全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (8): 764~770764
收稿 2013-02-25　　修定 2013-05-20
资助 “十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAD12B02)和山东
省水果创新团队专项资金。
* 通讯作者(E-mail: dsgao@sdau.edu.cn; Tel: 0538-8249659)。
油桃组蛋白基因PpH3.3的克隆和表达分析
冷传远, 李玲, 谭钺, 陈修德, 高东升*
山东农业大学园艺科学与工程学院, 国家苹果工程技术研究中心, 山东泰安271000
摘要: 组蛋白H3与H2A、H2B、H4共同形成真核生物染色质核小体的八聚体核心。本文通过RACE的方法从休眠期的油
桃花芽中克隆到一个编码组蛋白H3变体的基因, 命名为PpH3.3。序列分析结果表明, 该基因全长821 bp, 存在一个完整的
开放阅读框411 bp, 编码136个氨基酸。预测的氨基酸序列具有H3家族典型的保守结构域, 与拟南芥、葡萄的组蛋白H3, 具
有较高的相似性。利用荧光定量PCR技术分析该基因在花芽休眠进程中的表达特异性, 发现PpH3.3在休眠期表达水平显
著高于休眠诱导期和休眠解除期, 并且单氰胺和高温处理能够诱导类似的表达模式。
关键词: 桃树; 组蛋白; RACE; 荧光定量PCR; 休眠
Clone and Expression Analysis of a cDNA Encoding Histone H3.3 in Prunus
persica var. nectarina Maxim
LENG Chuan-Yuan, LI Ling, TAN Yue, CHEN Xiu-De, GAO Dong-Sheng∗
National Research Center for Apple Engineering and Technology, College of Horticulture Science and Engineering, Shandong
Agricultural University, Taian 271000, China
Abstract: Histone H3 is one of the four histones, along with H2A, H2B and H4, which forms the eukaryotic
nucleosome octomer core. In this study, a novel histone H3 variant gene was isolated from dormant Prunus
persica var. nectarina floral buds with rapid amplification of cDNA ends (RACE), designated as PpH3.3. The
PpH3.3 cDNA is 821 bp long and contains an open reading frame (ORF) of 411 bp encoding 136 amino acids.
Sequence alignments indicate that PpH3.3 contains conserved regions found in histone H3 and shows a high
level of sequence similarity to many other plants. The expression profile of the PpH3.3 gene detected by QRT-
PCR showed that the transcripts of PpH3.3 was high in dormancy period of buds and both high temperature and
hydrogen cyanamide lead similar expression pattern.
Key words: Prunus persica var. nectarina; histone; RACE; real-time quantitative PCR; dormancy
真核生物细胞核内的染色质是一切遗传学过
程的物质基础, 染色质的基本单位是核小体。组
蛋白H3与H2A、H2B、H4共同形成核小体的八聚
体核心。大部分的组蛋白H3是属于复制依赖型蛋
白, 它们的表达一般与细胞周期的S期相关联, 在
这个时期组蛋白与新合成的DNA组装成染色质。
对于不同状态的染色质, 核小体中会组装入相应
的组蛋白H3变体, 且各种组蛋白的尾部也能发生
多种修饰(Sarma和Reinberg 2005)。组蛋白变体嵌
入核小体形成了结构和功能各异的核小体, 在生
物体表观遗传过程中起非常重要的作用。目前已
发现的组蛋白H3的变体有着丝粒特异的CenH3和
转录激活的核小体中的H3.3 (Henikoff等2004), 还
