免费文献传递   相关文献

NO 参与γ- 氨基丁酸促进白三叶种子的萌发过程



全 文 :植物生理学通讯 第 44卷 第 6期,2008年 12月 1071
NO参与 γ-氨基丁酸促进白三叶种子的萌发过程
李杰, 窦晓月, 车永梅, 刘新 *
青岛农业大学生命科学学院, 山东青岛 266109
提要: 白三叶种子用不同浓度 γ-氨基丁酸(GABA)处理后, 低浓度GABA处理的白三叶种子萌发速率和一氧化氮(NO)含量
显著提高; NO清除剂 cPTIO和硝酸还原酶(NR)抑制剂叠氮钠(NaN3)显著抑制GABA促进的白三叶种子萌发过程, 而一氧
化氮合酶(NOS)抑制剂 L-NAME对GABA促进白三叶种子萌发的影响不显著。据此推测, GABA促进白三叶种子萌发过
程中可能有NO参与, 并且NO的产生主要依赖于硝酸还原酶途径。
关键词: 一氧化氮; γ-氨基丁酸; 白三叶; 种子萌发
Nitric Oxide Involved in Seed Germination of Trifolium repens L. Promoted by
γ-Aminobutyric Acid
LI Jie, DOU Xiao-Yue, CHE Yong-Mei, LIU Xin*
College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: After treatment with different concentrations (0.1, 1 and 10 µmol·L-1) of γ-aminobutyric acid (GABA),
the germination rate and NO content of Trifolium repens seed with low concentration of GABA were improved.
The promotive effect of GABA on seed germination of T. repens were inhibited by a specific NO scavenger
cPTIO and an nitrate reductase (NR) inhibitor NaN3, but the nitric oxide synthase (NOS) inhibitor L-NAME had
little effect. It was presumed that NO involved in T. repens seed germination promoted by GABA, and NO
mainly came from NR pathway.
Key words: NO; γ-aminobutyric acid; Trifolium repens; seed germination
收稿 2008-07-21 修定 2008-10-29
资助 山东省教育厅基金 ( J 0 4 C 1 3 )和国家自然科学基金
(3 0 3 70 1 4 1 )。
* 通讯作者(E-mail: liuxin6080@yahoo.com.cn; Tel: 0532-
8 8 0 3 0 2 2 4 )。
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一
种广泛存在于原核生物和真核生物中的四碳非蛋
白氨基酸, 各种植物以及植物的各个器官中都有存
在。研究表明, GABA可作为一种信号物质参与植
物生长发育及逆境适应等生理过程的调控。如
GABA参与拟南芥花粉管的生长过程(Yu等2006);
能延缓水稻植株的衰老(Ansari等2005); 可诱导石
竹属植物繁缕植株 A C C 合酶基因的表达
(Kathiresan等 1998); 还能促进盐胁迫下玉米种子
的萌发(田小磊等 2005)。但目前GABA调控植物
生长发育过程中的下游信使及其信号转导机制还
不清楚。
一氧化氮(nitric oxide, NO)也是植物体内重要
的信号分子, 参与光形态建成、种子萌发和休眠、
气孔运动及胁迫响应等生理过程的调节。许多研
究表明, NO可以与植物激素、H2O2等信号分子相
互作用影响植物的生长发育。如, NO参与调节盐
胁迫诱导的玉米幼苗叶片中脱落酸(abscisic acid,
ABA)的积累(陈康等 2006); 介导茉莉酸(jasmonic
acid, JA)、乙烯(ethylene, ETH)和ABA诱导的气
孔运动过程(Liu等2005; 李杰等2007; Garcia-Mata
和 Lamattina 2007); 参与调节番茄根中生长素
(indoleacetic acid, IAA)的合成(Molina-Favero等
2008)。NO还可以作为H2O2的下游信使诱导柳枝
稷种子的萌发(Sarath等 2007)。作为细胞内的重
要信使, NO与GABA之间是否相互作用还未见报
道。为此, 本文以白三叶种子为材料, 研究GABA
对白三叶种子萌发的影响以及NO在GABA调控白
三叶种子萌发中的作用, 为探明GABA的作用机制
建立基础。
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 44卷 第 6期,2008年 12月1072
