全 文 ：第 49 卷　第 3 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.49　No.3
　2010 年 5 月 Journal of Xiamen Universi ty (Natural Science) May 2010　
滑桃树愈伤组织与内生真菌共培养的
代谢产物研究
吴　欣 ,鲁春华＊
(厦门大学生命科学学院福建省药物工程实验室 ,福建 厦门 361005)
　　
收稿日期:2009-09-21
基金项目:国家自然科学基金(30430020);国家杰出青年基金
(30325044)
＊通讯作者:ahua0966@xmu.edu.cn
摘要:建立滑桃树愈伤组织与其内生真菌(Fusarium sp.WXE)的共培养体系 , 并对共培养的次生代谢产物进行研究.
研究结果表明 ,滑桃树愈伤组织对内生真菌的生长具有明显的促进作用.采用核磁共振 、质谱等波谱技术对从共培养提
取物中分离到的 3 个化合物进行结构测定 , 确定它们分别为(16α)-17-hydroxy-ent-atisan-19-oic acid methyl e ster (1),
(16α)-16 , 17-dihydro xy-ent-atisan-19-oic acid methy l ester(2)和 β-谷甾醇(3).
关键词:滑桃树;愈伤组织;共培养;内生真菌
中图分类号:Q 945;Q 939.9 　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:0438-0479(2010)03-0406-04
　　在植物与微生物的共生关系中 ,微生物依靠宿主
提供居住环境和营养;同时 ,植物内生微生物的次生代
谢可能受到植物调控或者利用植物成分作为生物合成
的前体 ,产生强活性化合物 ,帮助宿主抑制病害[ 1-3] .滑
桃树(Trewia nud i f lora L .)为大戟科滑桃树属植物 ,
其主要化学成分为具有抗肿瘤活性的美登木素类化合
物[ 4-6] .前期研究表明在滑桃树的愈伤组织中未检测和
分离获得美登木素类化合物[ 7] ,为了寻找美登木素类
化合物的新来源及其生物合成起源 ,我们用滑桃树种
子繁殖的幼苗诱导愈伤组织并建立植物愈伤组织与其
内生真菌(Fusarium sp.WXE)的共培养体系 ,并对
共培养的次生代谢产物进行研究.
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　实验材料
滑桃树种子采自中国科学院西双版纳热带植物
园.
1.1.2　仪器与材料
BioESI-Q-TOF(Bruke)质谱仪;Bruker DRX 500
MHz或者Bruker DRX 600 MHz核磁共振仪;四甲基
硅烷(TM S)为内标;硅胶 GF254薄层层析板及柱层析
硅胶(200 ～ 300目),均为青岛海洋化工厂生产;反相
柱层析填料 RP-18为Merck 公司生产;Sephadex LH-
20为 Amersham Pharmacia 公司产品.
1.2　方　法
1.2.1　滑桃树种子的萌发
挑选成熟饱满的滑桃树种子 ,用自来水冲洗 30
min后 ,用蒸馏水洗净 ,接着用 75%(体积比)酒精浸
泡 1 min , 0.035 g/mL NaClO 浸泡 5 min , 0.002 g/
mL HgCl2 浸泡 8 min[ 8] .在无菌条件下 ,将经表面消
毒的种子外种皮敲除 ,置于 4 mg/L 的赤霉素溶液中 ,
以琼脂为支撑基质 , 26 ℃暗培养.
1.2.2　愈伤组织的诱导
将种子萌发后的无菌苗切成 1 ～ 2 cm 用于诱导愈
伤组织 ,选择 MS(Murashig e and Skoog)[ 9] 作为基本
培养基并添加 1.0 mg/ L 2 , 4-二氯苯氧乙酸(2 , 4-D)
和 1.0 mg/L 萘乙酸(NAA).2 ～ 3周后 ,无菌苗周围
长出白色至微黄色瘤状愈伤组织 , 4周后将其转接到
新鲜的培养基中.在培养过程中 ,部分愈伤组织出现褐
化现象.在培养基中加入 0.2 mg/L 激动素(K T),褐
化现象有所改善.因此愈伤组织的继代培养均采用
MS+1.0 mg/ L 2 ,4-D+1.0 mg/ L NAA+0.2 mg/L
KT ,每隔 30 d继代培养 1次.
1.2.3　内生真菌的分离
用含有赤霉素(终浓度为 4 mg/L)的琼脂培养基
诱导滑桃树无菌苗 ,当无菌苗长到 5 ～ 6 cm时 ,将其切
成 5 mm 的片段 ,置于 PDA 培养基上 ,28 ℃培养 ,分
离纯化得到一株内生真菌.该菌株经 ITS[ 10] 鉴定为镰
刀菌(Fusarium sp.).
