全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (7): 1099~1108　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0034 1099
收稿 2015-01-13　　修定 2015-06-26
资助 中央高校基本科研业务费自主创新重点研究项目(KYZ201111)、国家高技术研究发展计划(“863”计划) (2012AA100202)和江苏省
科技支撑计划(BE2012325)。
* 通讯作者(E-mail: yingli@njau.edu.cn; Tel: 025-84395756)。
镉胁迫对不结球白菜Vc合成L-半乳糖途径基因表达及抗氧化系统的影响
张琳, 崔红米, 王建军, 侯喜林, 李英*
南京农业大学园艺学院, 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 南京210095
摘要: 为了探究Cd2+胁迫对不结球白菜的种子萌发以及L-半乳糖途径基因表达、抗坏血酸(L-ascorbic acid, AsA)含量及抗
氧化酶等指标的影响, 以不结球白菜品种‘苏州青’为材料, 设定不同浓度的Cd2+处理种子和幼苗。结果表明, Cd2+胁迫对不
结球白菜种子萌发时胚根的损伤随Cd2+浓度的增加而加重; AsA含量在6~12 h内持续升高, 24 h时显著降低, 48 h时, Cd2+胁
迫的AsA含量均显著低于对照, 总AsA含量与对照差异不显著。L-半乳糖途径多个基因的表达量均与AsA含量变化保持一
致, PMI和GGP对50 μmol·L-1 Cd2+胁迫较为敏感, 在Cd2+胁迫12 h达到峰值; PMM、GMP、GPP、GalDH和GalLDH对100
μmol·L-1 Cd2+胁迫响应较为迅速, 在Cd2+胁迫后6 h达到峰值; 胁迫5 d时, SOD在抗氧化酶系统中起主要防御功能; 胁迫10 d
时, POD、CAT和APX清除活性氧的效率要高于SOD; MDA含量随Cd2+浓度增大和Cd2+胁迫时间延长显著急剧升高; 胁迫
10 d时, Cd2+胁迫的叶绿素含量均显著低于对照水平。这表明Cd2+胁迫对不结球白菜的形态发育及抗氧化系统均造成了不
同程度的损伤, 对抗坏血酸合成相关基因的表达造成了不同程度的影响。
关键词: 不结球白菜; Cd2+胁迫; L-半乳糖途径; 抗坏血酸; 抗氧化系统
Effects of Cadmium Stress on Genes Expression in L-Galactose Pathway Involved
in Vc Biosynthesis and Antioxidant System of Brassica campestris ssp. chinensis
ZHANG Lin, CUI Hong-Mi, WANG Jian-Jun, HOU Xi-Lin, LI Ying*
College of Horticulture, State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University,
Nanjing 210095, China
Abstract: In order to investigate the effects of Cd2+ stress on the seed germination, genes expression in the
L-galactose pathway, AsA content and antioxidant enzymes and other indicators in non-heading Chinese cab-
bage (Brassica campestris ssp. chinensis), we used non-heading Chinese Cabbage ‘Suzhouqing’ as material,
and set different concentrations of cadmium treatments of seeds and seedlings. The results showed that the radi-
cles injury of germinated seeds under Cd2+ stress aggravated along with the increase of Cd2+ concentration. The
contents of AsA continued to rise during 6–12 h, then significantly decreased at 24 h, which were significantly
lower than that of the control at 48 h, while total AsA contents had no significant difference with the control.
The expression of most genes in the L-galactose pathway were consistent with AsA contents, PMI and GGP
were sensitive to 50 μmol·L-1 Cd2+ stress, and reached the peak at 12 h after treatment; PMM, GMP, GPP,
GalDH and GalLDH responded swiftly to 100 μmol·L-1 Cd2+ stress, which showed the peak values at 6 h after
treatment. SOD played the main role of defense in the antioxidant system after 5 d treatment, while the ROS
scavenge efficiencies of POD, CAT and APX were higher than that of SOD after 10 d treatment; the contents of
MDA increased sharply along with the increase of Cd2+ concentration and the extension of treatment time; chlo-
rophyll contents with Cd2+ treatment were significantly lower than that of the control eventually. These results
revealed that cadmium stress made the damage to morphological development and antioxidant system in
non-heading Chinese cabbage, and also made different effects on genes expression in AsA biosynthesis path-
way.
