全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (7): 664~670664
收稿 2013-04-01　　修定 2013-04-11
资助 国家自然科学基金(31271706)和国家转基因专项(2009-
ZX08009-010B-3)。
* 通讯作者(E-mail: xiagm@sdu.edu.cn; Tel: 0531-88364525)。
新型HMW-GS基因H1By16 改良转基因小麦面粉品质
陈凡国, 夏光敏*
山东大学生命科学学院, 植物细胞工程与种质创新教育部重点实验室, 济南250100
摘要: 小麦高分子量麦谷蛋白亚基的组成和含量是决定面团弹性的主要因素, 发掘和利用新的高分子量麦谷蛋白亚基是提
高小麦面粉品质的关键。我们利用农杆菌转化技术将小麦体细胞杂种来源的高分子量麦谷蛋白亚基等位变异新基因
H1By16 转入高产、抗盐小麦新品种‘山融3号’ (SR3), 经过PCR筛选和遗传分析, 我们获得了3个转基因纯系T16-like-1、-2
和-3。通过SDS-PAGE技术分析了转基因株系的高分子量麦谷蛋白亚基表达情况, 在T16-like-2和-3两个株系中, 目的基因
出现表达沉默现象; 而在株系T16-like-1中, 目的基因表达, 并且降低了内源高分子量麦谷蛋白亚基基因1By9的表达量。微
面团揉面实验显示新型高分子量谷麦蛋白亚基H1By16可以提高小麦的面粉品质。
关键词: 小麦; 高分子量麦谷蛋白亚基; 基因转化; 面团功能特性
Transformation of Wheat with a Novel High-Molecular-Weight Glutenin Sub-
unit Gene H1By16 Improving Functional Properties of Wheat Flour
CHEN Fan-Guo, XIA Guang-Min*
The Key Laboratory of Plant Cell Engineering and Germplasm Innovation, Ministry of Education, School of Life Science, Shan-
dong University, Jinan 250100, China
Abstract: Composition and content of high-molecular-weight glutenin subunits (HMW-GSs) of wheat are the ma-
jor determinants of the dough elastic properties. It is the key point of the current wheat quality breeding to explore
and use the novel HMW-GSs for improving wheat flour quality. A novel HMW-GS gene H1By16, allelic variation
from 1By9, characterized from wheat somatic hybrid was transformed into a high-yield and salt-resistant new
wheat variety Shanrong No.3 (SR3) by agrobacterium-mediated transformation technique. Three transgenic ho-
mozygous lines were obtained after PCR screening and genetic analysis, named T16-like-1, -2 and -3. Expression
of HMW-GS in the above three lines was examined by SDS-PAGE method. The H1By16 was not expressed in
two lines (T16-like-2 and -3), while expressed in line T16-like-1. Otherwise, the expression of endogenous gene
1By9 was remarkably decreased shown in the protein profile of T16-like-1. It was indicated that the dough strength
of transformed wheat flour with novel HMW-GS H1By16 was significantly increased by the dough mixing test.
