全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 10期，2009年 10月958
收稿 2009-05-31 修定 　2009-09-11
资助 国家自然科学基金( 3 0 7 7 1 2 4 0 )和广东省科技计划
(2 005B3380 1002 )。
* 通讯作者(E-mail: AerobiologiaTao@163.com; Tel: 020-
3 4 1 5 3 5 2 0 )。
花生过敏原 iso-Ara h 3的克隆、表达和免疫学鉴定
钟海峰 1,2, 马三梅 1, 王永飞 1, 邹泽红 2, 陶爱林 2,*
1暨南大学生物工程学系, 广州 510632; 2广州医学院第二附属医院过敏反应实验室, 广州 510260
提要: 采用Touchdown PCR技术从花生 cDNA中克隆到花生的过敏原 iso-Ara h 3基因, 并进行重组蛋白表达, 再用Western
blot技术鉴定重组蛋白过敏原性。结果显示, 构建的 pET44a-iso-Ara h 3重组菌能表达 iso-Ara h 3蛋白。用 8例花生过敏
的阳性血清鉴定表明, 重组的 iso-Ara h 3蛋白血清 IgE识别率为12.5%, 是一种低过敏原性的过敏原蛋白。
关键词: 花生; 过敏原; 基因克隆; iso-Ara h 3基因; 过敏原性
Cloning, Expression and Immunological Characterization of Peanut (Arachis
hypogaea L.) Allergen Gene iso-Ara h 3
ZHONG Hai-Feng1, 2, MA San-Mei1, WANG Yong-Fei1, ZOU Ze-Hong2, TAO Ai-Lin2,*
1Department of Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2The Allergy Laboratory, The Second Affiliated
Hospital, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260, China
Abstract: The peanut (Arachis hypogaea) allergen gene iso-Ara h 3 was cloned from the peanut cDNA by using
Touchdown PCR. The recombinant iso-Ara h 3 protein was expressed in prokaryotic expression vector. And
then the antigenicity of recombinant iso-Ara h 3 proteins was identified by Western blot. The result showed that
the recombinant plasmid pET44a-iso-Ara h 3 was efficient and the recombinant iso-Ara h 3 was recongnized by
12.5% of peanut allergic patients. It was concluded that the iso-Ara h 3 allergen exhibited lower allergenicity
than other peanut allergens.
Key words: peanut (Arachis hypogaea); allergen; gene cloning; iso-Ara h 3 gene; allergenicity
花生是一种营养丰富的蛋白质资源, 也是世界
粮农组织( F AO )报道的八大类食物过敏原之一
(Warner 1999; Poms等 2004)。众多的研究表明,
花生过敏对人有生命危险性(Gowland 2001; Al-
M u h s e n 等 2 0 0 3 )、低剂量致敏性和持久性
(Marshall 2001; Poms等 2004)等特点。迄今已发
现的花生过敏原蛋白中, Ara h 1和Ara h 2是最主
要的过敏原, 能被90%的患者血清IgE识别(Viquez
等 2003; van Wijk等 2004)。Ara h 3也是一种主要
的花生过敏原, 能被 45%~54%的患者血清 IgE识
别(Rabjohn等 1999; Viquez等 2004)。重组Ara h 3