Key words: non-heading Chinese cabbage (Brassica campestris ssp. chinensis); Cd2+ stress; L-galactose path-
way; ascorbic acid; antioxidant system
植物生理学报1100
镉(Cd)是一种毒性很强的重金属, 属于蓄积
性毒物, 镉在土壤中移动性高, 对作物危害严重(张
雯等2014)。我国对蔬菜中Cd2+含量有明确规定:
根菜类限量0.1 mg·kg-1, 叶菜类限量0.2 mg·kg-1, 其
他蔬菜限量0.05 mg·kg-1 (何江华等2003)。当Cd2+
在植物体内积累到一定浓度时, 植物会表现出根
系短小变褐、侧根少、茎生长缓慢、叶片变黄、
卷曲以及斑点, 植株矮小、褪绿、产量下降等不
良症状(Schutzendubel等2001)。
不结球白菜是十字花科芸薹属植物, 原产中
国, 含有丰富的矿物质和维生素C (宋玉萍等2007),
在我国南方栽培十分广泛。维生素C又名抗坏血
酸(L-ascorbic acid, AsA), 在植物光合作用、细胞
分裂和生长代谢中发挥着重要作用 (安华明等
2004; 王洪政和沈振国2006), 同时AsA还是植物和
大多数动物体内重要的非酶类抗氧化剂, 在环境
胁迫条件下能维持较高水平(陈坤明等2004), 从而
增强植物的抗逆性。植物体内AsA的积累调控非
常复杂, AsA水平随植株的生长发育而变化, 同时
也受到环境因子的调节。L-半乳糖途径是高等植
物中AsA生物合成的最主要途径(Dowdle等2007;
Smirnoff和Wheeler 2000), 研究植物AsA生物合成
途径每步反应催化酶与AsA积累的联系, 或可探究
Cd2+胁迫对AsA合成积累的影响。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)
和过氧化物酶(peroxidase, POD)是植物体内活性氧
清除系统的主要保护酶, 其协同作用可抵抗活性
氧对植物细胞造成的伤害(陈艺晖等2011)。抗坏
血酸过氧化物酶(ascorbic acid peroxidase, APX)是
以抗坏血酸为电子供体的专一性强的过氧化物酶,
它和SOD、过氧化氢酶(catalase, CAT)、单脱氢抗
坏血酸还原酶(monodehydroascorbate reductase,
MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate
reductase, DHAR)以及谷胱甘肽还原酶(glutathione
reductase, GR)一起构成了植物体内清除活性氧的
酶系统(Chen和Asada 1989)。丙二醛(malondialde-
hyde, MDA)作为脂膜过氧化作用的终产物, 其含
量与细胞膜受损害程度密切相关, MDA的大量积
累可影响电解质外渗, 严重时甚至可导致细胞死
亡(Kuk等2003; Limón-Pacheco和Gonsebatt 2009;
惠竹梅等2013)。重金属胁迫下, 植物受损最普遍
的症状之一就是叶绿素含量减少导致的叶片退绿
(Ekmekci等2008; Ghnaya等2005; Mobin和Khan
2007)。叶绿素可以从根本上影响光合器官的功
能, 进而影响整个植物的新陈代谢, 因此叶绿素含
量是评价重金属胁迫的重要因素之一。
较多的重金属进入植物体内会影响植物正常
生理代谢活动(张雯等2014)。目前有关烟草(Guan
等2009)、大蒜(Zhang等2005)、水稻(肖美秀等
2006)、蚕豆(李源等2009)和二穗短柄草(张雯等
2014)等作物在Cd2+胁迫条件下的形态发育、抗氧
化酶系统活性以及细胞活力等方面的研究已有较
多的报道。
有研究表明, 不结球白菜对重金属元素的富
集以镉为首(陈晓婷等2002)。本文针对不结球白
菜对Cd2+ 胁迫的生理响应机制进行研究, 初步探讨
了Cd2+胁迫对不结球白菜种子萌发以及L-半乳糖
途径基因表达、抗坏血酸含量及抗氧化酶等指标
的影响, 为不结球白菜镉污染的诊断和响应机理
的研究提供参考。
材料与方法
1 材料与胁迫处理
不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis
Makino)品种‘苏州青’由南京农业大学白菜课题组