Key words: Triticum aestivum L.; high-molecular-weight glutenin subunit (HMW-GS); gene transformation;
dough functional properties
目前全球小麦产量达6亿吨, 养活约35%的人
口(http://www.fao.org)。在我国, 小麦作为主要的
粮食作物种植已历千年, 具有种植面积广、种类
多、产量高、加工后用途广泛等特点。世界范围
内, 小麦的需求量每年增加约2%, 而依靠常规育种
技术, 小麦每年产量仅有1%的提高(Chauhan等
2011)。随着生活水平的提高, 对小麦面粉品质也
提出了很高的要求。小麦的面粉品质主要取决于
占胚乳中储藏蛋白含量80%的麦谷蛋白家族, 这一
类蛋白赋予了小麦面粉特有的粘弹性, 从而可以生
产多样的小麦制品(She等2011)。因此, 应用现代生
物技术, 选育优质、高产的小麦新品系(种), 以实
现小麦育种的新突破成为急需解决的问题之一。
成熟小麦种子储藏蛋白主要由谷醇溶蛋白
(prolamin)家族组成, 包括麦谷蛋白(glutenin)和醇
溶蛋白(gliadin)。根据SDS-PAGE中迁移率的不同,
麦谷蛋白又可以分为高分子量麦谷蛋白亚基(high-
molecular-weight glutenin subunit, HMW-GS)和低
研究报告 Original Papers
陈凡国等: 新型HMW-GS基因H1By16 改良转基因小麦面粉品质 665
分子量麦谷蛋白亚基(low-molecular-weight glute-
nin subunit, LMW-GS)。HMW-GS虽然只占小麦蛋
白总量的很少部分, 但是研究的最为深入, 已知它
在面包烘烤过程中起着非常关键的作用, 是面粉
弹性的主要决定因素。LMW-GS因其位点多且家
族庞大, 研究相对较少, 通常认为它与HMW-GS一
起决定面粉的弹性。醇溶蛋白是小麦胚乳的主要
储藏蛋白, 在组成和遗传上具有高度的复杂性和
异质性, 一般认为它们可以通过非共价键的形式
与麦谷蛋白互作, 决定了小麦面粉的延展性。编
码HMW-GS的基因位于第1染色体同源群长臂的
Glu-1位点上; 编码LMW-GS的基因主要位于第1染
色体同源群短臂的Glu-3位点上, 与大部分的γ-、
全部的ω-醇溶蛋白的位点紧密连锁(Shewry等
2003); 醇溶蛋白主要由Gli-1和Gli-2两个位点编码,
它们分别位于第1和第6染色体同源群。除此之外,
还有一些微小的基因位点, 编码少量的ω-醇溶蛋
白(Shewry等2003)。在麦谷蛋白中, HMW-GS和
LMW-GS对小麦面粉的品质具有累加效应和互作
效应; 越来越多的研究表明醇溶蛋白在小麦烘烤
品质方面也发挥着重要的作用, 虽然目前还不清
楚每一种醇溶蛋白对面粉品质的作用, 但是初步
的研究结果表明不同醇溶蛋白对小麦面粉品质的
作用是不同的。
为了克服传统育种的局限性, 现代生物技术
尤其是转基因技术已经在小麦育种理论和实践研
究中广泛开展。转基因育种的优势在于不但扩大
了育种的基因源, 打破了物种间基因交流的限制,
而且可以实现精确的遗传改良, 缩短育种周期。
转基因技术还可以与常规育种相结合, 有效地改
良小麦种质资源。当前, 转基因小麦研究主要集
中在抗性育种、品质改良和提高产量等方面。统
计发现较为常用的小麦转基因方法是基因枪法和
农杆菌介导法, 与基因枪法相比, 农杆菌介导法具
有操作简单, 设备要求低, 插入片段稳定性好及拷
贝数低等优点, 但是此方法最大的不足就是转化
效率受宿主基因型的限制很大。自1983年第1株
转基因植物问世, 经过近30年的发展, 无论在基础
理论研究方面还是实际生产应用领域, 转基因技
术都取得了很大的进步。小麦转基因研究起步较
晚, Vasil 等(1992)用基因枪法将bar基因导入小麦
幼胚, 获得了世界上第1株转基因小麦; Weeks等
(1993)初步建立了基因枪法转化小麦的技术体系,
将gus基因和bar基因转入小麦; Cheng等(1997)和
Xia等(1999)利用农杆菌介导法转化小麦, 成功获
得转基因株系。Zhao等(2006)和赵同金等(2010)报
导了利用小麦生长点转化技术, 成功获得了转基
