免费文献传递   相关文献

GUS 基因在梨转化植株中的稳定表达



全 文 :植物生理学通讯 第 44卷 第 3期,2008年 6月 465
GUS基因在梨转化植株中的稳定表达
孙清荣 1,*,孙洪雁 1,赵衍 2,HAMMOND Rosemarie2,DAVIS Robert2
1山东省果树研究所,山东泰安 271000;2美国农业部百思维尔农业研究中心植物分子病理实验室,马里兰 20705,美

提要:以获得的梨转GUS基因植株的试管苗为试材,转基因植株的叶片在含卡那霉素的再生培养基上可成功再生不定
梢,这些不定梢在含卡那霉素的生根培养基上可诱导生根。再生不定梢经组织化学检测仍表现出GUS基因的表达。而非
转基因植株的叶片在含卡那霉素的再生培养基上不能产生不定梢,显示外源基因在转基因植株中的表达在无性繁殖后代
中是稳定遗传的。
关键词:梨;转基因植株;GUS基因;稳定表达
Stable Expression of an Introduced Exogenous GUS Gene in Transgenic Plant-
lets of Pear (Pyrus communis L.)
SUN Qing-Rong1,*, SUN Hong-Yan1, ZHAO Yan2, HAMMOND Rosemarie2, DAVIS Robert2
1Shandong Institute of Pomology, Taian, Shandong 271000, China; 2Molecular Plant Pathology Laboratory, USDA-Agriculture
Research Service, Beltsville, MD 20705, U. S. A.
Abstract: Pear (Pyrus communis) transgenic plantlets which were introduced exogenous GUS gene were se-
lected as materials. Adventitious shoots were obtained from leaves of transgenic plantlets under kanamycin
selection and transgenic shoots were rooted. Histochemical assay showed the expression of GUS gene in regen-
erated shoots of transgenic plants and no GUS gene expression in regenerated shoots from non-transgenic
control. The results confirm that the expression of foreign gene into transgenic pear plants is stable during the
clonal propagation.
Key words: pear; transgenic plant; GUS gene; stable expression
收稿 2008-02-29 修定 2008-05-07
资助 山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(0 1D S4 8)。
* E-ma i l:qi ngr ongs u n@ hot ma i l . co m;T e l:0 5 3 8 -
8282059
外源基因在转基因植株中不能稳定表达,甚
至完全不表达是一个较为普遍的现象(李旭刚等
1998)。因此,外源基因在转基因植株中的表达
问题越来越受到重视。尤其是作物转基因的研究
进展较快,如转 Bt杀虫蛋白基因油菜(林良斌等
2002)、转 Cecropin B基因水稻(华志华等 1999)、
转 Bt基因玉米(刘宗华等 2003)等都证明转入基因
可在后代中稳定表达。但在果树转基因研究中,
大多仍停留在转基因植株的获得。基于外源基因
在转基因梨的无性繁殖后代中的稳定表达尚未见报
道,本文探讨外源基因GUS转入梨染色体组后在
转基因梨的无性繁殖后代中是否能稳定表达。
材料与方法
以AtSUC2韧皮部特异表达启动子驱动GUS
基因的转基因梨 ‘Old Home’ (Pyrus communis L.)
