全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 2期，2009年 2月 169
多糖和糖蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进
王玉琪 1, 巫光宏 1,*, 林先丰 2, 贺丽平 3, 黄卓烈 1
华南农业大学 1生命科学学院, 2资源环境学院, 3测试中心, 广州 510642
Improvement of Staining Method for Polyacrylamide and Glycoprotein from
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
WANG Yu-Qi1, WU Guang-Hong1,*, LIN Xian-Feng2, HE Li-Ping3, HUANG Zhuo-Lie1
1College of Life Sciences, 2College of Natural Resource and Environment, 3Instrumental Analysis and Research Center, South China
Agricultural University, Guangzhou 510642, China
提要: 对多糖聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的缓冲系统进行了改进, 尤其是多糖电泳后的染色方法的改进, 得出一种操作简
便、时间短、实验成本低的 PAS染色法。
关键词: 多糖; 糖蛋白; 电泳; PAS染色
收稿 2008-09-12 修定 2008-11-24
资助 华南农业大学横向项目(4 600 -H08 046 )。
* 通讯作者(E-mail: wgh@scau.edu.cn; Tel: 020-85280191)。
随着碳水化合物研究的不断深入, 多糖及其蛋
白复合物在生物体中的功能逐渐得到揭示, 测定多
糖的纯度、种类、分子量等性质的常规检测技术
也逐步展开。聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide
gel electrophoresis, PAGE)作为最常用和有效的分离
技术, 也广泛应用于多糖及其复合物的分离和鉴
定。由于多糖类分子的不均一性, 导致多糖电泳分
离的难度比蛋白质高很多(张惟杰 1999)。当今多
糖染色的方法主要有荧光染色、阿利新蓝染色和
高碘酸 -Schiff试剂染色。荧光染色需要将电泳后
的样品标记, 需要较长时间甚至过夜, 方法繁琐, 处
理时间比较长且成本较高(Volpi等 2005)。阿利新
蓝(Alcian Blue)为四价阳离子染料, 在酸性pH条件
下与各种酸性多糖结合(熊双丽和金征宇 2005)。
染色程序较为简便, 但染料价格昂贵, 不能满足一
般常规实验的需求。高碘酸 -Schiff反应(periodic-
acid schiff reaction, PAS)所用的试剂成本较低, 操
作简便。但至今有关多糖电泳后 PAS染色方法尙
未见报道。本文采用改良的 pH 9.4的硼砂 -NaOH
缓冲系统作为电极缓冲液, 探讨不同的多糖和糖蛋
白的 PAS的染色条件, 可以快速有效分离多糖样
品。
材料与方法
1 材料
姬菇多糖、虎奶菇水提多糖、虎奶菇碱提多
糖由本实验室制备; 蔗糖酶从酵母中提取并分离纯
化, 由本实验室制备; 肝素钠购于上海伯奥生物科
技公司。
2 试剂
(1)电极缓冲液(硼砂-氢氧化钠缓冲液, pH 9.4):
取 4.77 g硼砂和 0.445 g NaOH溶解, 调 pH至 9.4,
定容到 1 000 mL。(2) Schiff试剂: 称取 1 g碱性品
红, 在 200 mL沸水中溶解 5 min, 冷却至 40~50 ℃,
加入1.37 g偏重亚硫酸钠和20 mL 1 mol·L-1 HCl, 冷
却至室温, 加入 2匙活性炭搅拌, 直到溶液变成无
色透明为止, 过滤, 4 ℃冰箱避光保存(张惟杰
1999)。(3) 1%高碘酸溶液: 称 1 g高碘酸, 溶解定
容到 100 mL。(4) 0.5%偏重亚硫酸钠: 称 1 g偏重
亚硫酸钠, 溶解定容到 200 mL。其他相关的电泳
试剂为进口分装或国产分析纯。
3 方法