因的抗病小麦的后代。Blechl和Anderson (1996)首
次利用转基因技术改良小麦面粉品质, 将HMW-
GS 1Dx5+1Dy10嵌合基因导入小麦, 转基因株系的
HMW-GS的含量得到了提高, 这为利用转基因技
术改良小麦加工品质奠定了基础。
国内外的HMW-GS转基因研究主要集中在对
提高面粉品质有很大影响的优质亚基, 如1Ax1、
1Dx5和1Dy10 (Altpeter和Vail 1996; Blechl和An-
derson1996; Barro等1997; Vasil等2001; 施农农等
2005; Blechl等2007; León等2009, 2010; Wang等
2009), 将这些亚基通过基因工程的方法转化小麦,
以期提高面团的强度, 获得新的小麦种质资源。
另外, 有些研究将HMW-GS亚基基因嵌合后在小
麦中表达。如McIntire等(2005)用Dy10亚基的N-端
取代Dx5亚基的N-端, 将这种嵌合的新基因转入小
麦后, 转基因株系表现出弱的面粉品质。推测其
原因可能是这种嵌合亚基的N-端和C-端通过一个
二硫键形成一个单体亚基, 因而影响了面粉的品
质。Yue等(2008)将Bobwhite小麦中的1Dx5亚基基
因通过RNA干扰方法使其沉默。在获得的6个转
基因株系中, 有4株1Dx5亚基完全沉默, 另外2株
1Dx5亚基部分沉默。对这2个株系面粉实验发现,
它们均表现出谷蛋白表达和面粉品质的降低, 由
此也说明了1Dx5亚基对面粉品质的重要作用。
在转基因株系中还表现出1Bx7亚基的表达显著
降低。
小麦HMW-GS转基因研究虽然已经取得了一
定的进展, 但是还有诸多问题有待解决, 例如: 目
前可用的与面粉优质相关的HMW-GS基因较少;
小麦HMW-GS转基因后代中目的基因沉默和表达
不稳定现象较为突出等。‘山融3号’是本实验室创
制的小麦渐渗系新品种, 具有高产和抗盐等特点,
但是前期的研究表明该品种面粉品质一般, 而通
过改变HMW-GS的组成和表达量的方法可以提高
受体小麦的面粉品质(Shewry等2003)。本研究将
植物生理学报666
小麦与长穗偃麦草体细胞杂种后代II-12 (Xia等
2003)中经等位变异产生的面粉优质相关HMW-GS
编码基因H1By16 (Feng等2004)转化SR3, 以期获得
高产、优质、抗逆的小麦新品种和新种质资源。
材料与方法
1 植物材料
本实验室创制和保存的小麦渐渗系高产、抗
盐新品种‘山融3号’ (SR3)及其亲本普通小麦‘济南
177’ (JN177), 它们的HMW-GS组成均为1A null、
1Bx7+1By9和1Dx2+1Dy12, 不含有H1By16亚基。
2 真核表达载体的构建
目的基因H1By16是由本实验室从小麦体细胞
杂种株系II-12中克隆并保存在pUCm-T中(Feng等
2004), 因其蛋白电泳迁移率与普通小麦来源的
1By16相同而命名, 所使用的启动子为HMW-GS基
因1Bx17的启动子, 全长为1 991 bp, 该启动子可以
保证目的基因在小麦胚乳中特异表达(Tamás等
2009), 由Li ZY博士(CSIRO Division of Plant Indus-
try, Australia)提供; 另外, 该质粒还携带有筛选标
记基因NPTII, 用于转基因植物的筛选。实验方法
参照标准实验程序(Sambrook等1989)。
3 小麦遗传转化
首先将含有目的基因的质粒p1Bx17::H1By16
转化感受态的根癌农杆菌AGL1中, 阳性转化子经
菌落PCR筛选和测序验证正确后备用。其次, 对待
转化小麦种子进行灭菌处理, 经乙醇(75%, 30 s)→
无菌水 (2~3次 , 每次3 min)→0.1%的升汞 (10
min)→无菌水(3~5次, 每次3 min)处理后摆放在盛
有饱和无菌水滤纸的培养皿中过夜, 待种子露白
后转入4 ℃冰箱中春化30 d以上; 待麦芽长至1~3
cm后待用, 具体转基因操作参照赵同金等(2010)。
4 转基因植物的筛选和目标基因的表达检测
4.1 卡那霉素喷苗筛选
待检测转基因小麦在花盆中培养至小苗健壮
后, 用50 μg⋅mL-1卡那霉素溶液喷洒小苗, 隔日喷
洒, 待喷洒2~3周后将存活的麦苗移栽到温室转基