(孙清荣等 2008)的无菌苗为试材,于MM (MS+1
mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 IBA)+50 mg·L-1卡那霉素
(Km)的培养基上保存和增殖。
分别从转基因植株和非转基因植株摘取刚展
开幼嫩叶片,接种在含 10和 25 mg·L-1 Km的不
定梢诱导培养基上,评价在Km筛选条件下转基
因植株叶片的再生能力。
参照Jefferson (1987)的GUS染色法对转基因株
系叶片再生的不定梢进行GUS基因稳定表达分析。
在附加 0、5、10、25 mg·L-1 Km的生根培
养基上观察Km对转基因植株生根的影响,培养
30 d后计算生根率。
实验结果
1 Km存在下转基因植株叶片的不定梢再生潜力
为了证明转基因植株在无性繁殖后代中其转
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期,2008年 6月466
入的外源基因是否能稳定表达,调查转基因植株
叶片在含Km的不定梢诱导培养基上的不定梢再生
潜力的结果表明:转基因植株的叶片比非转基因
的表现对Km有较高的抗性。接种在含 10 mg·L-1
Km的不定梢诱导培养基上,转基因植株的叶片
仍保持绿色,在切伤处产生大量愈伤组织,并产
生较高的不定梢再生率(图 1-a),达 52.8%;当附
加 25 mg·L-1 Km时,转基因植株的叶片仍有部分
是绿色,切伤处产生少量愈伤组织(图 1-b),但
没有不定梢再生。而非转基因植株的叶片,不抗
Km,在附加 10 mg·L-1 Km的诱导培养基上,叶
片变浅绿或白化,没有愈伤组织和不定芽的形
成,最后死亡(图 1-c) ;而在不加Km的诱导培养
基上叶片不定梢再生率达 100% (图 1-d)。
2 转基因植株叶片再生不定梢的组织化学分析
GUS染色的结果表明:转入的外源GUS 基
因在转基因植株的叶片再生不定梢的无性繁殖后代
中能稳定表达(图 2-a、b),而非转基因植株叶片
图 2 转基因植株和非转基因植株叶片再生不定梢GUS稳定表达的组织化学分析
Fig.2 Histochemical analysis of GUS expression in adventitious shoots from leaves of transgenic and non-transgenic plants
a 和 b:转基因植株叶片再生不定梢;c:非转基因植株叶片再生不定梢。
图 1 转基因植株和非转基因植株叶片在含Km诱导培养基上的不定梢再生
Fig.1 Shoot regeneration from leaf explants of transgenic plants and non-transgenic plants on induction medium containing Km
a 和 b:转基因植株叶片。a:Km 为 1 0 mg· L -1;b:Km 为 2 5 mg· L -1。c 和 d:非转基因植株叶片。c:Km 为 1 0 mg· L -1;
d:Km 为 0 mg· L -1。
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期,2008年 6月 467
再生不定梢没有GUS活性(图2-c)。这表明AtSUC2
启动下的外源基因结合到梨转基因植株的基因组
中,通过无性繁殖保存并传递给后代。
3 Km存在下转基因株系的生根能力
Km选择压存在下,转基因植株的生根能力
比非转基因的植株明显提高(表 1)。在生根培养基
上附加 5或 10 mg·L-1 Km不影响转基因植株的生
根率,其生根率和在不加Km生根培养基上的生
根率几乎相同。但Km却影响根的伸长,在不加
Km的生根培养基上转基因植株可形成很长的根(图
3-a),而在低浓度的 5 mg·L-1 Km下,根较粗、较
短,延长培养时间也不能促使根伸长(图 3-b)。当
附加 25 mg·L-1 Km时,转基因植株的生根率大大
下降,仅为 42.6%,且根更短(图 3-c),但根短
并不影响移栽成活率(资料未列出)。而非转基因
植株在含5 mg·L-1 Km的生根培养基上不能生根(图
3-d)。这说明Km选择压对转基因植株生根生长的
影响大于对转基因植株增殖生长的影响,因为转
基因株系在附加 25 mg·L-1 Km的MM上增殖与非
转基因株系在MM上的增殖生长相似(资料未列
出)。
讨  论
梨转基因植株叶片在Km选择压下,不定梢
再生成功,获得的外源GUS基因在再生的不定梢
中稳定表达,说明外源基因在转基因植株的无性
繁殖后代中是遗传的,这和已有报道中的转基因
油菜种子后代中分离出Km抗性植株并在这些抗性
植株中检测到了Bt杀虫蛋白基因表达的结果(林良