有精巢特异的H3t (Govin等2005)。H3.3变体是由
组蛋白基因簇之外的基因编码的, 它的表达不限
于S期, 因此, H3.3变体的替换不依赖复制进行(Jin
等2005)。H3.3主要通过与一些分子伴侣如HIRA、
DAXX、ATRX以及DEK等作用, 从而代替H3.1与
转录活化的染色质结合, 影响染色质的活性, 在生
殖细胞的发育、表观遗传记忆和染色质重塑等方
面发挥重要的作用(Tagami等2004)。然而, 有的研
究也发现一些基因能够在没有H3.3的情况下正常
表达, 而且H3.3也能够在着丝粒和端粒等染色质
的非活性区域富集, H3.3在端粒处的富集能够抑制
端粒RNA的转录(Szenker等2011; Sakai等2009)。
休眠是指含有分生组织的植物结构可见生长
的暂时停止。在杨树导管形成层从生长转入休眠
冷传远等: 油桃组蛋白基因PpH3.3的克隆和表达分析 765
的过程中, 分生组织转录组的差异说明可能存在
一个全局性的调控机制影响着这个过程(Schrader
等2004)。休眠诱导和解除中不仅仅是基因表达发
生变化, 也同时伴随着表观遗传变化。在土豆块
茎打破休眠过程中伴随着DNA甲基化和组蛋白的
多重乙酰化的变化(Law和Suttle 2003, 2004)。随
着休眠的诱导而增加的DNA甲基化程度说明染色
体重塑可能在调控芽休眠中有重要作用。Santa-
maría等(2009)的研究也发现, 板栗的基因组DNA
的甲基化和组蛋白H4的乙酰化与芽休眠的形成与
解除关系密切。
前人的研究多侧重于组蛋白的修饰, 对组蛋
白的变体在休眠中的作用未做研究。本文利用实
验室构建的休眠期和休眠解除期的抑制差减文库
筛选的基因片段, 通过RACE的方法分离了编码组
蛋白H3变体的基因PpH3.3, 对其表达特性和功能
进行了初步分析, 对于休眠机理的研究具有一定
意义。
材料与方法
1 试验材料与处理
从2010年9月到2011年2月每隔20 d采集十年
生‘曙光’油桃(Prunus persica var. nectarina Maxim
cv. Shuguang)花芽, 迅速置于液氮中速冻, 于–70 ℃
冰箱中保存备用。所用‘曙光’油桃栽种于山东农
业大学群星园艺场(35°38~36°28N, 116°20~
117°59E, 海拔153 m), 正常管理, 生长状况良好。
按照相同的取样时间, 采集树冠外围(自始至
终是在同一方位和同一高度上的枝条)带有花芽和
叶芽的20根一年生枝条, 采用清水插枝法测定休
眠状态。具体操作步骤参照Jian等(1997)的方法。
测定第1颗芽萌发所需的时间(d), 表示休眠状
态。当10 d≤第1颗芽萌发所需时间≤6周时, 表明
芽体已进入自然休眠诱导状态。若连续6周未萌
发, 则表明已进入休眠期。随着休眠的进行, 需冷
量不断满足, 萌芽所需时间变短, 但再次出现10
d≤第1颗芽萌发所需时间≤6周时, 表明芽体进入
休眠解除期。
取休眠期的油桃枝条用单氰胺和高温处理进
行破眠。单氰胺处理为喷施0.5%单氰胺后转移至
人工气候室, 对照为喷蒸馏水。高温处理为置于
50 ℃高温环境中1 h后转移至人工气候室, 对照为
置于室温1 h。人工气候室条件为温度25 ℃, 光照
强度40 μmol·m-2·s-1, 昼/夜12 h/12 h, 相对空气湿度
80%。于1、2、4和8 d分别观察和取样。将花芽
置于液氮中冷冻, 提取RNA。每处理3个重复。
2 试验方法
2.1 DNA与RNA提取及cDNA链的合成
取油桃花芽, 用CTAB法提取总DNA, 用改良
的CTAB法提取RNA (Porebski等1997), 电泳检测
证明提取的总RNA质量良好。根据RevertAidTM
First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)说明书,
反转录合成cDNA链。
2.2 目的基因的分离
根据已获得的PpH3.3基因中间片段序列设计
特异引物3P1, 与B26引物进行PCR, 然后以该PCR
产物为模板, 以引物3P2和B25进行嵌套PCR (表1),
扩增得到3′端片段。参照TaKaRa公司的5′-Full
RACE Kit试剂盒, 设计5′端引物5P1和5P2, 以油桃
的cDNA为模板, 进行RACE扩增。将经测序验证
后的5′ RACE和3′ RACE片段与中间片段进行拼
接, 得到全长cDNA序列。根据拼接序列, 设计全
长扩增引物, 验证拼接结果。根据已获得的目的
基因的cDNA序列, 设计引物G1和G2, 经扩增得到
基因组序列。
2.3 油桃PpH3.3序列的生物信息学分析
根据NCBI的ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/gorf/gorf.html)寻找开放阅读框。通过Prot-
param (http://web.expasy.org/protparam/)分析
PpH3.3的理化性质。将基因PpH3.3编码的氨基酸
序列在NCBI数据库中的BLAST (http://blast.ncbi.
