全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 985
一种同步观察喜树碱与菌根丛枝结构的方法
赵昕 1,2, 谢国恩 2, 宋瑞清 1,3, 阎秀峰 2,*
1黑龙江省林业科学院, 哈尔滨 150081; 东北林业大学 2生命科学学院, 3林学院, 哈尔滨 150040
A Method to Synchronously Observe the Mycorrhizal Structure and
Camptothecin of the Roots in Camptotheca acuminata Decne Seedlings
ZHAO Xin1,2, XIE Guo-En2, SONG Rui-Qing1,3, YAN Xiu-Feng2,*
1Heilongjiang Academy of Forestry, Harbin 150081, China; 2College of Life Sciences, 3College of Forestry, Northeast Forestry
University, Harbin 150040, China
提要: 本文介绍一种用激光共聚焦扫描显微镜同步观察喜树碱、丛枝菌根及其结构的方法。喜树丛枝菌根经甘油浸润和
明胶包埋后制成切片, 再经酸性品红染色后在激光共聚焦扫描显微镜下观察。波长488 nm处激发光下可获得清晰的丛枝
菌根透射图像, 364 nm处激发光下可获得喜树碱的荧光图像, 通过两图像的叠加, 在喜树丛枝菌根中得到喜树碱的定位图
像。用此方法初步研究了喜树丛枝菌根的喜树碱分布。
关键词: 喜树碱; 丛枝菌根; 冰冻切片; 激光共聚焦扫描显微镜
收稿 2008-08-25 修定 2008-09-22
资助 国家自然科学基金(30 7 71 6 9 9)、黑龙江省自然科学基
金(C2 0 07 0 4)和黑龙江省博士后基金。
* 通讯作者(E -m a i l : x fy a n @m a i l . h l . c n; T el : 0 4 5 1 -
8 2 1 9 0 0 5 2 )。
喜树碱是我国特有树种喜树中含有的一种重
要次生代谢产物, 因其具有良好的抗肿瘤活性而受
到广泛关注(Yan等 2003)。喜树碱经紫外光激发
具有发出强蓝色荧光的特性(Li等2002), 据此人们
已经对两年生和三年生喜树幼叶和幼枝中的喜树碱
进行了组织细胞化学定位研究(Pasqua等 2004; 刘
文哲和王自芬 2004)。
丛枝菌根是自然界中分布最为广泛的一类菌
根, 它是由陆生植物根和接合菌纲的真菌共生发育
而成(Strack等 2003), 自然界中约有 90%的维管植
物都能形成丛枝菌根(刘润进和李晓林 2000)。丛
枝菌根真菌在植物根系皮层细胞内和细胞间形成菌
丝体, 并且在侵入的根系皮层细胞内菌丝连续二分
叉形成树枝状或花椰菜状结构, 即所谓的丛枝结
构。丛枝菌根负责进行菌根真菌和宿主植物之间
的物质交换, 将矿质营养尤其是磷素和水分提供给
植物, 而植物则向真菌转运碳水化合物。许多研究
已经观察到丛枝菌根真菌与植物次生代谢的相关
性, 丛枝菌根真菌能够直接或间接地影响植物的次
生代谢过程(赵昕和阎秀峰 2006)。喜树幼苗形成
丛枝菌根后, 能显著促进根中喜树碱的积累(赵昕等
2006)。为此, 我们以喜树丛枝菌根为试材, 用激光
共聚焦扫描显微镜, 结合冰冻切片技术和原位细胞
化学技术, 从组织细胞水平上探讨喜树碱代谢与丛
枝菌根的关系。
材料与方法
1 材料
喜树(Camptotheca acuminata Decne)幼苗参照
赵昕等(2006)的实验方法培养并接种丛枝菌根真
菌。喜树幼苗栽植于直径 20 cm、高 20 cm的
花盆中培养, 每盆 1株, 盆中基质为土壤与河沙的
混合物(体积比 3:1, 过 2 mm筛, 混合后于 121 ℃下
灭菌2 h), 有机质含量为2.41%、全氮含量为0.052%、
全磷含量为 0.025%、全钾含量为 1.03%、碱解
氮含量为 56 .67 mg·kg - 1、速效磷含量为 2 .5 0
mg·kg-1、速效钾含量为 104.94 mg·kg-1, pH 6.59。
接种含有蜜色无梗囊霉(Acaulospora mellea Spain
& Schenck)孢子的菌土, 均匀层播于土表下喜树幼
苗根部, 接种剂量为 30 g·盆 -1, 孢子密度为 19个 ·g-1
(干土)。接种 45 d后采集喜树幼苗根部进行切片
观察。
2 方法
2.1 前处理 取喜树鲜根洗净擦干后迅速切成1 cm
左右的小段, 并立即将根段投入质量分数15%甘油
(W/W)中, 置于冰盒内浸泡 30 min。将根段同冰盒
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一起置于DZF-6020真空干燥箱内, 用 2XQ-2型旋
片式真空泵抽气20 min (20 ℃, -0.08 MPa), 使喜树
根空腔完全被甘油填充, 取出后于-4 ℃冰箱中放
置 3 h。
2.2 冷台上固定样品 在冷台表面滴加明胶包埋剂
( 1 0 % 明胶 , 2 % 甘油 , W / W ) , 铺匀后置于
LeicaCM1900冰冻切片机内, 启动切片机快速降温
至-24 ℃。待包埋剂冷冻成形后, 用冷刀将包埋