材料与方法
选择籽粒饱满的白三叶(Trifolium repens L., 又
称白车轴草)种子, 经 0.1% HgCl2消毒 3 min, 再用
蒸馏水冲洗 3 次。然后分别用以下处理液处理:
0.1、1、10 µmol·L-1 GABA, 200 µmol·L-1 cPTIO
[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-
1-oxyl-3-oxide potassium salt], 100 µmol·L-1 Nω -硝
基 -L-精氨酸 -甲基酯 (Nω nitro-L-arginine methyl
ester hydrochloride, L-NAME), 10 µmol·L-1 NaN3,
GABA分别与 cPTIO、L-NAME、NaN3混合液
(GABA、cPTIO、L-NAME、NaN3的终浓度分
别为 0.1、200、100和 10 µmol·L-1), 均以蒸馏水
处理为对照, 各处理液浓度根据相关文献(田小磊等
2005; Yu等 2006)及预试确定。GABA、cPTIO、
L-NAME均购自 Sigma公司; NaN3为国产分析纯。
取消过毒的白三叶种子播于铺有 4层定性滤
纸的培养皿内, 分别加入上述不同的处理液。每处
理设 3个重复, 每重复 100粒种子, 在 25 ℃下暗催
芽。催芽期间用处理液冲洗种子, 以保持处理液浓
度基本不变和维持一定的湿度, 并于 9 h后开始记
录发芽率, 每 2 h记录一次, 直到 19 h为止。以胚
根突破种皮 2 mm为萌发。发芽率(%)=萌发的种
子数 /供试种子数 ×100%。
采用试剂盒法测定NO含量。取 0.1 g处理过
的白三叶种子加 0.9 mL 0.9% NaCl研磨成匀浆;
12 000×g离心10 min, 取上清液, 于沸水浴中3 min;
12 000×g离心 5 min, 取上清液, 稀释 10倍, 并参考
试剂盒说明进行测定(试剂盒购自南京建成生物工
程研究所), 每处理重复 3次。
采用DPS统计软件对平均数用Duncan’s新复
极方差进行多重比较
实验结果
1 GABA对白三叶种子发芽率的影响
由图1可知, GABA处理和未作处理的白三叶
种子在 19 h时萌发基本完成, 0.1和 1 µmol·L-1
GABA处理的白三叶种子, 萌发速率显著加快, 13 h
和 15 h时发芽率比未作处理的分别提高 36.9%、
16.4%和 33.3%、12.8% (P<0.05); 10 µmol·L-1
GABA对白三叶种子萌发的促进作用不显著(P>
0.05)。表明低浓度外源GABA显著促进白三叶种
子萌发, 提高萌发速率, 缩短萌发进程。
2 GABA对白三叶种子萌发过程中内源NO含量
的影响
图2表明, 未作处理的白三叶种子萌发过程中
NO含量略有增加。GABA处理的白三叶种子萌发
过程中NO含量显著升高, 在 15 h 时NO含量达到
高峰(P<0.01)。表明, GABA处理能显著增加种子
萌发过程中的 NO含量。
3 NO清除剂 cPTIO对GABA促进白三叶种子萌
发的影响
图 3显示, 0.1 µmol·L-1 GABA能显著提高白
三叶种子的萌发速率, NO清除剂 cPTIO处理的白
三叶种子发芽率与未作处理的相比稍有降低(P>
0.05); cPTIO和GABA共处理时, 白三叶种子发
芽率比GABA单独处理的显著降低(P<0.05), 13 h
和 15 h时发芽率分别降低 32.7%和 19.7%。表明,
GABA促进白三叶种子萌发过程中可能有NO的参
与。
图 1 不同浓度GABA对促进白三叶种子萌发的影响
Fig.1 Effect of different concertrations of GABA on seed
gernination of T. repens
图 2 GABA对白三叶种子萌发过程中NO含量的影响
Fig.2 Effect of GABA on NO content of T. repens
in seed germination
植物生理学通讯 第 44卷 第 6期,2008年 12月 1073
4 NO合成抑制剂L-NAME和NaN3对GABA促进
白三叶种子萌发的影响
L-NAME是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,
NOS)的抑制剂。 与未作处理的相比, 100 µmol·L-1
L-NAME处理对白三叶种子萌发的影响不显著; L-
NAME和 GABA共处理的白三叶种子发芽率较
GABA处理的稍有降低(图4)。 NaN3是硝酸还原酶
(nitrate reductase, NR)的非专一性抑制剂。NaN3
能稍微降低白三叶种子的萌发速率; NaN3和GABA
共处理的白三叶种子发芽率较GABA单独处理的显
著降低(P<0.05), 13 h和 15 h时发芽率分别降低
29.6%和 25.2% (图 5)。
育及逆境适应等多种生理过程。Shelp等(2006)报
道, 低浓度GABA可通过质膜受体或吸收系统参与