nlm.nih.gov/)进行同源性搜索和比对, 利用DNA-
man 6.0和MEGA 5.05软件分析PpH3.3蛋白与其他
植物的H3.3蛋白的进化关系, 构建分子进化树。
2.4 PpH3.3基因的实时荧光定量PCR分析
提取油桃不同自然休眠阶段(休眠诱导期、
休眠期和休眠解除期)和不同破眠处理的花芽总
RNA, 采用SYBR® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH
Plus) (TAKARA公司)合成cDNA第一条链。
PpH3.3定量PCR引物如表1, 以Actin为内参。
按照SYBR® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)说
明书, 在iCycler iQ5 system实时定量PCR仪上进行
植物生理学报766
PCR反应。反应体系为: 10 μL SYBR® Green PCR
Master Mix, 2 μL cDNA, 正、反向引物各0.2 μL (20
μmol·L-1), 补蒸馏水至总体积20 μL。反应程序为:
95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s,
72 ℃延伸30 s, 共40个循环。反应结束后分析荧光
值变化曲线和融解曲线。每个反应3个重复, 采用
Comparative CT (–2ΔΔCT)法分析试验结果。
结果与讨论
1 目的基因的扩增与克隆
基于文库筛到的中间序列片段, 设计2条引物,
进行3′ RACE, 获得一条大约500 bp左右的特异谱
带(图1-A), 回收克隆测序结果表明该片段长度为
512 bp, 其中包含21个碱基的polyA尾巴, 说明已经
到达3′末端。
基于已获得的中间序列片段, 设计2条引物,
参照5′-Full RACE试剂盒进行5′ RACE, 得到1条约
500 bp的特异谱带(图1-B), 回收克隆测序结果表明
该片段的长度为475 bp, 其5′端发现起始密码子。
将通过5′ RACE和3′ RACE得到的序列与中间
片段进行拼接, 得到一条完整的cDNA序列, 长度
为821 bp。在此基础上, 在5′端和3′端分别设计引
物进行cDNA全长的特异扩增, 获得大于750 bp的
特异谱带(图1-C), 将其命名为PpH3.3, GenBank登
录号为KC907628。
根据得到的cDNA序列, 设计2条引物, 以基因
表1 实验所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 序列(5′→3′) 用途
3P1 TACCTTGTGGGTCTGTTGAG PpH3.3 cDNA 3′端克隆特异引物
3P2 ACCAACCTTTGTGCCATCC
B26 GACTCTAGACGACATCGA(T)18 PpH3.3 cDNA 3′端克隆通用引物
B25 GACTCTAGACGACATCGA
5P1 TAATGGTAACACGCTTGGC PpH3.3 cDNA 5′端克隆特异引物
5P2 ACAGACCCACAAGGTAAGCC
PpH3.3-F GTAAAGAAAGACAGAGCGCGAAG PpH3.3 cDNA全长克隆引物
PpH3.3-R ACCATATTAGTGAGGCTGCAGAC
G1 AGAGCGCGAAGAGCACAGAG PpH3.3基因组克隆引物
G2 AGCCACCACACAACCAACC
F GGTCTGTTTGAGGACACCAA PpH3.3荧光定量PCR引物
R CCTTTCCCAATTAAGCATTT
Actin-F GTTATTCTTCATCGGCGTCTTCG 内参Actin荧光定量PCR引物
Actin-R CTTCACCATTCCAGTTCCATTGTC
图1 DNA电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis pattern of DNAs