提供。试验所用试剂CdCl2·2.5H2O为分析纯, 购于
南京寿德实验器材有限公司。
不结球白菜种子(100粒)用去离子水冲洗干
净, 于铺有2层滤纸的培养皿上催芽, 用0、50、
100和200 μmol·L-¹的Cd2+处理液(用CdCl2·2.5H2O
配制, 浓度以Cd2+计, 以蒸馏水处理为对照, 下同)
浸湿滤纸, 每隔24 h统计发芽率并补充处理液。
Cd2+胁迫于第3天结束, 统计各处理的胚轴和胚根
长度(每皿随机选取10棵进行测定)。
不结球白菜播种穴盘, 4~5片真叶时, 选取生
长整齐一致的幼苗移至营养钵, 基质为泥炭:蛭石=
2:1, 用改进的1/2Hoagland (pH=6.5) (郭世荣2003)
营养液浇灌植株。缓苗5 d后, 用不同浓度的Cd2+
处理液浇灌植株, 每天浇1次, 以浇透营养钵为准,
按时间点取样测定, 每个样品取3次重复。
2 AsA和T-AsA含量的测定
分别于Cd2+胁迫后0、6、12、24和48 h对不
张琳等: 镉胁迫对不结球白菜Vc合成L-半乳糖途径基因表达及抗氧化系统的影响 1101
结球白菜进行取样 , 叶片中AsA和总抗坏血酸
[T-AsA, 即AsA+DHA (脱氢抗坏血酸)]含量参照
Bartoli等(2006)的高效液相色谱法(HPLC), 并做适
当改动。HPLC高效液相色谱仪型号为Agilent
1120 Compact LC。取0.2 g叶片, 放入研钵中, 加入
1.5 mL 0.1%的草酸充分研磨, 12 000×g 4 ℃ 离心
20 min, 上清液用0.22 μm过滤器过滤到一个洁净
的离心管中, 用于测定AsA含量。
取200 μL滤液, 加入200 μL的20 mg·mL-1 DTT
溶液, 涡旋混匀, 暗处反应15 min, 测定T-AsA含
量。在高效液相色谱仪上进样, 色谱条件为流动
相0.1%的乙酸, 流速1 mL·min-1, 进样10 μL, 柱温30
℃, 检测波长为245 nm。
3 RNA的提取和实时荧光定量PCR引物设计
RNA提取试剂盒购自天根公司, 具体方法参
照TianGen植物RNA提取试剂盒说明书。分别以
0、6、12、24和48 h取样的不结球白菜叶片总
RNA为模板, 按照TaKaRa公司PrimeScript® RT
(TaKaRa, Japan) 试剂盒说明书反转录部分合成
cDNA。
实时定量PCR检测L-半乳糖途径的8个基因
表达量所用引物参照张硕(2011)一文设计(表1), 内
参基因为Actin, 实验所用引物由南京金斯瑞生物
公司进行合成。实时定量体系参照TaKaRa公司
SYBR® Premix Ex TaqTM 试剂盒说明书。荧光定量
PCR仪为伯乐公司的biorad-IQ5 (Bio-Rad, Hercu-
les, CA, USA)。PCR程序采用两步法: 95 ℃ 2 min;
95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环; 设置65 ℃到95 ℃
的熔解曲线。实验数据用仪器自带软件处理, 用
Excel 2010软件分析。
表1 荧光定量引物
Table 1 Primer of real-time PCR
基因名称 引物 序列(5→3)
6-磷酸甘露糖异构酶 q-pmi-f AGAACTACGAGTGGGGCAAA
(mannose-6-phosphate isomerase, PMI) q-pmi-r TTATCCGAAACCCACGACTT
甘露糖磷酸转移酶 q-pmm-f GTCACTGTTGGAGTCGTCGG
(phosphomannomutase, PMM) q-pmm-r AATGTTCCCCTTTTGATTGG
GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶 q-gmp-f AAAGAAGTCTCCCGCCAAGC
(GDP-D-mannose pyrophosphorylase, GMP/VTC1) q-gmp-r GCACCGTGAAAGCCTAACCC
GDP-D-甘露糖-3,5-表异构酶 q-gme-f GCGACGAGTTCCACCTTGTT
(GDP-D-mannose-3’,5’-epimerase, GME) q-gme-r CCCATTGATCCTAGCAGCCT