因隔离区继续培养。
4.2 转化麦苗的PCR检测和转基因纯系的获得
利用CTAB法提取叶片总DNA。用以检测阳
性株系的上游引物P1位于启动子区域, 序列为:
5′-ACCGATTTGTTCTTCTCACGCT-3′; 下游引物
P2位于目的基因内部, 序列为: 5′-TGTGGTCT-
CGCCAGGGTAGAA-3′。PCR反应是在20 μL体系
中进行的, 反应条件为: 预变性95 ℃ 5 min, 35个循
环为: 94 ℃ 45 s, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 最后72
℃延伸10 min, PCR产物用1.2% Agrose电泳鉴
定。利用基因组PCR技术对转基因T0~T2代进行检
测, 并对T1代进行遗传统计和卡方检测, 结合T2代
的PCR结果以确定转基因纯系。
4.3 转基因植物目标基因的表达检测
经PCR分析的T3和T4代纯系随机选取2粒种
子, 按照单粒小麦磨粉, 每4 mg 样品中加入100 μL
蛋白提取液, 其组成含有0.125 mol⋅L-1 Tris-HCl缓
冲液(pH6.8)、4% SDS (W/V)、1% DTT (W/V)、
20%甘油(W/V)、0.03% Pyronin Y, 混合均匀, 沸水
中煮沸10 min, 18 000×g 离心30 min, 收集上清液
用于SDS-PAGE电泳检测。电泳采用不连续缓冲
体系, 即4%的浓缩胶和7.5%~10%的梯度分离胶,
交联度均为2.66%。4 ℃下稳流电泳(10 mA)至指
示剂迁移至凝胶底部。电泳后的凝胶在考马斯亮
蓝染液[含有0.1% (W/V)考马斯亮蓝R250、10%
(W/V)甲醇和50% (W/V)乙酸]中染色30 min, 染色后
在热水中脱色至背景干净。
5 转基因后代籽粒面粉品质相关参数的测定
微面团实验所用仪器为10 g Mixograph (Na-
tional Mfg. Co., Lincoln, NE) (Walker和Walker
1992), 所使用参数包括3个反映面团强度的正效应
值: 揉面时间(mixing time, MT), 8分钟宽度(TxW),
峰值时带宽(PW); 1个负效应值: 峰值衰落斜率
(RPS) (Walker和Walker 1992; Lee等1999)。实验用
T4代转基因种子, 同年同地块种植的转基因受体
SR3及其体细胞杂种亲本JN177作为对照, 使用10
g面粉(含水量为14.5%), 操作过程为: 加入6.2 mL
蒸馏水搅拌30 s后关闭仪器, 静置5 min后开启仪器
继续搅拌10 min, 实验过程中的峰图和各项参数由
Mixograph设备记录。
实验结果
1 胚乳特异表达载体的构建
已有研究表明, 1Bx17的启动子是小麦胚乳特
异的强启动子, 有利于HMW-GS基因的高效表达
陈凡国等: 新型HMW-GS基因H1By16 改良转基因小麦面粉品质 667
(Tamás等2009)。利用内切酶BglII和EcoRV双酶切
含有HMW-GS基因H1By16的克隆载体pUCm-T, 释
放的目的基因片段与利用BamHI和KpnI双酶切的
载体pZLBx17casNKEco相连, 这样就将H1By16插
在启动子1Bx17下面; 利用XbaI分别单切前面构建
的中间载体和真核表达载体pBIN20, 最后将释放
的1Bx17+H1By16片段与与pBIN20以粘末端相连,
构建好的载体命名为p1Bx17::H1By16 (图1)。
论值3:1, 符合单基因位点显性孟德尔遗传规律(表
1); 经进一步对T2代单株的PCR检测和筛选, 获得
了转基因纯系(图3), 分别命名为T16-like-1、T16-
like-2和T16-like-3。
2 HMW-GS变体H1By16转化小麦SR3与转基因
植物鉴定
选取本实验室培育成功的高产、抗盐小麦新
品种SR3为转化受体, 对转化后存活的850株T0代
小麦株系进行卡那霉素初步筛选, 获得了104株抗
性材料, 这些材料大部分生长旺盛。利用CTAB法
提取抗性植株叶片DNA, 以引物P1和P2进行PCR
检测, 并通过测序进行确认。结果发现, 经卡那霉
素初步筛选的104棵植株中, 阳性植株有14棵(图2),