A: 3 RACE扩增产物; B: 5 RACE扩增产物; C: PpH3.3基因片段; D: 基因组片段。M: DL2000 marker; 1: 检测片段。
冷传远等: 油桃组蛋白基因PpH3.3的克隆和表达分析 767
组DNA为模板扩增, 回收特异条带(图1-D), 克隆测
序 , 得到基因组序列 , GenBank登录号为KC-
907629。
2 油桃PpH3.3基因cDNA序列的生物信息学分析
根据NCBI的ORF Finder发现, 基因PpH3.3的
全长cDNA为821 bp, 包含56 bp的5′端非编码区、
358 bp的3′非编码区和411 bp的开放阅读框, 编码
含有136个氨基酸的蛋白质, 起始密码子为ATG, 终
止密码子为TAA。
通过Protparam分析其理化性质, 推测PpH3.3
蛋白的分子式C679H1144N216O186S3, 其相对分子量为
15.41 kDa, 等电点(pI)为11.15。该蛋白中相对含量
较多的氨基酸是丙氨酸Ala (13.2%, 18个)、精氨酸
Arg (12.5%, 17个)、赖氨酸Lys (10.3%, 14个)、亮
氨酸Leu (9.6%, 13个)和苏氨酸Thr (8.1%, 11个)。
总的带负电荷的残基(Asp+Glu)为11, 总的带正电
荷的残基(Arg+Lys)为31。
比较该基因的基因组和cDNA序列发现, 该基
因含有4个内含子, 分别为595、95、97和99 bp, 并
且这四个内含子序列都具有植物内含子的典型结
构特征 : 都富含AT; 具有相同的保守剪切位点
5′-GT和AG-3′位点(图2)。
30739.1)的氨基酸序列完全相同, 与拟南芥AtH3.1
(GenBank登录号AAO24594.1)、烟草NtH3.1 (Gen-
Bank登录号BAF76800.1)和苜蓿MsH3.1 (GenBank
登录号AAB49545.1)的氨基酸序列在3、88、91位
存在差异。利用DNAman 6.0和MEGA 5.0软件, 将
桃树PpH3.3氨基酸序列与其他物种已经报道的组
蛋白H3序列进行比对并绘制系统发生树, 结果(图
5)表明PpH3.3与拟南芥、葡萄亲缘关系较近。这
些结果证明PpH3.3是组蛋白H3.3家族的一员, 且
组蛋白H3.3在进化过程中非常保守(Thatcher和Go-
rovsky 1994; Loidl 2004)。
3 自然休眠进程中油桃PpH3.3的表达
自然条件下生长的桃树, 随着日照长度的变
短和温度的降低, 植株新梢的生长速度逐渐降低
并最终停止生长。由图6可知, 9月16日采样测得新
梢第1颗芽萌发所需时间为16 d, 因此, 芽体在9月
16日已进入休眠的第1阶段——休眠诱导期。随
着日照长度的变短和环境温度的进一步降低, 休
眠程度逐渐加深, 至11月18日, 测得新梢第1颗芽萌
发所需时间为50 d, 超过6周, 说明芽体在11月18日
已进入休眠期。至12月28日, 新梢第1颗芽萌发所
需时间为28 d, 低于6周, 说明芽体在12月28日已进
入休眠解除期。
如图7所示, 在休眠诱导期和休眠期解除期
PpH3.3表达量相对较低, 在休眠期表达量迅速升
高, 最高值出现在11月18日, 然后在12月8日迅速降
低, 最高表达量是最低表达量的26倍。对此我们
有以下两种理解: 第一, 在休眠过程中细胞分裂多
停滞于G1期(den Boer和Murray 2000; Gutierrez等
2002), H3与DNA复制有关, 在S期大量表达, 而
H3.3的表达则不受S期限制。我们认为H3.3的骤
增可能是在S期时对H3嵌入染色体能力不足的整
体补偿。第二, 在休眠期基因表达受到抑制, 为维
氨基酸序列的保守结构域分析结果(图3)显
示, 该基因具有组蛋白H3家族典型的保守结构域
PTZ00018。同源性分析结果(图4)发现, PpH3.3编
码的氨基酸序列与拟南芥AtH3.3 (GenBank登录号
AEE87157.1)和葡萄VvH3.3 (GenBank登录号AAP-