GDP-L-半乳糖磷酸化酶 q-ggp-f GCTGATTGTGGAAGGCAGAT
(GDP-L-galactose phosphorylase, GGP/VTC2) q-ggp-r AGGCAGTCCCGTTGGTGATA
L-半乳糖-1-磷酸酶 q-gpp-f TACCATAGCCGATTGGAACG
(L-galactose-1-phosphate phosphatase, GPP/VTC4) q-gpp-r CCAATGCTTGCTGATGAATG
L-半乳糖脱氢酶 q-GDH-f AAGCAGGATGCCATTCAGGA
(L-galactose dehydrogenase, GalDH) q-GDH-r ACAGGAAGGGAAGACACGGT
L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶 q-GLDH-f GAAATCCTGGGCTTTGACTG
(L-galactono-1,4-dehydrogenase, GalLDH) q-GLDH-r CTCCCTTCGTGCTTTGTTGT
内参基因Actin q-actin-f GTTGCTATCCAGGCTGTTCT
q-actin-r AGCGTGAGGAAGAGCATAAC

4 不结球白菜中Cd2+含量的测定
不结球白菜幼苗于Cd2+胁迫5和10 d分别取样,
样品用去离子水充分洗净, 将地上部和根部分开,
80 ℃烘干至恒重, 研磨成粉末后充分混匀, 取0.50
g, 加入HNO3:HClO4 (4:1, V:V)混合液消煮(Zhao等
1994), ICP-AES (Perkin Elmer 2100 DV, USA)测定
Cd2+含量。
5 其他各项生理指标的测定方法
粗酶液的提取按照李合生(2000)的方法进行,
用于测定抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性。取
冻存的叶片样品0.2 g, 加入5 mL含1%聚乙烯吡咯
烷酮(PVP)的50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0), 冰浴
研磨成匀浆, 4 ℃下15 000×g离心15 min, 上清液即
为粗酶提取液。SOD活性测定参照李合生(2000)
植物生理学报1102
的氮蓝四唑(NBT)光化还原法, 以抑制NBT光还原
反应50%的酶量为1个酶活力单位, 结果以U·mg-1
(蛋白)计算。POD活性测定参照李合生(2000)的愈
创木酚显色法, 以1 min内A470变化0.01为1个酶活
力单位, 结果以U·mg-1 (蛋白)·min-1计算。CAT活性
测定参照Zhang等(2005)的方法, 以1 min内A420减
少0.1为1个酶活力单位, 结果以U·mg-1 (蛋白)计
算。APX活性参考Nakano和Asada (1981)和朱祝
军(1997)的方法在A290条件下测定。MDA含量采
用硫代巴比妥显色法进行测定(李合生2000), 取0.2
g样品, 加入1.6 mL 10% TCA研磨, 12 000×g离心10
min, 取上清1.5 mL, 加入1.5 mL 0.67% TBA后, 沸
水煮30 min, 冷却后离心, 取上清后分别测定A450、
A532和A600, 按相应公式进行计算, 以μmol·g
-1 (FW)
表示。叶绿素含量用比色法进行测定, 参考郭胜
伟和高云东(2004)的方法并稍作改动, 根据提取液
中叶绿素浓度, 换算每克鲜叶中叶绿素含量mg·g-1
(FW)。
6 数据处理与分析
所有指标测定均重复3次, 试验数据采用SPSS
20.0和Excel 2010进行One-way ANOVA单因素方
差分析和统计处理, 组间比较用LSD检验, 荧光定
量PCR数据采用2-ΔΔCt法进行计算分析。
实验结果
1 不同浓度镉胁迫对白菜种子萌发的影响
用不同浓度的Cd2+处理不结球白菜种子, 观察
种子萌发的形态变化(图1), 统计种子发芽率及胚
轴、胚根长度(表2)。图1结果显示, 随着Cd2+浓度
升高, 胚根伸长受到了显著的抑制, 同时胚根的形
态出现了不同程度的卷曲, 200 μmol·L-1 Cd2+胁迫
后胚根几乎无法正常生长。
图1 镉胁迫对不结球白菜种子萌发形态的影响
Fig.1 Effects of Cd2+ stress on morphology of