蛋白具有 4个线性 IgE结合表位, 改变表位上的特
殊氨基酸能显著降低 I g E 的结合( R a b j o h n 等
1999)。iso-Ara h 3是近年发现的Ara h 3的一个
亚型, 它与Ara h 3在核苷酸水平上约有 73%的序
列同源性, 而在氨基酸水平上的同源性约为 67%。
iso-Ara h 3比Ara h 3有更低的过敏原性(Kang和
Gallo 2007)。本文采用 Touchdown PCR技术从花
生 cDNA中克隆花生过敏原 iso-Ara h 3的编码基
因, 获得 2个克隆, 分别命名为PN32-8和PN32-20,
并构建表达载体进行原核表达获得 iso-Ara h 3重
组蛋白, 同时用 8例花生过敏阳性血清对重组 iso-
Ara h 3进行免疫学鉴定。
材料与方法
花生(Arachis hypogaea L.)品种 ‘粤油 14号 ’
由广东省农科院作物研究所周桂元先生惠赠。病
人血清来自广州医学院第二附属医院过敏反应科,
本研究全部试验在广州医学院第二附属医院过敏反
应实验室完成。
大肠杆菌 JM109及 Rosetta gami 2、T4 DNA
连接酶及 pGEM-T载体系统购自 Promega公司。
表达载体 pET44a购自Novagen公司。
根据GenBank公布的 iso-Ara h 3 (登录号为
DQ855115)序列, 利用Omiga软件自行设计PCR引
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物, 并由上海博尚生物技术有限公司合成, 用于基
因克隆和表达载体构建。引物序列如下: PF, 5
TAGGATCCATGGCCAAGCTTCTTGC 3 (下划线
标示 BamHI酶切位点); PR, 5 AACTGCAGTTAT-
TAAGCCACCTCCCTCATAG 3 (下划线标示PstI酶
切位点)。
RNA提取试剂盒及PCR产物回收纯化试剂盒
购自 QIAGEN公司; PCR试剂盒、Taq聚合酶、
10×PCR缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂、IPTG、
X-gal及DL2000 DNA Marker等购自上海生工生物
工程有限公司; 琼脂糖、蛋白胨、酵母以及 SYBR
Green荧光染料等购自基因公司。
RNA提取采用RNeasy Mini Kit试剂盒离心柱
(QIAGEN), 按照说明书指导进行。cDNA第一链
的合成采用Protoscript试剂盒(New England Biolabs)
按照说明书指导合成。具体操作按照报道的程序
进行(陶爱林和何韶衡 2004; Tao和He 2005)。
PCR采用 25 μL反应体系, 所得到的 cDNA母
液稀释 50倍后取 5 μL作为模版, 2.5 μL 10×缓冲
液(成分为: 100 mmol·L-1 pH为8.3的Tris-HCl、500
mmol·L-1 KCl、15 mmol·L-1 MgCl2), 2 μL dNTPs
(2.5 mmol·L-1)混合物, 上、下游引物各 1 μL, 0.2
μL Taq DNA聚合酶, 13.3 μL灭菌双蒸水。混匀
后于 iCycler 582BR型PCR扩增仪(BIO-RAD)上进
行扩增。PCR反应条件为: 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 40 s,
70.5 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min 10 s, 从 70.5~68.5 ℃, 每
降 0.5 ℃循环 1次, 共 5个循环; 94 ℃ 40 s, 69 ℃
30 s, 72 ℃ 2 min 10 s, 30个循环; 72 ℃ 10 min; 4 ℃
沉浸。每 20 μL的 PCR产物加 1 μL SYBR Green
荧光染料混匀后, 在 1.5%琼脂糖凝胶上以5 V·cm-1
恒压电泳 1 h。电泳结束后于凝胶成像系统上进行
凝胶成像及条带分析。
PCR结束后, 按QIAquick Gel Extraction Kit试
剂盒(QIAGEN)要求切胶回收目的片段条带。回收
的目的片段与Promega公司pGEM-Teasy载体按指
定的实验方法连接16 h, 之后转化大肠杆菌JM109。
经蓝白斑及菌落 PCR筛选 TA克隆阳性转化
子, 挑选出阳性菌落分别命名为 PN32-8和 PN32-
20, 送上海博尚生物技术有限公司进行测序分析, 并
利用序列相似性分析软件Clustal X (1.83)对序列进