1.2.4　滑桃树愈伤组织与其内生真菌的共培养
将培养基(MS +1.0 mg/ L 2 , 4-D +1.0 mg/L
NAA+0.2 mg/ L KT)分装于500 mL 宽口三角瓶中 ,
约 70 mL/瓶 ,灭菌后 ,于无菌操作台中 ,接入愈伤组织
(约 10 ～ 15 g/瓶),沿瓶底内周均匀排布 , 26 ℃暗培
养.待愈伤生长 20 d 后 ,在瓶内中央 ,接入于 PDA 培
养基培养 7 d的内生真菌菌块(约 5 mm ×5 mm),继
续共培养 10 d 后 ,将菌体 、愈伤组织连同 MS 培养基
一起收集 ,共 10 L ,用丙酮提取.提取物用等体积乙酸
乙酯和水萃取 ,获得乙酸乙酯提取物 4.0 g.
1.2.5　共培养提取物化学成分的分离
4.0 g 浸膏经反相中压柱(180 g RP-18)层析 ,丙
酮-水(水;1∶2;1∶1;2∶1;丙酮各 1 L)梯度洗脱 ,经
T LC检测合并得到组分:A(1.5 g), B(132 mg), C
(477 mg).将 A 和 C组分分别经凝胶柱(150 g Seph-
adex LH-20)层析 ,甲醇洗脱 ,经 TLC 检测合并得到
组分:A-1(440 mg),A-2(272 mg), A-3(110 mg), C-1
(346 mg).
A-2组分经反相中压柱(30 g RP-18)层析 ,丙酮-
水(水;30∶70;40∶60;50∶50;丙酮;各 100 mL)梯
度洗脱 , T LC 检测合并得 A-2-1(42 mg)、A-2-2(63
mg),两组分分别经凝胶柱(40 g Sephadex LH-20)层
析 ,丙酮洗脱 ,每管约接收 3 mL ,得到组分 A-2-1-1 、
A-2-1-2 、A-2-2-1 、A-2-2-2.组分 A-2-1-1 经正相硅胶
柱层析 ,石油醚饱和 0.3 g 硅胶装柱 ,石油醚-丙酮
(石油醚;40∶1)梯度洗脱 , 1 mL/ tube 接收 ,得化合
物 1(1.0 mg).A-2-2-2 经正相硅胶柱层析 ,石油醚饱
和 0.5 g 硅胶装柱 ,石油醚-氯仿(石油醚;20∶1;10∶
1;5∶1;3∶1)梯度洗脱 , 3 mL/ tube 接收 ,经 T LC 检
测合并得化合物 2(2.0 mg).C-1经反相中压柱(30 g
RP-18)层析 ,丙酮-水(水;50∶50;60∶40;65∶35;丙
酮;各 100 mL)梯度洗脱 ,其中 65∶35 洗脱得到的组
分 C-1-2(144 mg),再经凝胶柱(40 g Sephadex LH-
20)层析 ,丙酮洗脱 ,得到 C-1-2-2(40 mg).继续经正相
硅胶柱层析 ,1.0 g 硅胶氯仿饱和装柱 ,氯仿-甲醇(氯
仿;100∶1;80∶1)梯度洗脱 ,5 mL/ tube 接收 ,得化
合物 3(10.0 mg).
2　结果与分析
2.1　滑桃树愈伤组织与内生真菌的共培养
通过滑桃树愈伤组织与其内生真菌的共培养 ,发
现该菌株在瓶内中央附近的 MS 培养基上生长缓慢 ,
菌落稀疏 ,而在瓶内周的愈伤组织上菌株孢子生长旺
盛(图 1).实验结果表明滑桃树愈伤组织可能为菌株
提供营养或者信号分子 ,促进其旺盛生长.
　图 1　滑桃树愈伤组织与内生真菌的共培养
　Fig.1　The co-cultur e o f calli of T.nudi f lora and its endo-
phy tic fungus strain (F usarium sp.WXE)
2.2　结构鉴定
通过反相中压 、正相以及凝胶柱层析 ,从共培养的
乙酸乙酯提取物中分离到 3个化合物 ,根据 NMR以
及 MS 实验数据鉴定了化合物 1 ～ 3的结构(图 2)分
别为(16α)-17-hydroxy-ent-at isan-19-oic acid methy l
e ste r (1), (16α)-16 , 17-dihydro xy-ent-atisan-19-oic
acid methy l ester (2)和 β-sitosterol(3).