non-heading Chinese cabbage seedling
标尺为5 mm·格-1。
表2 不同浓度镉胁迫对不结球白菜种子发芽的影响
Table 2 Effects of different concentrations of Cd2+ on germination of non-heading Chinese cabbage seed
Cd2 +浓度/μmol·L-1
发芽率/%
胚轴长度/mm 胚根长度/mm
第1天 第2天 第3天
0 (对照) 21.11c 98.00a 100.00a 6.75a 19.69a
50 42.22a 92.27a 93.33a 6.19a 16.59a
100 38.89a 94.53a 96.67a 6.73a 11.13b
200 32.22b 93.74a 95.56a 5.23a 6.84 c
　　不同的小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。下图同此。
Cd2+胁迫第1天, 50、100和200 μmol·L-¹Cd2+
胁迫的发芽率显著高于对照; 第2天, 3种处理的发
芽率与对照无显著差异, 各组分的发芽率均达到
了90%以上; 第3天, 对照的发芽率达到100%, Cd2+
胁迫的发芽率与对照无显著差异。以上结果表明,
Cd2+胁迫对不结球白菜种子发芽率的影响不显
著。Cd2+胁迫第3天, 各组分的胚轴长度无显著差
异, 而50、100和200 μmol·L-1 Cd2+胁迫的胚根长度
分别比对照降低了15.74%、43.47%和65.26%, 其
中, 100和200 μmol·L-1 Cd2+胁迫的胚根长度与对照
差异达到显著水平, 200 μmol·L-1 Cd2+胁迫的胚根
生长受到了严重抑制(图1和表2)。据此, 本研究的
后续实验Cd2+胁迫浓度均选用0、25、50和100
μmol·L-1。
张琳等: 镉胁迫对不结球白菜Vc合成L-半乳糖途径基因表达及抗氧化系统的影响 1103
2 不同浓度镉胁迫对白菜AsA和总AsA含量的影响
如图2-A所示, 与对照相比, Cd2+胁迫的AsA含
量总体保持先升高后降低的趋势。25、50和100
μmol·L-1 Cd2+胁迫的AsA含量分别在6、12和6 h达
到峰值而后降低。Cd2+胁迫6 h时, 各处理的AsA含
量均随Cd2+浓度增加急剧升高且显著高于对照水
平, 其中, 100 μmol·L-1 Cd2+胁迫的AsA含量显著高
于其他Cd 2+胁迫水平。Cd 2+胁迫12~48 h , 25
μmol·L-1 Cd2+胁迫的AsA含量显著低于其他三种
处理。50 μmol·L-1 Cd2+胁迫6~12 h的AsA含量均
显著高于对照, 24 h时, AsA含量与对照差异不显
著。Cd2+胁迫至48 h, 各处理的AsA含量均显著低
于对照。
如图2-B所示, 与对照相比, Cd2+胁迫6~24 h,
25 μmol·L-1 Cd2+胁迫的总AsA含量始终低于对照
水平。50 μmol·L-1 Cd2+胁迫12 h, 总AsA含量显著
高于对照, 胁迫24 h, 总AsA含量又降低显著低于
对照水平。100 μmol·L-1 Cd2+胁迫6~12 h, 总AsA含
量均显著高于对照, 24 h时, 总AsA含量高于对照
但未达到差异显著水平。最终Cd2+胁迫48 h时, 各
处理的总AsA含量与对照差异均不显著。
3 不同浓度镉胁迫对白菜L-半乳糖途径相关基因
表达的影响
外界环境条件通过影响植物AsA合成途径相
关基因的表达进而影响AsA的积累。L-半乳糖途
径是以D-果糖-6-磷酸为起始原料, 经6-磷酸甘露
糖异构酶(PMI)催化形成D-甘露糖-6-磷酸, D-甘露
糖-6-磷酸由甘露糖磷酸转移酶(PMM)催化形成D-
甘露糖-1-磷酸, D-甘露糖-1-磷酸在GDP-D-甘露糖
焦磷酸化酶(GMP)的作用下, 与一个分子的三磷酸
鸟苷(GTP)反应生成GDP-D-甘露糖, GDP-D-甘露
糖可通过GDP-D-甘露糖3,5-差向异构酶(GME)的
作用形成GDP-L-半乳糖, GDP-L-半乳糖经GDP-L-
半乳糖磷酸化酶(GGP)的催化形成L-半乳糖-1-磷
酸, L-半乳糖-1-磷酸在L-半乳糖-1-磷酸酶(GPP)的
作用下脱去磷酸基团, 形成L-半乳糖, 再经L-半乳
糖脱氢酶(L-GDH)的作用, 生成L-半乳糖-1,4-内酯,