行多重比对分析。
构建 pET44a-iso-Ara h 3表达载体时, 挑取阳
性克隆菌落提取质粒, 进行 BamHI和 PstI双酶切,
经 1.5%琼脂糖电泳后, 回收带有酶切位点的目的
片段, 与 pET44a载体在 4 ℃连接 16 h后转化大肠
杆菌Rosetta gami 2, 并用菌落PCR与BamHI、PstI
双酶切鉴定表达载体构建成功与否。经菌落 PCR
与双酶切鉴定后, 挑取阳性克隆诱导表达iso-Ara h 3
外源基因。
诱导表达iso-Ara h 3外源基因时, 取经证实的
阳性表达克隆接种于含 0.4%葡萄糖、40 μg·mL-1
亮氨酸、100 μg·mL-1 氨苄青霉素的 LB培养基中,
37 ℃下振荡培养3.0~3.5 h (OD600为0.5~0.7), 加入
IPTG进行诱导表达, IPTG的终浓度为 0.1、0.2、
0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1, 以研讨最佳
的诱导表达条件。37 ℃下振荡培养 4 h后收获菌
液。同时设立未经诱导的空白对照, 用SDS-PAGE
筛选能够表达外源基因的单克隆菌落。
表达蛋白重组菌裂解后进行SDS-PAGE电泳,
用半干转膜法把PAGE胶中的蛋白转移到甲醇活化
的 PVDF膜上。转膜结束后, 用 PBST (PBS含
0.02% Tween-20)洗膜 2次, 每次 5 min, 然后将膜
置于 5%脱脂奶粉中于室温下封闭 2 h, PBST洗膜
2次, 每次 5 min; 花生过敏阳性血清作为一抗用
PBST稀释后在室温下孵育膜 2 h, PBST洗膜 3次,
每次 5 min; 加入经 PBST稀释(1:1 000)的过氧化物
酶标记的抗人 IgE抗体, 室温下孵育 1.5 h, 再分别
用 PBST与 TBS各洗膜 2次, 每次 5 min; 最后将膜
置于含H2O2的DAB (3,3-二氨基联苯胺)溶液中显
色, 双蒸水洗涤终止显色, 结果拍照保存。
实验结果
1 花生RNA的提取和 iso-Ara h 3基因的获得
提取花生的 RNA后, 取 10 μL产物进行 0.8%
琼脂糖甲醛变性凝胶电泳。从电泳结果中可以看
到, 28S和 18S两条主带明显以及 28S rRNA条带
的亮度是 18S rRNA的 2倍, 说明RNA样品比较完
整, 没有发生明显的降解, 可用于后续的实验(图1-
a)。取 RNA经逆转录获得 cDNA后用作模板, 经
Touchdown PCR扩增后, 取 20 μL产物于 1.2%琼
脂糖凝胶电泳, 在1 500 bp左右出现清晰的亮带(图
1-b), 后续的实验鉴定证实为目的基因。
2 菌落阳性TA克隆的PCR筛选
将PCR产物电泳回收后经TA克隆, 蓝白斑筛
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选后挑取白色菌落, 进行菌落 PCR, 所得产物经琼
脂糖凝胶电泳显示于 1 500 bp左右出现亮带(图2),
初步证实目标片段已经插入 TA载体。
图 1 目的基因的克隆
Fig.1 The target gene cloning
a: RNA提取; b: iso-Ara h 3编码基因扩增。M: DL2000
DNA marker; 1~4: 扩增的目的片段。
图 2 iso-Ara h 3 TA克隆的菌落 PCR鉴定
Fig.2 Colony PCR screening of positive clones
of pGEM-T-iso-Ara h 3
M: DL2000 DNA marker; 1~4: 阳性菌落扩增条带。
3 序列测定与分析
选取菌落中PCR分析后的阳性克隆送测序公
司测序, 并将所得两组克隆序列结果 PN32-8和
PN32-20与GenBank数据库中 iso-Ara h 3序列(登
录号为DQ855115)进行比对, 结果(图 3)表明, PN32-8
突变碱基导致第253位的苯丙氨酸变成亮氨酸; 而
PN32-20突变碱基导致第 48位的丝氨酸变成脯氨
酸, 第 253位的苯丙氨酸变成亮氨酸。
4 表达载体构建后的鉴定
构建好的 pET44a-iso-Ara h 3表达载体用
BamHI、PstI进行双酶切反应, 同时挑取克隆进行
菌落 PCR鉴定。从图 4-a中可以看出, 与未酶切质
粒相比, 双酶切后电泳均有 2条带, 分别为目的条
带和载体条带; 而质粒水平PCR也能扩增出约1 500
bp的目的片段。这表明, 表达载体构建成功, 可以
转化表达宿主菌进行蛋白表达。
5 iso-Ara h 3外源基因的诱导表达