对花粉管生长的调控。Kinnersley和 Lin (2000)发
现, 将浮萍(Lemna minor)放在含有GABA的介质中
培育, 浮萍体内矿物质元素含量随GABA浓度的增
大而增加; Kathiresan等(1998)以不同浓度的GABA
处理繁缕(Stellaria longipes)后, 发现外施低浓度的
GABA能显著促进繁缕的生长。本文结果表明, 低
浓度外源GABA能显著提高白三叶种子的萌发速
率, 并以 0.1 µmol·L-1 GABA的作用最显著。
NO是植物体内广泛存在的信号分子, 参与植
物体内多种生理过程的信号转导。C a r o 和
Puntarulo (1999)的研究表明, 大豆种子萌发过程中
NO含量随萌发进程上升, 说明NO参与大豆种子的
萌发过程。在GABA 促进白三叶种子的萌发过程
中有无NO参与?NO与GABA之间有无相互作
用?本文研究GABA对白三叶种子萌发过程中内源
NO含量的影响及cPTIO和GABA共处理对白三叶
种子萌发影响的结果表明, GABA显著增加萌发的
白三叶种子中 NO含量; 而 NO清除剂 cPTIO和
GABA共处理后, GABA促进白三叶萌发的作用被
显著抑制, 表明NO参与外源GABA促进白三叶种
子萌发过程, 并且NO位于GABA的下游。同时还
表明未作处理的白三叶种子萌发后期NO含量稍有
增加, 200 µmol·L-1 cPTIO 处理的白三叶种子萌发
速率与未作处理的有所降低, 表明在其自然萌发过
程NO有一定作用, 但对此还需进一步研究证实。
植物细胞中NO主要是由依赖于硝酸盐 /亚硝
讨  论
已有研究表明, GABA参与调节植物的生长发
图 5 NaN3对GABA促进白三叶种子萌发的影响
Fig.5 Effect of NaN3 on seed germination of T. repens
promoted by GABA
图 3 cPTIO对GABA促进白三叶种子萌发的影响
Fig.3 Effect of cPTIO on seed germination of T. repens
promoted by GABA
图 4 L-NAME对GABA促进白三叶种子萌发的影响
Fig.4 Effect of L-NAME on seed germination of T. repens
promoted by GABA
植物生理学通讯 第 44卷 第 6期,2008年 12月1074
酸盐途径和依赖于 L-精氨酸途径产生。其中前者
的关键酶主要是胞质的NR及根部特异性的亚硝酸
盐NO还原酶(nitrite NO reductase, Ni-NOR); 后者
相应的关键酶可能包括类NOS, 且在许多植物组织
及细胞器中亦检测到其活性( B e s s on - B a r d 等
2008)。此外, 近期有研究报道, 植物细胞中可能
还存在依赖多胺(polyamines, PAs)的NO合成途径,
但目前尚未鉴定出其中起关键作用的酶(Yamasaki
和 Chohen 2006)。Garcia和 Lamattina (2003)的研
究表明, 由NR途径产生的NO可介导ABA诱导拟
南芥的气孔关闭过程; Liu等(2007)的研究表明, 在
JA诱导蚕豆气孔关闭的过程中有NO的参与, 并且
NO的产生主要依赖于 NR途径。本文研究表明,
NOS抑制剂L-NAME和GABA共处理, 对GABA促
进白三叶种子萌发的抑制作用不显著; 而NR抑制
剂NaN3能显著抑制GABA对白三叶种子萌发的促
进作用, 结合前述GABA显著增加萌发白三叶种子
中 NO 含量的实验结果, 可以推测 NO 参与外源
GABA促进的白三叶种子萌发过程, 它可能是主要
通过 NR 途径产生。
至于GABA促进种子萌发与NO信使的关系及
GABA促进种子萌发过程中NO是否通过NR途径
还需进一步探讨, GABA促进种子萌发的信号转导
过程中的其它信号组分以及下游靶蛋白或受体也有
待进一步阐明。NO在植物中的生物效应和信号
转导机制已有大量研究, 但NO合成的NR途径及
NOS途径所需的条件和调节机制仍不清楚, 还需用
生物化学和分子生物学手段进一步研究。
参考文献
陈康, 李杰, 唐静, 赵方贵, 刘新(2006). 一氧化氮参与调节盐胁迫
诱导的玉米幼苗脱落酸积累. 植物生理与分子生物学学报,
32 (5): 577~582
李杰, 邱丽艳, 赵方贵, 侯丽霞, 刘新(2007). 一氧化氮在乙烯诱
导蚕豆气孔关闭中的作用. 植物生理与分子生物学学报, 33
(4): 349~353
田小磊, 吴晓岚, 李云, 张蜀秋(2005). 盐胁迫条件下 γ-氨基丁酸
对玉米幼苗 SO D、POD 及 CAT 活性的影响. 实验生物学
报, 38 (1): 75~79
Ansari MI, Lee RH, Chen SCG (2005). A novel senescence-
associated gene encoding γ-aminobutyric acid (GABA): pyru-
vate transaminase is upregulated during rice leaf senescence.
Physiol Plant, 123: 1~8