L-半乳糖-1,4-内酯在L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶
(L-GLDH)的作用下最终生成AsA。
如图3所示, 大多数基因的表达趋势均是上调
达到峰值后, 随胁迫时间延长又逐渐下调, 与AsA
含量的变化基本一致。与对照相比, 25 μmol·L-1
Cd2+胁迫的8个基因表达量始终处于较低水平, 与
AsA含量结果一致。不同浓度Cd2+胁迫下各个基
因表达量达到峰值的时间有所不同。其中 ,
PMM、GMP、GPP、GalDH和GalLDH对100
μmol·L-1的Cd2+胁迫响应较为迅速, 在Cd2+胁迫6 h
达到峰值; PMI和GGP对50 μmol·L-1 Cd2+胁迫较为
敏感, 在Cd2+胁迫12 h达到峰值; GME在Cd2+胁迫
过程中的变化趋势比较复杂, 6 h时, 各处理的GME
表达量差异不显著, 12 h时, 25和50 μmol·L-1 Cd2+
胁迫的GME表达量显著低于对照水平 , 而100
图2 镉胁迫对不结球白菜叶片AsA和T-AsA含量的影响
Fig.2 Effects of Cd2+ stress on the contents of AsA and total AsA in non-heading Chinese cabbage leaves
不同的小写字母表示同一时间不同处理间差异显著(P<0.05)。下图同此。
植物生理学报1104
图3 镉胁迫对不结球白菜叶片L-半乳糖途径相关基因相对表达量的影响
Fig.3 Effects of Cd2+ stress on relative expression of genes involved in the L-galactose pathway in non-heading Chinese cabbage leaves
张琳等: 镉胁迫对不结球白菜Vc合成L-半乳糖途径基因表达及抗氧化系统的影响 1105
μmol·L-1 Cd2+胁迫的基因表达量显著高于对照水
平; 24 h时, 50和100 μmol·L-1 Cd2+胁迫的基因表达
量显著高于对照, 25 μmol·L-1 Cd2+胁迫的基因表达
趋势与其相反; 至48 h Cd2+胁迫结束时, 25、50和
100 μmol·L-1 Cd2+胁迫的GME表达量均显著低于对
照水平。表明Cd2+胁迫通过影响AsA合成途径相
关基因的表达从而影响AsA含量的积累。
4 不同浓度镉胁迫对白菜抗氧化防御系统的影响
4.1 不结球白菜中Cd2+含量的积累
不同浓度Cd2+胁迫下不结球白菜的地上部和
根部Cd2+含量差异显著(表3), Cd2+胁迫5 d时, 25、
50和100 μmol·L-1 Cd2+胁迫的根部Cd2+ 含量分别为
地上部的4.09倍、4.00倍和3.97倍; Cd2+ 胁迫10 d
时, 25、50和100 μmol·L-1 Cd2+ 胁迫的地上部Cd2+
含量分别为根部的0.26倍、0.26倍和0.27倍。由此
可知, Cd2+主要积累在不结球白菜的根系中, 经过
长时间、高浓度的胁迫后, 叶片也会积累一定的
Cd2+, 地上部和根部Cd2+含量均随Cd2+胁迫浓度的
增加以及Cd2+胁迫时间的延长而积累。
4.2 不结球白菜中SOD、POD、CAT和APX活性
变化
如图4所示, Cd2+胁迫5 d时, 与对照相比, 各处
理的SOD活性显著升高; Cd2+胁迫10 d时, 各处理
的SOD活性降低显著低于对照水平, 25、50和100
μmol·L-1 Cd2+胁迫的SOD活性分别比对照降低了
36.23%、46.78%和79.20%。Cd2+胁迫5 d时, 各浓
度处理的POD活性显著低于对照水平; Cd2+胁迫
后10 d时, 各浓度处理的POD活性与对照无显著
差异。
胁迫5 d时, 50和100 μmol·L-1 Cd2+胁迫的CAT
活性降低显著低于对照; 至Cd2+胁迫10 d时, 25
μmol·L-1 Cd2+胁迫的CAT活性显著高于对照, 而50
和100 μmol·L-1 Cd2+胁迫处理则与对照差异不显
著。Cd2+胁迫5 d时, 除25 μmol·L-1 Cd2+胁迫外, 其
余Cd2+胁迫的APX活性与对照均无显著差异; Cd2+
表3 镉胁迫对不结球白菜幼苗Cd2+含量的影响