图3 PpH3.3氨基酸序列的保守结构域
Fig.3 Conserved domains of amino acid sequences of PpH3.3
图2 PpH3.3的基因组序列
Fig.2 Genomic sequence of PpH3.3
植物生理学报768
图4 不同植物来源的组蛋白H3氨基酸序列比对
Fig.4 Comparison of the amino acid sequences of histone H3 in different plants
拟南芥AtH3.3 (GenBank登录号AEE87157.1), 拟南芥AtH3.1 (GenBank登录号AAO24594.1), 拟南芥AtMGH (GenBank登录号
NP_173418.1), 葡萄VvH3.3 (GenBank登录号AAP30739.1), 烟草NtH3.1 (GenBank登录号BAF76800.1), 苜蓿MsH3.1 (GenBank登录号
AAB49545.1)。
图5 不同物种组蛋白H3氨基酸序列系统树分析
Fig.5 Phylogenetic trees of the deduced amino acid sequences of histone H3
冷传远等: 油桃组蛋白基因PpH3.3的克隆和表达分析 769
持染色质活性状态的表观遗传记忆, H3.3大量表
达, 参与组蛋白周转, 从而有利于休眠解除后转录
调控元件的结合 , 对染色质的活性形成影响。
Gurdon的研究小组证实了后一种情况: 即在没有
转录的情况下, 活性基因表观遗传的记忆依赖于
H3.3嵌入染色质(Ng和Gurdon 2008)。
4 高温和单氰胺处理对PpH3.3表达的影响
在目前所能利用的破眠措施中, 高温处理和
施用单氰胺为休眠的研究提供了一个可控系统。
研究发现, 尽管高温和单氰胺处理引起的变化在
时间和强度上有所不同, 但二者在破眠效果、氧
化胁迫、呼吸代谢和转录组的变化等方面具有极
大地相似性(Halaly等2008, 2011; Ophir等2009)。
结果(图8)显示, 高温处理后PpH3.3的表达量
在第2天达到最大值, 早于单氰胺处理的; 单氰胺
处理后最大值出现在第4天, 且二者差异显著。但
2种处理均引起PpH3.3表达的短暂升高, 然后降低,
恢复到初始水平。这一结果结合我们实验室构建
的休眠期和休眠解除期的抑制差减文库筛选到
PpH3.3的部分序列(李玲等2011), 说明至少在一定
程度上PpH3.3参与休眠的过程。
参考文献
李玲, 王慧, 谭钺, 王宇, 陈修德, 李冬梅, 高东升(2011). 桃花芽休眠
解除SSH文库构建及相关基因表达分析. 园艺学报, 38 (12):
2273~2280
den Boer BGW, Murray JAH (2000). Control of plant growth and
development through manipulation of cell-cycle genes. Curr
Opin Biotechnol, 11: 138~145
Govin J, Caron C, Rousseaux S, Khochbin S (2005). Testis-specific
histone H3 expression in somatic cells. Trends Biochem Sci, 30:
357~359
Gutierrez C, Ramirez-Parra E, Castellano MM, del Pozo JC (2002).
G1 to S transition: more than a cell cycle engine switch. Curr
Opin Plant Biol, 5: 480~486
Halaly T, Pang X, Batikoff T, Keilin T, Crane O, Keren A,
Venkateswari J, Ogrodovitch A, Sadka A, Lavee S et al (2008).