占总转化850棵小麦的1.7%。进一步对阳性植株
的旗叶和幼穗进行PCR检测, 均获得了目标条带,
表明这些转基因植株不是嵌合体。
3 转基因小麦的表达分析
为了确定目的基因是否在受体小麦中表达,
利用SDS-PAGE检测3个转基因纯系的T3和T4代种
子中高分子量麦谷蛋白亚基的组成。结果发现,
T16-like-2和-3两个株系的高分子量谷蛋白亚基组
成与受体亲本一致, 可能是发生了转基因沉默; 转
基因株系T16-like-1在HMW-GS 1By16处出现了较
强的蛋白条带, 而内源HMW-GS基因1By9的表达
则受到了明显的抑制(图4)。
图1 植物表达载体p1Bx17::H1By16的构建
Fig.1 The construction of plant expression vector
p1Bx17::H1By16
图2 T0代转基因植株PCR扩增结果
Fig.2 PCR amplification of putative transgenic plants T0
1~14为阳性植株, M为分子量标准, “-”为阴性对照, “+”为阳
性对照, 箭头指示阳性条带。
将得到的14个T1代种子春化后播种, 通过幼
苗卡那霉素筛选和PCR检测, 筛选出了3个单基因
插入的阳性株系, χ2检测显示其遗传分离比接近理
图3 转基因纯系T2代PCR鉴定
Fig.3 T2 progeny PCR profile of transgenic homozygous lines
图4 转基因株系T16-like-1 T3和T4代种子高分子量谷蛋白
亚基的SDS-PAGE图谱
Fig.4 SDS-PAGE profile of HMW-GS from T3 and T4 seeds
of transgenic strain T16-like-1
1和2为T3代的种子, 3和4为SR3的种子(受体), 5和6为T4代的种子。
植物生理学报668
4 微面团实验
为了验证目的基因的导入是否影响了受体的
面粉品质特性, 选取了相同位置种植的同期T16-
like-1的T4代及受体小麦SR3和JN177的种子经磨
粉后进行了揉面实验。3次重复实验的四项参数
(揉面时间MT, 8分钟宽度TxW, 峰值时带宽PW和
峰值衰落斜率RPS)的平均值见表2。结果显示, 与
对照SR3和JN177相比, 转基因株系面团的MT、
PW和TxW值提高显著, 而RPS值则显著降低, 这说
明H1By16亚基的转入显著地提高了转基因小麦的
面团强度。
讨　　论
应用遗传工程技术进行小麦面粉加工品质改
良主要有两种策略: (1)是利用其本身贮藏蛋白基
因或改造后进行转化; (2)是利用小麦近缘种属的
优良基因导入小麦。小麦面粉加工品质的改良目
前侧重于烘烤品质的提高, 而影响烘烤品质的最
重要的因素是谷蛋白中的HMW-GS。尽管HMW-
GS在种子贮藏蛋白中所占比例很小(约占种子总
蛋白的5%~10%), 但它们的组成和含量与谷蛋白
聚合体的形成密切相关, 是决定面团弹性的主要
因素(Shewry等2003)。HMW-GS的组成与数目受
遗传控制, 具有品种的稳定性。由于编码x型和y
型HMW-GS的基因紧密连锁, 传统的育种方法只
能对同一位点的不同亚基组合进行面粉品质贡献
的评价。研究认为在Glu-1A位点1Ax1或者1Ax2*
对加工品质的贡献大于1AxNull, 在Glu-1B位点
1Bx13+1By16、1Bx14+1By15、1Bx17+1By18以
及1Bx7+1By8对加工品质的贡献大于1Bx7+1By9
或1Bx6+1By8, 在Glu-1D位点上1Dx5+1Dy10的贡
献要大于1Dx2+1Dy12 (Payne 1987; Shewry等
1992, 2003)。但越来越多的研究表明同一小麦在
不同地区种植品质表现不同, 因此科研者根据各
国的具体情况对该评分标准进行了修正(Shewry等
1992)。另外, 有些品种尽管含有优质亚基(如‘农大
142’含有1Dx5+1Dy10), 但烘烤品质并不好; 有的
品种含优质亚基数目较少或不含优质亚基, 却有
好的烘烤品质, 因此这些问题有待进一步的研究,
以便对小麦加工品质育种进行更好的指导。
随着转基因技术的应用, 对单个HMW-GS在
小麦面粉品质的作用研究提供了便利的手段, 大