3.1 多糖电泳中不同PAS染色时间的处理 多糖采
用 PAGE, 为不连续垂直平板电泳系统(郭尧君
2001), 浓缩胶为 5%, 分离胶为 7.5%, 隔孔点样 20
µL, 采用 pH 9.4的硼砂 -NaOH缓冲系统作为电极
缓冲液, 电泳后割胶, 于摇床(转速为 85 r·min-1)上
进行不同处理条件的 PAS染色。首先用 10%三氯
乙酸(TCA)进行 5~30 min不同时间的固定, 用蒸馏
水洗胶 2~3次。加入 1%高碘酸进行 15~30 min的
氧化反应; 然后用蒸馏水洗涤 3次, 每次 5 min, 彻
底把高碘酸洗干净; 加入 Schiff试剂, 室温避光染
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色30 min; 倒去染色液, 用0.5%新配的偏重亚硫酸
钠洗胶 3次, 每 5 min换一次(可用滴加甲醛检测,
如不变色, 表示洗干净), 于 7%的醋酸溶液中保存,
观察其染色效果, 以选择最佳的多糖 PAS染色方
法。
3.2 不同浓度分离胶影响多糖电泳的实验 多糖采
用 PAGE, 浓缩胶为 5%, 分离胶分别为 5%、8%
和 12%, 采用上述最佳 PAS染色处理, 观察其电泳
效果。
3.3 肝素钠多糖的PAS染色灵敏度分析 浓缩胶为
5%, 分离胶为 8%, 肝素钠多糖的点样量分别为
250、200、150、100、50、40、30和 20 µg。
3.4 糖蛋白电泳的多糖染色和蛋白染色 分别配制
浓度为 8%的分离胶和 5%的浓缩胶, 糖蛋白样品
为蔗糖酶, 于同一胶中不同的孔点样20 µg, 电泳后
割胶, 其中一半进行PAS染色, 另一半进行考马斯
亮蓝R250染色(周国权等2006), 观察其电泳效果。
实验结果
1 多糖不同PAS染色时间的效应比较
姬菇多糖电泳后的染色结果如图1所示。1~5
号分别对应于 5种不同的处理方法。除 1号染色
比较浅外, 其余 4种处理的染色都比较深, 并且染
色效果差距不大。说明 1%高碘酸对多糖处理约
15 min后, 使多糖充分氧化为高分子醛化合物。未
经 10%TCA处理的 4和 5号样品与2和 3号样品比
较, 染色效果无明显差别, 说明TCA的作用对样品
着色没有显著的影响。但由于TCA可防止多糖电
泳带扩散, 延长染色后电泳图谱的保存时间, 在染
色时仍然保留用 10%TCA处理凝胶的步骤。
2 不同浓度分离胶对多糖电泳PAS染色效应的比较
由图2可知, 分离胶浓度为5%时, 1号样品(虎
奶菇碱提多糖)呈长带状连续分布, 无法分析多糖的
分子量范围等参数, 而 2号样品(虎奶菇水提多糖)
各组分有明显拖尾, 迁移率相近的不同组分不易被
分开; 分离胶浓度为8%时, 1号样品呈较短带状, 2
号样品各组分分离效果较清晰; 分离胶浓度为12%
时, 样品较难进入凝胶, 泳动慢, 与浓度为 8%的凝
胶相比, 多糖各组分的分离效果差。说明不同浓度
分离胶对不同分子量的多糖有较大的影响。
3 肝素钠多糖PAS染色的灵敏度分析
图 3为不同浓度的肝素钠多糖经 PAS染色后
的显色情况, 肝素钠浓度较高时(250~50 µg), PAS
染色明显, 电泳带清晰。肝素钠含量低至 20 µg仍
可分辨。
4 糖蛋白电泳的 PAS染色和考马斯亮蓝R250染
色分析
比较图4的PAS染色和考马斯亮蓝R250染色,
可看到清晰的多糖染色带和与之对应的蛋白染色
带, 而且多糖的电泳带染色深, 含量高, 表明蔗糖酶
的蛋白成分结合有较多糖基组分。有文献(孙哲和
汪儆 2001)报道蔗糖酶为糖蛋白, 其中糖基含量为
2 0 %。可以证实蔗糖酶是结合糖基的蛋白复合
物。
讨　　论
多糖电泳的高碘酸 -Schiff反应(PAS)染色的
原理, 是利用高碘酸(HIO4)作为氧化剂, 破坏多糖化
合物结构的C-C键, 把多糖氧化成为高分子醛化合
物, 生成的醛类化合物与 Schiff试剂结合, 产生紫
红色复合物。制备 Schiff试剂所用染料为碱性品
红, 品红中的醌基是显色基团。在品红溶液中加入
亚硫酸盐溶液使其酸化, 品红被还原为无色的亚硫
酸品红复合物(董妙珠等 2004)。甲醛与 Schiff试
剂结合显色后不会褪去, 可作为染色后洗涤 Schiff
试剂是否干净的指示剂。高碘酸是影响 PAS显色
效果的关键因素, 其作用是将多糖链的二醇氧化成
二醛, 氧化的充分与否决定样品的显色能力。实验