如图 5所示, iso-Ara h 3在Rosetta gami 2中得
到诱导表达。与未诱导相比, 除 0.1 mmol·L-1 IPTG
诱导的条带稍弱以外, 其余浓度 IPTG诱导均有较
好的目的条带(如箭头所示), 且诱导的条带并无明
显差异。
6 iso-Ara h 3蛋白表达的免疫学鉴定分析
用 8例确诊的花生过敏阳性血清对重组获得
的 iso-Ara h 3蛋白进行免疫学鉴定, 结果(图 6)显
示, 8例血清中, 只有第 3例能与重组 iso-Ara h 3蛋
白发生特异性 IgE结合反应(箭头指示的结合条带
位置), 结合率为 12.5%。
讨　　论
Ara h 3是花生中的一种主要过敏原, 并已得
到广泛研究。早期从花生中分离鉴定的Ara h 3蛋
白的分子量约为14 kDa (Eigenmann 等1996; Burks
等 1998); 而经 SDS-PAGE分离及N端测序, 发现
Ara h 3是一个具有 IgE结合特性、分子量约为 60
kDa的蛋白(Rabjohn等 1999)。iso-Ara h 3是近年
来新发现的花生过敏原, 属于 11S球蛋白家族, 与
该家族中的不同物种来源的过敏原有较高的序列同
源性。它与Ara h 3相比, 无论是在基因水平上还
是在氨基酸水平上二者均有很高的同源性。但是,
iso-Ara h 3缺少Ara h 3中的第 4个 IgE结合表位,
因此, 其过敏原性比Ara h 3低(Kang和Gallo 2007)。
Kang和Gallo (2007)报道的 iso-Ara h 3由 510个氨
基酸残基构成, 而从GenBank数据库中检索到的序
列则由 512个氨基酸残基组成。比较后发现, Kang
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图 3 PN32-8和 PN32-20与DQ855115的氨基酸序列比对
Fig.3 Amino acid sequence alignment of PN32-8, PN32-20 and DQ855115
*表示相同序列。
图 4 表达载体的构建和鉴定
Fig.4 Confirmation of the protein expression construct
a: pET44a-iso-Ara h 3的 BamHI、PstI双酶切图。M: DL2000 DNA marker; 1: 未酶切质粒; 2~6: 双酶切质粒。b: 质粒水平
PCR。M: DL2000 DNA marker; 1~5: 扩增片段。
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和Gallo (2007)克隆的序列缺少N末端的 2个氨基
酸残基M和K。我们克隆得到 iso-Ara h 3的两个
同源基因, 其编码蛋白存在 2 处微观不均一性
(microhertogenicity), 重组表达该蛋白后, 经免疫印
迹实验显示, 它的血清 IgE识别率为 12.5%, 比文
献报道的Ara h 3的 45%~54%血清 IgE识别率低
图 5 不同浓度 IPTG下 pET44a-iso-Ara h 3的诱导表达
Fig.5 The expression of pET44a-iso-Ara h 3 induced by
IPTG of different concentrations
M: 蛋白质分子量标准; C: 未诱导对照; 1~7: 0.1、0.2、0.4、
0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1 IPTG诱导。箭头所示为目的条带。
图 6 重组 iso-Ara h 3蛋白的免疫学鉴定
Fig.6 Immunological identification of recombinant
protein iso-Ara h 3
M: Bio-Rad预染蛋白分子量标准; 1~8: 8例花生过敏阳性
血清。
(Rabjohn等 1999; Viquez等 2004), 具有低过敏原
性。因此可以对 iso-Ara h 3进一步改造, 获得更
低过敏原性的重组蛋白, 用于置换其他豆科植物物
种中11S球蛋白过敏原蛋白, 以避免接触强过敏原
而引发严重的过敏反应。
总之, 通过优化 PCR条件, 我们从花生 cDNA
池中扩增到 iso-Ara h 3的两个克隆, 同时进行了重
组蛋白表达, 并用花生过敏阳性血清对重组蛋白进
行鉴定, 发现重组蛋白 iso-Ara h 3是一种低过敏原
性的过敏原。
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