Table 3 Effects of Cd2+ stress on Cd2+ contents of
non-heading Chinese cabbage seedling
Cd2+ 浓度/
地上部Cd2+含量/ 根部Cd2+含量/
μg·g-1 (DW) μg·g-1 (DW)
μmol·L-1
5 d 10 d 5 d 10 d
0 — — — —
25 108.9c 223.7c 445.1c 863.5c
50 217.3b 298.4b 869.5b 1 158.2b
100 267.8a 357.1a 1 063.2a 1 329.8a
　　—: 表示没有检测到。
图4 镉胁迫对不结球白菜叶片SOD、POD、CAT和APX活性的影响
Fig.4 Effects of Cd2+ stress on enzymatic activities of SOD, POD, CAT and APX in non-heading Chinese cabbage leaves
植物生理学报1106
胁迫10 d时, 除50 μmol·L-1 Cd2+胁迫外, 其余Cd2+胁
迫处理与对照APX活性差异也均不显著。
Cd2+胁迫后5 d时, SOD在抗氧化酶系统中起
主要的防御功能, 至Cd2+胁迫10 d时, POD、CAT和
APX清除活性氧的效率要相对高于SOD。表明抗
氧化酶系统在清除活性氧的过程中协同作用, 在
Cd2+胁迫的不同时期起主导作用的抗氧化酶也会
发生变化, 这可能与幼苗叶片中不同时期的Cd2+含
量积累有关(表3)。
4.3 不结球白菜中丙二醛和叶绿素含量变化
图5-A显示, Cd2+胁迫5 d时, 丙二醛含量显著
升高, 且随浓度增加而升高, 25、50和100 μmol·L-1
Cd2+胁迫的叶片丙二醛含量分别比对照升高了
23%、41%和164%。之后随着胁迫时间延长, 丙
二醛含量持续升高。Cd2+胁迫10 d时, 25、50和
100 μmol·L-1 Cd2+ 胁迫的叶片丙二醛含量分别比对
照升高了23%、129%和155%。
如图5-B所示, Cd2+胁迫5 d时, 100 μmol·L-1
Cd2+胁迫的叶绿素含量显著高于对照和其他处理,
25和50 μmol·L-1 Cd2+胁迫的叶绿素含量与对照差
异均不显著。Cd 2+胁迫10 d时 , 25、50和100
μmol·L-1 Cd2+胁迫的叶绿素含量均显著低于对照
水平。表明幼叶光合色素合成在不同程度上受到
了Cd2+胁迫的影响, 随着Cd2+胁迫浓度的升高以及
胁迫时间的延长, 叶绿体受到的损伤加剧, 叶绿素
含量逐渐降低。
讨　　论
Cd2+是植物非必需元素, Cd2+进入植物体内并
积累到一定程度, 植物就会表现出毒害症状, 如生
长迟缓、植株矮小、褪绿、产量下降等。重金属
对植物的伤害首先表现在幼苗的根部(杨居荣和黄
翌1994), 与本文研究结果相一致(图1、表2和3)。
本研究发现, Cd2+对不结球白菜胚芽和胚根长度的
抑制随着Cd2+浓度升高而增加(图1和表2), 表明
Cd2+对胚根生长的抑制和毒害具有明显的累积作
用, 这与韩宝贺等(2014)的研究相一致。
本研究表明, Cd2+胁迫通过影响AsA合成L-半
乳糖途径相关基因的表达从而影响AsA的积累, 与
Ren等(2013)研究结果一致。L-半乳糖途径中不同
基因在不同浓度Cd2+胁迫下基因表达量达到峰值
的时间不同, 同一基因在不同浓度Cd2+胁迫下表达
量亦存在显著差异(图3)。Cd2+胁迫后, AsA生物合
成途径中8个关键基因的表达量都发生了不同程
度的变化, 表明植物对AsA合成的调节是个协同的
过程, 同时也表明L-半乳糖途径相关基因对Cd2+胁
迫的响应是一个复杂的过程。
前人研究发现, 植物在一定的低温、干旱、
缺镁和重金属胁迫下, 依赖于抗坏血酸的H2O2清
除酶的活性增加(Suzuki等2001), AsA含量会持续
或者短暂升高, AsA在植物细胞中维持较高的还原
型对氧化型的比率(AsA/DHA)对清除细胞内ROS
非常重要(Mittler 2002)。由于胁迫条件下ROS的
变化趋势不同, 作为清除过量ROS的抗氧化剂 ,
AsA也会随着ROS的变化而变化(Massot 2012)。
植株遭受Cd2+胁迫后, 体内的抗氧化防御系统被激
活, AsA是植物抗氧化防御系统的重要组成部分,
因此植物表现出短时间内AsA含量显著升高, 而随
图5 镉胁迫对不结球白菜叶片丙二醛和叶绿素含量的影响