Besson-Bard A, Pugin A, Wendehenne D (2008). New insights
into nitric oxide signaling in plants. Annu Rev Plant Biol,
59: 21~39
Garcia-Mata C, Lamattina L (2003). Abscisic acid, nitric oxide
and stomatal closure-is nitrate reductase one of the missing
links? Trends Plant Sci, 8 (1): 20~26
Garcia-Mata C, Lamattina L (2007). Abscisic acid (ABA) inhibits
light-induced stomatal opening through calcium- and nitric
oxide-mediated signaling pathways. Nitric Oxide, 17 (3~4):
143~151
Caro A, Puntarulo S (1999). Nitric oxide generation by soybean
embryonic axes. Possible effect on mitochondrial function.
Free Radic Res, 31: 205~212
Kathiresan A, Miranda J, Chinnappa CC, Reid DM (1998). γ-
aminobutyric acid promotes stem elongation in Stellaria
longipes: the role of ethylene. Plant Growth Regul, 26:
131~137
Kinnersley AM, Lin F (2000). Receptor modifiers indicate that
4-aminobutyric acid (GABA) is a potential modulator of ion
transport in plants. Plant Growth Regul, 32: 65~76
Liu X, Shi WL , Zhang SQ, Lou CH (2005). Nitric oxide involved
in signal transduction of jasmonic acid-induced stomatal clo-
sure of Vicia faba L.. Chinese Sci Bull, 50 (6): 520~525
Liu X, Wang YQ, Jia WS, Lou CH, Zhang SQ (2007). Localiza-
tion of NOS-like protein in guard cells of Vicia faba L. and
its possible function. Chinese Sci Bull, 52 (1): 84~90
Molina-Favero C, Creus CM, Simontacchi M, Puntarulo S,
Lamattina L (2008). Aerobic nitr ic oxide production by
Azospirillum brasilense Sp245 and its influence on root
architecture in tomato. Mol Plant Microbe Interact, 21 (7):
1001~1009
Sarath G, Hou G, Baird LM, Mitchell RB (2007). Reactive oxy-
gen species, ABA and nitric oxide interactions on the germi-
nation of warm-season C4-grasses. Planta, 226 (3): 697~708
Shelp BJ, Bown AW, Fa u re D (2 00 6 ). Ext ra cel lu la r γ -
aminobutyrate mediates communication between plants and
other organisms. Plant Physiol, 142 (4): 1350~1352
Yamasaki H, Cohen MF (2006). NO signal at the crossroads:
polyamine-induced nitric oxide synthesis in plants? Trends
Plant Sci, 11: 522~524
Yu G, Liang J, He Z, Sun M (2006). Quantum dot-mediated detec-
tion of γ-aminobutyric acid binding sites on the surface of
living pollen protoplasts in tobacco. Chem Biol, 13 (7):
723~731