表明, 在摇床转速为 85 r·min-1条件下, 以 1%高碘
酸溶液氧化 15 min, 凝胶中样品基本氧化完全, 此
时可倒去高碘酸溶液, 用水洗净, 再加入 Schiff染
料避光染色(图 1)。为保证高碘酸的氧化能力, 其
溶液一般是现配现用, 如果存放时间过长, 会降低
其氧化能力。高碘酸氧化后的凝胶一定要经蒸馏
水洗净后才能倒入 Schiff染色剂, 否则残留的高碘
酸对染色剂有氧化作用, 可将无色品红氧化为紫红
色的氧化型品红。后者大量滞留在凝胶中引起本
底较深, 难以洗脱, 影响电泳效果。
由于多糖的分子量较大, 电泳时分离胶浓度选
用 7.5%~8%为宜(图 2), 在糖蛋白的分析鉴定中也
可采用这一浓度(图 4)。多糖复合物解离程度较微
弱, 电荷密度低, 又具有糖单元不均一性、不对称
形状结构, 以致多糖的电泳带呈带状分布(张惟杰
1999; Volpi等2005), 在文中亦见到这一现象(图2),
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图 1 不同 PAS染色时间的染色效果比较
1: 10%TCA处理 5 min, 1%高碘酸处理 5 min; 2: 10%TCA处理 15 min, 1%高碘酸处理 15 min; 3: 10%TCA处理 30 min, 1%高
碘酸处理 30 min; 4: 无 TCA处理, 1%高碘酸处理 15 min; 5: 无 TCA处理, 1%高碘酸处理 30 min (姬菇多糖, 200 µg·孔 -1)。
图 2 不同浓度分离胶对多糖电泳 PAS染色的影响
1: 虎奶菇碱提多糖(200 µg·孔 -1); 2: 虎奶菇水提多糖(250 µg·孔 -1)。
图 3 肝素钠多糖 PAS染色的灵敏度检测
1: 250 µg; 2: 200 µg; 3: 150 µg; 4: 100 µg; 5: 50 µg; 6: 40 µg; 7: 30 µg; 8: 20 µg。
图 4 蔗糖酶糖蛋白电泳的PAS染色和考马斯亮蓝R250染色
蔗糖酶多糖: 40 µg·孔 -1; 蔗糖酶蛋白: 20 µg·孔-1。
多糖电泳带状越明显, 说明多糖的糖单元成分和结
构就越复杂。
在实验中, 对电泳缓冲系统进行了改进, 即采
用 pH 9.4硼砂 -氢氧化钠缓冲液; 同时对电泳条件
进行了优化探讨, 重点对多糖PAS染色方法进行研
究, 得到较佳的多糖和糖蛋白电泳后的PAS染色法:
即先用 10%TCA处理 5 min; 再用 1%高碘酸处理
15 min; 蒸馏水洗涤 3次, 每次 5 min; 倒入 Schiff
试剂避光染色 30 min; 然后用 0.5%偏重亚硫酸钠
洗 3次, 每次 5 min。以上各步均在室温下及转速
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为 85 r·min-1的脱色摇床中进行, 于 7%的醋酸溶液
中保存。此法操作更加简便, 染色处理过程更加快
速, 所需时间为 1.8 h。与刘翠芳和蒋继志(2006)
的高碘酸 -Schiff试剂法染色时间 16 h、高碘酸 -
硝酸银法染色时间 6 h相比, 缩短了 4~14 h。同
时, 该PAS染色法可检测到20 µg的肝素钠多糖(图
3), 而刘翠芳和蒋继志(2006)的高碘酸 -Schiff试剂
法染色只能检测到 100 µg的糖蛋白, 相比之下, 本
文改良的 PAS染色法检测多糖的灵敏度提高了 5
倍。另外, 在糖蛋白电泳的 PAS染色中, 40 µg蔗
糖酶的多糖染色效果明显(图 4)。因此, 多糖电泳
的改良 PAS染色法的实验成本低, 操作简单、快
速, 灵敏度高, 且不要求昂贵的药品和特殊设备, 在
多糖和糖蛋白的检测技术研究中, 应该有广阔的应
用前景。
参考文献
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刘翠芳, 蒋继志(2006). 高碘酸 -硝酸银染色法鉴定糖蛋白. 生物
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周国权, 巫光宏, 黄翠颜, 蔡毅, 詹福建, 黄卓烈(2006). 聚丙烯酰
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