Fig.5 Effects of Cd2+ stress on the contents of MDA and chlorophyll in non-heading Chinese cabbage leaves
张琳等: 镉胁迫对不结球白菜Vc合成L-半乳糖途径基因表达及抗氧化系统的影响 1107
着胁迫时间延长, 植物受到的氧化损伤超出了自
身的调控能力范围, 因而抗坏血酸含量不再继续
升高, 植株表现出受到损伤。本文中, Cd2+ 胁迫对
不结球白菜造成了不同程度的氧化损伤, 与对照
相比, Cd2+胁迫的叶片AsA含量短时间内(6 h)升高
后又降低且显著低于对照水平, 与前人研究结果
一致。
植物体内存在着一套负责清除活性氧产生的
抗氧化系统。在植物正常情况下, 植物体内抗氧
化系统使活性氧的产生和清除处于动态平衡状态
(尹永强等2007), 在Cd2+胁迫下, 植物体内游离态
Cd2+增加, 间接产生活性氧自由基, 导致细胞抗氧
化防御系统平衡失调, 造成氧化压力, 影响植物生
理生化活动, 阻碍植物生长发育(Gallgo等1996)。
活性氧随着Cd2+胁迫浓度的增加及Cd2+胁迫时
间的延长而积累并激发抗氧化防御反应 (Ann
2010)。
低浓度Cd2+胁迫下, 蔬菜体内抗氧化酶活性呈
上升趋势, 当Cd2+浓度达到或超过一定范围后, 活
性氧清除酶的活性则会降低, 这可能是由于低浓
度的Cd2+胁迫后, 植物对Cd2+胁迫产生了应激反应,
使根系活力上升, 植株利用过氧化物酶等自身防
御系统清除了低浓度Cd2+对其产生的损伤。此外,
段昌群等(1992)认为低剂量、短时间的重金属胁
迫可以提高或加速植物的某些生理生化反应, 而
大剂量的镉则会对植物产生强烈的毒性。
Cd2+胁迫能够引起不结球白菜体内活性氧代
谢紊乱, 且Cd2+浓度越高, 胁迫时间越长, 对质膜选
择透性、组成、结构和生理生化等的伤害越大
(Gallgo等1996)。有研究表明, 不同物种之间, Cd2+
胁迫引起的抗氧化系统酶活性变化有所不同, 在
转BjCAT3基因过量表达的转基因烟草中, CAT在
清除活性氧过程中起主导作用(Guan等2009), 而大
蒜苗的抗氧化酶系统中SOD和POD的作用则超过
了CAT (Zhang等2005)。本研究中Cd2+胁迫5 d后,
Cd2+胁迫的SOD活性显著高于对照, POD活性显著
降低, CAT和APX活性变化差异不显著, 此时SOD
起主要的抗氧化防御功能。Cd2+胁迫10 d时, SOD
活性均显著低于对照水平, POD、CAT和APX清除
活性氧的效率要相对高于SOD, 与前人研究结果
一致。
植物在逆境环境下, 细胞膜中的不饱和脂肪
酸会在活性氧自由基的攻击下发生过氧化作用而
生成MDA, 从而造成细胞质膜损伤, 导致细胞质膜
的选择性功能受到破坏, 细胞内电解质大量外渗,
因此植物中MDA含量的变化可以反映细胞膜脂过
氧化作用的强弱及细胞质膜的变性程度(胡晓辉
2009)。研究表明, Cd2+ 浓度越高, 幼苗根组织中的
MDA含量越高, 细胞膜脂过氧化作用越强, 幼苗受
到的毒害作用越大(徐劼等2014), 与本文研究结果
一致。有研究认为, Cd2+ 胁迫会导致植物叶片细胞
的叶绿体结构受损, 降低植物叶片中光合色素含
量(Drazic和Mihailovic 2005)及光合电子传递速率,
因而导致叶绿素的生物合成受阻。在重金属胁迫
环境下, 植物叶绿素含量下降, 光合作用减弱, 进
一步影响植物的新陈代谢活动(徐劼等2014)。
Sanita di Toppi和Gabbrielli (1999)的研究表明, 叶
绿体合成、光合作用等植物生理过程受低剂量的
Cd2+ 影响而失调。Cd2+胁迫下植物细胞中活性氧
增加, 参与了对叶绿素的降解(Liang和Arthur 1992)
或直接破坏了叶绿体微结构, 使得叶绿素含量降
低, 与本文研究结果一致(图5)。
本研究结果表明, Cd2+胁迫诱导活性氧产生从
而导致膜脂过氧化是Cd2+毒害不结球白菜的重要
机制之一。AsA含量、SOD活性以及MDA含量对
Cd2+胁迫的敏感性高于其他几项指标, 因此, 本研
究推测, 不结球白菜幼苗叶片的AsA含量、SOD活
性以及MDA含量可以对土壤Cd2+污染起到早期指
示作用。
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