量的体外和转化小麦的实验证明1Ax1、1Dx5和
1Dy10等单个亚基可以提高受体小麦的面团强
度。同时, 部分温室和大田HMW-GS基因转化小
表1 转基因植株T1代遗传分析
Table 1 Genetic analysis of T1 progeny of transgenic wheat
plants
T1代 植株数 阳性数:阴性数 理论比值 χ
2 P
T16-like-1 75 52:23 3:1 1.26 0.25~0.5
T16-like-2 62 50:12 3:1 0.77 0.25~0.5
T16-like-3 73 49:24 3:1 2.01 0.10~0.25
麦实验也显示导致了面团强度的降低(Shewry等
2006; León等2009)。另外转基因技术的应用也为
鉴定和应用小麦近缘属种的优质HMW-GS成为可
能。一般认为HMW-GS中半胱氨酸残基的数目、
位置以及二级结构是影响它们对面粉最终品质的
关键因素之一(Shewry等2003)。本实验所利用的
目的基因H1By16来自于小麦体细胞杂种II-12, 研
究发现该基因来自1By9的等位变异, 具有额外的
半胱氨酸残基和不同于1By9的二级结构, 更利于
蛋白大聚体的形成, 是一个潜在的优质亚基(Feng
等2004)。受体小麦SR3具有产量高、抗盐等特点,
HMW-GS组成为1Bx7+1By9, 1Dx2+1Dy12, 没有
优质亚基或组合, 面粉加工品质较差, 因而是比较
理想的检测外源HMW-GS基因功能的受体(León
等2009)。Feng等(2004)认为H1By16的结构特点有
利于蛋白大聚体的形成 , 可能会增强面团的强
度。在本实验中, 转化H1By16基因后, 小麦面粉品
质明显地大幅度提高(表2)。通过SDS-PAGE和A-
PAGE对其麦谷蛋白和醇溶蛋白组成分别进行了
检测, 发现除了抑制非优质亚基基因1By9的表达
表2 转基因株系T16-like-1的面团品质参数
Table 2 Mixograph parameters of T16-like-1 flour
小麦品种(系) MT/m TxW/% PW/A.U. RP/%·min-1
JN177 2.1B 5.0B 88C –1.6B
SR3 2.3B 6.1B 134B –2.35A
T16-like-1 2.8A 19.4A 187A –1.45B
　　表中的参数为3次实验结果的平均值, 不同大写字母表示当
P<0.01时有显著差异。
陈凡国等: 新型HMW-GS基因H1By16 改良转基因小麦面粉品质 669
外, LMW-GS和醇溶蛋白几乎没有发生变化(图
略)。因此我们推测, H1By16的出现, 虽然没有增
加转基因小麦的HMW-GS基因的拷贝数和表达量,
但是由于自身的结构特点更有利于大面团的形成,
因而促进了面粉品质的提高。
在本实验所筛选的3个转基因纯系中, 有2个
株系没有表达H1By16蛋白, 可能是出现了转基因
沉默现象 ; 此外即使在有目的基因表达的株系
T16-like-1中也出现了内源基因1By9表达下调或沉
默的情况, 这种情况在以往的实验中也有出现(施
农农等2005; Barro等1997; Alvarez等2000)。从遗
传上分析, HMW-GS基因在转基因植株中的表达
和稳定性可能主要受外源基因在受体基因组中的
整合情况和转录情况等因素的影响(Alvarez等
2000)。首先可能是整合位置的影响, 如果整合处
于高度甲基化或异染色质的地方, 可以导致目的
基因的甲基化或异染色质化使得外源基因发生沉
默; 其次, 受体基因组对外源基因的表达可能存在
一种防卫机制, 如对外来基因进行甲基化等, 导致
转录水平的沉默; 第三, 共抑制现象, 当外源基因
同内源基因高度同源时, 两者可能同时发生表达
沉默, 这属于转录后的基因沉默; 第四, 在一些遗
传转化中 , 目的基因和受体植物染色体同源的
DNA发生断裂, 使目的基因和宿主同源片段发生
DNA重排现象; 此外, 转入的目的基因不稳定整合
等也影响着外源基因的表达 (王关林和方宏筠
2009)。本实验中出现的转基因抑制或沉默现象有
待设计系统实验探讨其发生的机制。
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