剂表面削平。将前处理后的根段表面甘油吸净, 把
根段细切成 0.6 cm后垂直平放于冷台上, 再滴加
包埋剂封好材料, 冷冻固定。
2.3 冰冻切片 把粘附有根段的冷台固定在切片机
的机头, 并旋紧螺丝固定, 将切片厚度调到 60 µm,
摇动旋转手轮进行切片。在切片的过程中, 如冷刀
上的霜层较厚, 应及时启动除霜程序去除切片上的
霜层, 以防卷片。
2.4 展片 切片被切下后, 可用毛笔将切片转移到冷
却的载玻片上, 滴加数滴预冷的蒸馏水将切片展
开。也可直接将载玻片以合适的角度靠近切片, 使
切片自然吸附在载玻片上, 然后置于机箱外室温中
展开, 该展片方法往往更为简便适用。
2.5 染色 将切片放入0.01%酸性品红(W/V, 0.01%
酸性品红溶于乳酸、甘油、蒸馏水的等体积混合
液)染色液中常温染色 14 h。
2.6 制片 用蒸馏水清洗切片以去除染液和明胶包
埋剂, 在载玻片上滴加甘油, 放置切片并加盖盖玻
片, 长期保存则以指甲油封片。
2.7 显微镜观察 用Axioskop2 plus荧光显微镜观察
切片并拍照。用 Zeiss LSM510激光共聚焦扫描显
微镜分别以波长 488 nm和 364 nm的激光照射切
片。用于图像采集的显微镜物镜为 Fluar 20倍和
A-plan 40倍物镜, 数值孔径(NA)分别为 0.75和 0.5,
显微聚焦旋钮由步进马达控制, 图像存为1 024×1 024
像素类型, ZOOM设为1.0, 扫描所用的激发光强度
为 3 8 %。
结果与讨论
1 丛枝结构的观察
通过图 1可以观察到喜树菌根中的丛枝结构
呈明显的花椰菜状, 它是丛枝菌根真菌侵入到植物
根系皮层细胞内或细胞间, 由真菌的菌丝连续二分
叉形成的。通常菌根中丛枝结构的显微观察需要
对样品进行固定和透明处理(通常以乙醇固定, 以氢
氧化钾溶液热浸透明)并染色(Vierheilig等2005), 而
这些过程将起到 “洗涤 ”作用, 往往会影响菌根内
待测化合物的准确观测。如要对丛枝菌根进行直
接观察, 通常的方法虽然能最大限度地保持菌根的
完整性, 但只适合少数具有透明细根的植物如烟草
等(Vierheilig等2001), 不适合多数植物包括喜树丛
枝菌根侵染率及形态学方面的研究。为此, 我们通
过大量的实验, 摸索出了观察喜树丛枝菌根的方法:
不用乙醇固定, 不进行强碱透明, 而是直接将喜树
丛枝菌根经甘油浸润、明胶包埋后制成切片, 再经
低浓度酸性品红常温染色即可观察(图1), 此方法不
但可以清晰观察到丛枝结构, 而且减小了对菌根的
破坏, 有利于喜树碱的荧光观察。
2 喜树丛枝菌根自发荧光观察
用激光共聚焦扫描显微镜分别以波长488 nm
和 364 nm的激光照射切片, 488 nm激发光下可获
得清晰的丛枝菌根透射图像(图 2-b), 364 nm激发
光下能够获得喜树碱的荧光图像(图2-c), 通过两图
像的叠加, 得到喜树碱在喜树丛枝菌根中的定位图
像(图 2-d)。通过图 2可以清楚观察到菌根细胞中
的丛枝结构, 以及发出蓝色荧光的喜树碱。
刘文哲和王自芬(2004)以 360 nm UV作为激
发光, 通过荧光显微镜检测了腺毛和分泌道所产生
分泌物的蓝绿色自发荧光, 与喜树碱结晶的颜色一
致。Pasqua等(2004)也以 365 nm UV作为激发
光检测了喜树根、茎和叶片中喜树碱的自发荧
光。同样, 本研究也观察到喜树丛枝菌根细胞内
具有蓝色的自发荧光(图 2-c), 与喜树碱标准品在
激光共聚焦扫描显微镜下观察的颜色(图 2-a)一
致。在根细胞内的菌丝、丛枝和泡囊均观察到
较强的蓝色自发荧光(图 3)。以往的实验表明, 丛
枝菌根有助于提高喜树根中喜树碱的含量(赵昕等
2006), 可见喜树碱易于在共生界面积累。
Ames等(1982)曾用落射荧光显微镜(420~490
nm激发光)观察到了丛枝菌根的自发荧光现象, 认
为菌根中的自发荧光是来自丛枝结构。然而随后
的研究表明, 这些自发荧光是消亡的丛枝结构所发
出的, 而具有代谢活性的菌根(包括菌丝、丛枝和
泡囊)则无自发荧光现象(Vierheilig等 2005)。本实
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图 1 喜树丛枝菌根中细胞内菌丝 -H和丛枝 -A的显微观察
Bar=30 µm。
图 2 喜树菌根细胞的荧光显微观察
a: 喜树碱标准品荧光图; b: 喜树丛枝菌根结构图(透射图像); c: 喜树碱的分布图(荧光图像); d: 叠合图。Bar=30 µm。
图 3 喜树菌根细胞内菌丝 -H、丛枝 -A和泡囊 -V的荧光显微观察
a: 菌丝; b: 丛枝; c: 泡囊。Bar=30 µm。
验方法采用的是 364 nm激光激发样品, 即使是消
亡的丛枝结构也观察不到荧光。此外, 实验所用生
物染料酸性品红在364 nm激发光下也无荧光现象。
综上所述, 文中方法是可以实现丛枝结构与喜
树碱同步观察的, 既可以观察清晰的菌根细胞结构,
同时也可以观察菌根细胞内次生代谢物质喜树碱的
分布, 从而为喜树碱在菌根组织细胞内的荧光分析
建立了行之有效的技术。
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月988
参考文献
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