斌等 2002)相类似。在 Km选择压下,转基因植
株的生根能力及其叶片不定梢再生能力都明显提
高,但不定梢再生率低于未转基因植株在不加
Km的培养基上的再生率(Sun等 2005)。生根培养
基中附加 5或 10 mg·L-1 Km不影响转基因植株的
生根率,但影响根的发育,抑制根的伸长。这
表明转基因植株获得的外源基因的卡那霉素抗性水
平有一定程度的抗性,而超过一定浓度即不再表
现出抗性。植物的不同组织类型对抗生素的敏感
性不同,Bornhoff等(2005)报道葡萄胚性组织对
Km非常敏感,10 mg·L-1就可使其致死,而胚和
发芽胚能耐受 50~100 mg·L-1 Km。本文中,转
基因的梨植株的不同组织对Km的敏感性也不同,
根比叶更敏感。
转基因植株的叶片再生不定梢不是所有芽梢
都表现出 GUS染色,其可能的原因有二:一是
因为 AtSUC2是拟南芥蔗糖-H+协同运输蛋白基因
启动子,在源叶中高度表达,而在库中不表达(张
凌云和张大鹏 2003),即本文中表现的充分成长的
芽梢组织中检测到较强的GUS活性(光合作用制造
糖并运输到活跃生长部位),而在幼嫩芽梢组织中
检测不到GUS活性(幼嫩组织需要糖的输入来支持
其活跃的生长),这与已报道的转基因草莓中获得
表 1 不同Km水平对转基因植株生根率的影响
Table 1 Effect of Km on rooting of pear transgenic lines
%

株系
Km浓度 /mg·L-1
0 5 1 0 25
非转基因植株 95.8 0 0 0
转 GUS基因植株 95.6 95.6 95.1 42.6
图 3 Km对转基因植株和非转基因植株生根的影响
Fig.3 Effects of Km on rooting of transgenic and non-transgenic plants
a~c:转基因植株。a:0 mg·L-1 Km;b:5 mg·L-1 Km;c:25 mg·L-1 Km。d:非转基因植株(5 mg·L-1 Km)。
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期,2008年 6月468
的结果(Zhao等 2004)一致;二是转基因的植株是嵌
合体。
参考文献
华志华, 汪晓玲, 薛锐, 高振宇, 黄大年(1999). Cecropin B转基因
水稻及其后代抗白叶枯病研究初报. 中国水稻科学, 13 (2):
114~116
李旭刚, 谢迎秋, 朱祯(1998). 外源基因在转基因植物中的失活.
生物技术通报, (3): 1~8
林良斌, 官春云, 周小云, 何业华, 杨志新(2002). 转基因抗虫油
菜中 Bt杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究. 作
物学报, 28 (2): 175~178
刘宗华, 汤继华, 李宝健, 范云六, 李桂玲, 季良越, 陈伟程(2003).
玉米转 Bt基因自交系的抗玉米螟特性鉴定初报. 作物学报,
29 (4): 621~625
孙清荣, 孙洪雁, 赵衍, Hammond R, Davis R (2008). 梨韧皮部特
异表达启动子AtSUC2驱动下的GUS基因的转化和表达. 园
艺学报, (4): 487~492
张凌云, 张大鹏(2003). 光合同化物韧皮部卸载途径和机制. 植
物生理学通讯, 39 (4): 399~403
Bornhoff BA, Harst M, Zyprian E, Topfer R (2005). Transgenic
plants of Vitis vinifera cv. Seyval blanc. Plant Cell Rep, 24:
433~438
Jefferson RA (1987). Assaying chimeric genes in plants: the GUS
gene fusion system. Plant Mol Biol Rep, 5: 387~405
Sun Q, Davis RE, Zhao Y (2005). High frequency regeneration of
plantlets from leaf explants of commercial pear (Pyrus com-
munis L.) cultivars ‘Onward’ and ‘Old Home’. In Vitro, 41:
P-20 58
Zhao Y, Liu Q, Davis RE (2004). Transgene expression in straw-
berries driven by a heterologous phloem-specific promoter.
Plant Cell Rep, 23: 224~230