC-
ATTGTAGAAA 3。重复 3 次。
结果与讨论
1 番茄CIPK基因的克隆
根据已知的拟南芥CIPK基因保守区序列, 设
计简并引物 1, 在冷处理的番茄叶片 cDNA中 PCR
扩增出约654 bp的片段, 经BLASTn比对发现该片
段位于已注册的 1 987 bp 的番茄 cDNA (登录号
AK327356.1)内部538~1 191 bp序列之间。DNAstar
分析预测该 cDNA 序列包含一个 1 314 bp 的开放
阅读框。按材料与方法所述, 设计特异性引物 2,
克隆得到了LeCIPK基因1 314 bp的开放阅读框序
列, 与 AK327356.1 内部 370~1 683 bp 间序列完全
一致。BLASTx比对结果表明, 该序列与蓖麻(Ricinus
communis) CIPK (ACG56676.1)有 93% 相似性, 与
葡萄(Vitis vinifera) CIPK18 (ACQ83534)有 91% 相
似性, 与胡杨(Populus trichocarpa) CIPK3 (ABJ91211)
有 86% 相似性, 与豇豆(Vigna unguiculata) CIPK1
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(BAF74756.1)有85%相似性, 与AtCIPK3 (At2g26980)
相似性达 82%。
2 生物信息学分析
CIPK是一类保守的蛋白激酶, N端激酶域高度
相似于酵母 SNF1 (sucrose non-fermenting), C 端的
NAF 结构域高度保守。通过蛋白质分析系统推断
LeCIPK 蛋白的分子量 49.73 kDa, 等电点 6.72。用
PROSITE 数据库分析表明：氨基酸第 13~268 位
为蛋白激酶结构域, 第 19~42 位 IGEGTFAKVKF-
ARNSETGEAVAIK 为蛋白激酶 ATP 结合区, 第
132~144位VYHRDLKPENLLL为Ser/Thr蛋白激酶
活性位点, 第 154~183 位 DFGLSALSQQVRDDG-
LLHTTCGTPNYVAPE 为激活环; 在调节域中, 第
306~330 位 EQPTPMNAFELISMSKGLNLGNLFD
为 CIPKs 蛋白家族保守的 NAF 结构域(图 1)。将
预测的蛋白序列与已知的多个 CIPK 进行比较, 激
酶域中的功能位点和NAF域与其他CIPK一样非常
保守, 进一步证实该基因为LeCIPK家族中的一员,
推测的开放阅读框可能为实际的阅读框。
拟南芥 CIPK 家族、LeCIPK及其同源性较高
图 1 番茄 CIPK 与其他植物 CIPK 氨基酸序列的同源性比较
Fig.1 Homology comparison of CIPK amino acid sequences in tomato (Le) and other plants
方框内为 ATP 结合区; 下划线为蛋白激酶活性位点; 黑色背景为激活环; 灰色背景为 NAF 结构域; 虚线部分为相同的氨基酸;
空格为缺失氨基酸。GenBank 登录号分别为葡萄 VvCIPK1 8 (ACQ 83 534 )、豇豆 Vu CIPK1 (BAF74 756 .1 )和拟南芥 AtCIPK3
(At2 g2 69 8 0)。
的其他物种的 CIP K 蛋白间的进化关系见图 2。
LeCIPK属于CIPK激酶组, 与AtCIPK3处于同一亚
组, 因此将此基因命名为 LeCIPK3。
3 LeCIPK3基因的表达分析
采用 RT-PCR 技术分析了 LeCIPK3 在番茄不
同组织中的转录水平, 发现该基因在番茄的花与根
中具有较高的表达水平, 在茎、叶、果实中的表
达量很低(图3-A), 说明该基因的表达存在组织特异
性。
CIPK在植物对多种胁迫抵御中起着重要作用
(Xu等 2006; Cheong等 2007; Mahajan等 2008; Hu
等 2009; Luan 2009)。进化树分析显示 LeCIPK3
与 A t C I P K 3 属同一亚组。这一亚组成员中 ,
AtCIPK3 参与了 ABA 和冷胁迫的信号传导途径
(Kim等 2003), VuCIPK1受冷、干旱胁迫诱导表达
(Imamura 等 2008)。这暗示 LeCIPK3 可能也具有