　　图 2　化合物 1((16α)-17-hydroxy-ent-a tisan-19-oic acid methy l ester)、化合物 2((16α)-16 , 17-dihydroxy-ent-a tisan-19-oic acid
methyl ester)和化合物 3(β-谷甾醇)的结构式
　　Fig.2 　The structure of compound 1 ((16α)-17-hydroxy-ent-a tisan-19-oic acid methyl este r), compound 2((16α)-16 , 17-di-
hydro xy-ent-atisan-19-oic acid methy l e ste r)and compound 3 (β-sito sterol)
·407·第 3 期　　　　　　　　　　　吴　欣等:滑桃树愈伤组织与内生真菌共培养的代谢产物研究
　 (16α)-17-hydroxy-ent-atisan-19-oic acid methy l
e ste r(1):无色针状晶体.13 C-NMR数据显示该化合
物有 21个碳信号 ,由 DEPT 可知分别为 4个季碳(包
括 1个酯基碳)、4个次甲基 、10个亚甲基和 3个甲基
(包括 1个甲氧基),不饱和度为 5 ,提示该化合物可能
是1个 4环二萜.BioESI-Q-TOF-MS给出失水的准分
子离子峰 m/z 316.247 8([ M-H 2O] +),推测其分子质
量为 334 u ,分子式为 C21H 34O 3 .将 1的核磁数据与文
献[ 7]报道的核磁数据对比进一步确定了化合物 1为
(16α)-17-hydroxy-ent-at isan-19-oic acid methy l este r.
1
H-NMR(500 MHz , Acetone-d6):δ1.84(m , H-
1a),0.81(m ,H-1b), 1.42(m , H-2a),1.82(m , H-2b),
1.02(m , H-3), 1.04(m , H-5), 1.75(m , H-6a), 1.84
(m , H-6b),1.44(m ,H-7a),0.88(m , H-7b),1.02(m ,
H-9), 1.58(m , H-11), 2.17(m , H-12), 1.83(m , H-
13a),1.03(m , H-13b),1.54(m , H-14a), 1.44(m , H-
14b),1.57(m , H-15a), 0.99(dd , 5.6 , 13.6 , H-15b),
2.05(m , H-16),3.43(m , H-17), 1.16(s , H-18),0.87
(s , H-20),3.54 ,(s , H-21).13C-NMR(125 MHz ,A ce-
to ne-d6):δ41.6(C-1), 19.1(C-2), 38.1(C-3), 43.8
(C-4),55.3(C-5), 22.5(C-6), 43.4(C-7),44.7(C-8),
57.0(C-9),39.4(C-10),18.8(C-11), 38.1(C-12),37.2
(C-13), 31.4(C-14), 45.0(C-15), 40.8(C-16), 67.5
(C-17),28.8(C-18), 178.2(C-19),15.3(C-20), 51.1
(C-21).
(16α)-16 , 17-dihydro xy-ent-atisan-19-oic acid
methy l ester (2):无色针状晶体.13 C-NMR 和 DEPT
数据显示 ,该化合物有 21个碳信号 ,分别为 5个季碳 、3
个次甲基 、10个亚甲基和 3个甲基(包括 1个甲氧基),
不饱和度为 5 ,提示该化合物可能为 4环二萜.由 BioE-
SI-Q-TOF-MS:[ M+Na] +m/z 实验值 373.310 4 ,推测
其分子质量为 350 u ,分子式为 C2 1H 34O 4 .综合分析 ,发
现化合物 2与化合物 1属于同一类型的化合物 ,通过对
照化合物 2和化合物 1的1H , 13 C-NMR数据 ,表明 ,化
合物 2相比化合物 1 , C-16上多了 1个羟基取代.其核
磁数据与文献报道的一致[ 7] ,进一步确定了化合物 2
的结构为(16α)-16 ,17-dihydroxy-ent-atisan-19-oic acid
methy l ester.