Similar mechanisms are triggered by alternative external stimuli
that induce dormancy release in grape buds. Planta, 228: 79~88
Halaly T, Zion B, Arbel A, Regev R, Barak M, Or E (2011). Short
exposure to sublethal heat shock facilitates dormancy release in
grapevines. Am J Enol Vitic, 62: 106~112
Henikoff S, Furuyama T, Ahmad K (2004). Histone variants,
nucleosome assembly and epigenetic inheritance. Trends Genet,
20: 320~326
Jian LC, Li PH, Sun LH, Chen THH (1997). Alterations in ultrastruc-
ture and subcellular localization of Ca2+ in poplar apical bud cells
during the induction of dormancy. J Exp Bot, 48:1195~1207
Jin J, Cai Y, Li B (2005). In and out: histone variant exchange in chro-
matin. Trends Biochem Sci, 30: 680~687
Law RD, Suttle JC (2003). Transient decreases in methylation at 5’-
CCGG-3’ sequences in potato (Solanum tuberosum L.) meristem
DNA during progression of tubers through dormancy precede the
resumption of sprout growth. Plant Mol Biol, 51 (3): 437~447
Law RD, Suttle JC (2004). Changes in histone H3 and H4 multiacety-
lation during natural and forced dormancy break in potato tubers.
Physiol Plant, 120 (4): 642~649
Loidl P (2004). A plant dialect of the histone language. Trends Plant
Sci, 9: 84~90
Ng RK, Gurdon JB (2008). Epigenetic memory of an active gene state
图6 油桃花芽的休眠进程
Fig.6 Dormancy process of floral buds of P. persica var. nectarina
图8 高温和单氰胺处理下PpH3.3的表达水平
Fig.8 Expression levels of PpH3.3 under high temperature
and hydrogen cyanamide treatments
图7 自然休眠进程中PpH3.3的表达水平
Fig.7 Expression levels of PpH3.3 during dormancy process
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
植物生理学报770
depends on histone H3.3 incorporation into chromatin in the
absence of transcription. Nat Cell Biol, 10: 102~109
Ophir R, Pang X, Halaly T, Venkateswari J, Lavee S, Galbraith D, Or
E (2009). Gene-expression profiling of grape bud response to
two alternative dormancy-release stimuli expose possible links
between impaired mitochondrial activity, hypoxia, ethylene-ABA
interplay and cell enlargement. Plant Mol Biol, 71: 403~423
Porebski S, Bailey LG, Baum BR (1997). Modification of a CTAB
DNA extraction protocol for plants containing high polysaccha-
ride and polyphenol components. Plant Mol Biol Rep, 15: 8~15
Sakai A, Schwartz BE, Goldstein S, Ahmad K (2009). Transcriptional
and developmental functions of the H3.3 histone variant in
Drosophila. Curr Biol, 19: 1816~1820
Santamaría M, Hasbún R, Valera M, Meijón M, Valledor L, Rodríguez
JL, Toorop PE, Cañal M, Rodríguez R (2009). Acetylated H4
histone and genomic DNA methylation patterns during bud
set and bud burst in Castanea sativa. J Plant Physiol, 166:
1360~1369
Sarma K, Reinberg D (2005). Histone variants meet their match. Nat
Rev Mol Cell Biol, 6: 139~149
Schrader J, Moyle R, Bhalerao R, Hertzberg M, Lundeberg J, Nilsson
P, Bhalerao RP (2004). Cambial meristem dormancy in trees in-
volves extensive remodelling of the transcriptome. Plant J, 40 (2):
173~187
Szenker E, Ray-Gallet D, Almouzni G (2011). The double face of the
histone variant H3.3. Cell Res, 21: 421~434
Tagami H, Ray-Gallet D, Almouzni G, Nakatani Y (2004). Histone
H3.1 and H3.3 complexes mediate nucleosome assembly path-
ways dependent or independent of DNA synthesis. Cell, 116:
51~61
Thatcher TH, Gorovsky MA (1994). Phylogenetic analysis of the core
histones H2A, H2B, H3, and H4. Nucl Acids Res, 22: 174~179