相似的功能。为了明确 LeCIPK3 在番茄抗逆性中
的作用, 进一步分析了该基因在 PEG、ABA、低
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图 2 LeCIPK 与相关蛋白激酶的进化分析
Fig.2 Phylogenic analysis of LeCIPK and related protein kinases
VuCIPK1 (BAF74756.1)来源于豇豆; VvCIPK18 (ACQ83534)来源于葡萄; RcCIPK (ACG56676.1)来源于蓖麻; PtCIPK3
(ABJ91211)和 PtCIPK4 (ABJ91212)来源于银杨; OsCIPK3 (AP003818)来源于水稻; SNF1 (AAA35058)来源于酵母; AtCIPK1
(At3g17510)、AtCIPK2 (At5g07070)、AtCIPK3 (At2g26980)、AtCIPK4 (At4g14580)、AtCIPK5 (At5g10930)、AtCIPK6
(At4g30960)、AtCIPK7 (At3g23000)、AtCIPK8 (At4g24400)、AtCIPK9 (At1g01140)、AtCIPK10 (At5g58380)、AtCIPK11
(At2g30 36 0)、AtCIPK1 2 (At4g1 87 0 0)、AtCIPK13 (At2 g3 4 18 0)、AtCIPK14 (At5 g0 1 82 0)、AtCIPK15 (At5 g0 1 81 0)、
AtC IPK1 6 (A t2 g2 5 0 9 0 )、AtC IPK1 7 (A t1 g4 8 2 6 0 )、AtC IPK1 8 (A t1 g2 9 2 3 0 )、AtC IPK1 9 (A t5 g4 5 8 1 0 )、At CIPK 2 0
(At5g45820)、AtCIPK21 (At5g57630)、AtCIPK22 (At2g38490)、AtCIPK23 (At1g30270)、AtCIPK24/SOS2 (At5g35410)、
AtCIPK25 (At5g25110)和 AtCIPK26 (At5g21326)来源于拟南芥。
温胁迫下的表达。结果表明, 3 种处理均显著诱导
了 LeCIPK3 在番茄叶中的表达。LeCIPK3 表达量
在 ABA 处理 6 h 后急剧增加, 直到 24 h 均保持了
较高的表达水平(图 3-B)。PEG 处理后, LeCIPK3
表达虽然也显著增强, 但诱导的速度明显滞后于
ABA 的诱导, 到 24 h 时才有显著提高(图 3-C), 这
表明LeCIPK3的表达对ABA可能更敏感。低温处
理后, LeCIPK3 的表达逐渐增强, 在 24 h 达到最大
(图 3-D)。
ABA是广谱的胁迫激素, 干旱胁迫也涉及ABA
的信号转导途径(Zhu 2002), 因此PEG可能与ABA
具有相似的诱导作用。实验结果表明, LeCIPK3均
可被PEG与ABA诱导, 并具有相似的表达模式(图
3-B、C), 说明 LeCIPK3 可能确实在抵御干旱胁迫
中发挥作用。二者相比, ABA 能更加快速的诱导
LeCIPK3的表达, 这间接说明PEG诱导LeCIPK3的
表达可能是通过 ABA 来实现的。此外, LeCIPK3
在冷处理胁迫下随着时间的延长, 表达量逐渐增高,
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表明LeCIPK3在番茄抗冷胁迫中也起着重要作用,
这说明不同基因个体可能具有独特的作用。综上
所述, 我们认为LeCIPK3可能在番茄的抗旱与抗冷
胁迫中起着重要作用。
参考文献
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图 3 半定量 RT-PCR 分析 LeCIPK3 基因在番茄
组织部位及逆境处理下的表达
Fig.3 Expression pattern of LeCIPK3 gene in different
tissues and under abiotic stresses by
semi-quantitative RT-PCR
A: 不同组织中的表达; B: 20 μmol·L-1 ABA 处理; C: 15%
PEG-6000 处理; D: 4 ℃处理。