1H-NMR(600 MHz ,Acetone-d6):δ1.75(m ,H-
1a), 0.76(m , H-1b), 1.36 (m , H-2a), 1.72(m , H-
2b),2.04(m , H-3a),1.00(m , H-3b), 1.04(m , H-5),
1.74 (m , H-6a), 1.67(m , H-6b), 1.53(m , H-7a),
1.38(m ,H-7b),0.93(m ,H-9),1.50(m , H-11),1.88
(brs , H-12),1.70(m , H-13a),1.54(m , H-13b),1.55
(m , H-14a), 1.34(m , H-14b), 1.40(m , H-15a),1.26
(brd ,14.4 , H-15b), 3.51(dd ,11.1 , 6.4 , H-17a),3.41
(dd ,10.6 , 5.2 , H-17b), 1.10(s , H-18), 0.75(s , H-
20), 3.57 , (s , H-21).13 C-NMR(150 MHz , Acetone-
d6):δ40.5(C-1), 19.1(C-2),38.0(C-3),43.6(C-4),
56.4(C-5), 22.4(C-6), 42.2(C-7), 44.4(C-8), 55.8
(C-9),39.4(C-10),18.6(C-11), 45.0(C-12), 37.3(C-
13), 26.3(C-14), 53.2(C-15), 81.0(C-16), 65.8(C-
17), 28.7(C-18), 177.5(C-19), 15.5(C-20), 51.5(C-
21).
β-sitosterol(3):白色针状晶体.1H-NMR , 13C-
NMR和 DEPT 显示化合物 3有 6个甲基 , 11个亚甲
基 ,9个次甲基和 3个季碳 ,其中包括 1个双键和 1个
羟基碳.与文献[ 11]的数据比较 ,碳和质子的化学位移
值基本一致;与 β-谷甾醇标准品 T LC 对照 ,其 R f 值 、
硫酸-无水乙醇显色情况一致 ,表明化合物 3为 β-谷甾
醇(β-sito sterol).
2.3　化合物 1和 2的生物活性
采用滤纸片法[ 12] 测定化合物 1 和 2 对指示菌
Baci llus subti l is CMCC63501 , Escherichia coli CM-
CC44103 , S taphy lococcus aureus ATCC9763 , Candi-
da albicans AS2.538 的活性 ,结果显示 , 在每片滤纸
片含有 50μg样品时 ,化合物对指示菌株无抑制活性;
采用 MT T 法[ 13] ,化合物 1 和 2(均为 20 μg/mL)对
HeLa and HepG2细胞也没有细胞毒活性.
3　讨　论
实验建立了滑桃树种子愈伤组织和内生真菌的共
培养体系 ,可用于模拟二者的相互关系研究 ,对探讨植
物-微生物相互关系具有一定的意义.结果表明 ,目前
建立的植物与微生物共培养体系是较为完善的 ,因为
二者相互作用的情况 ,与 Sieber 等[ 14]发现的研究结果
相似 ,即宿主愈伤组织对内生菌的生长具明显促进作
用 ,相反 ,内生菌则对宿主愈伤组织的生长产生稍微的
抑制作用.Peter 在共培养体系中也发现了同样的现
象[ 15] .此外 ,从次生代谢产物的分离纯化情况看 ,化合
物 1 ,2在愈伤组织单独培养提取物中已分离获得[ 7] ,
化合物 3在滑桃树的果皮的化学成分研究中已有报
道[ 16] ;前期研究在滑桃树愈伤组织与内生真菌的共培
养提取物中 ,我们还分离获得在愈伤组织纯培养中未
分离获得 3个新化合物[ 17] ,这 3个新化合物很可能是
植物和内生菌共同作用产生的 ,表明了植物和微生物
共培养是发现新型代谢产物的有效途径.
·408· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2010 年
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Studies on the Secondary Metabolites of Co-culture of the Calli of
Trewia nudif lora and Its Endophtic Strain
WU Xin , LU Chun-hua＊
(Fujian Engineering Labora tory of Pha rmaceuticals , School of Life Science s , Xiamen Univer sity , Xiamen 361005 , China)
Abstract:The co-cultures of calli of Trew ia nudi f lora L.and its endophy tic fungus F usarium sp.WXE were established.The sec-
ondary metabo lites o f the co-culture we re studied.The result show ed that the g row th o f Fusarium sp.WXE w as obv iously induced
by the calli of T.nud i f lora.Three compounds w ere iso la ted fr om the co-culture ex tract , and their str uctures w ere e lucida ted to be
(16α)-17-hydroxy-ent-a tisan-19-oic acid methy l ester(1),(16α)-16 , 17-dihydro xy-ent-atisan-19-oic acid methy l ester(2)and β-sitos-
te rol(3)according to their spectro scopic analy ses including NM R and MS.
Key words:Trewia nudi f lora L.;calli;co-culture;F usarium sp.WXE
·409·第 3 期　　　　　　　　　　　吴　欣等:滑桃树愈伤组织与内生真菌共培养的代谢产物研究