全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月 489
小麦组织培养后代的醇溶蛋白和SSR位点的遗传变异
张志清* 郑有良** 魏育明 颜泽洪 刘虹 王际睿 彭学莲
四川农业大学小麦研究所，四川都江堰 611830
Genetic Variations on Gliadin Alleles and SSR Loci among Regenerated Plants
and Seeds of Wheat (Triticum aestivum L.) from Tissue Culture
ZHANG Zhi-Qing*, ZHENG You-Liang**, WEI Yu-Ming, YAN Ze-Hong, LIU Hong, WANG Ji-Rui, PENG Xue-Lian
Triticeae Research Institute, Sichuan Agricultural University, Dujiangyan, Sichuan 611830, China
提要 以酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(APAGE)和简单重复序列(SSR)标记分别检测 40 个通过组织培养获得单株收获的种子
和 23 个再生植株的 DNA，结果表明，5 株‘98-1266’和 2 株‘80-8’在 APAGE 分析中出现位点缺失，迁移率增大，并
出现新带。在 34 个小麦 SSR 位点中，WMS18、WMS264、WMS328、Xgdm67、Xgdm98 等 5 个位点有变化。单株发生变
化的是 ‘80-8’-8、‘ 川麦 32’-1、‘ 川麦 32’-7、‘ 川育 12’-1、‘Y1496’-3 和 ‘Y1496’-6。说明在组织培养过程中体细胞无性系变
异广泛存在。APAGE 技术和 SSR 标记均可用来检测这种变异。
关键词 小麦；组织培养；酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(APAGE) ；醇溶蛋白；SSR 标记；遗传变异
收稿 2006-01-16 修定　 2006-05-07
资助　 四川省科技厅应用基础项目(2002A008)和四川省教育
厅重点项目(03JY029-028-2863)。
　 * 现工作单位：四川农业大学分析测试中心(E-mail:
zqzhang721@163.com, Tel: 0835-2882281)。
** 通讯作者(E-mail: grmb@sicau.edu.cn, Tel: 0835-2882336)。
小麦(Triticum aestivum L.)组织培养过程中由
于生长调节物质和培养条件等理化因素的影响，
在分化过程中常常会发生染色体结构和数量的变
异，其中一些变异是可遗传的，即体细胞无性系
变异(somatic variation, SV)。无性系变异既有单
一性状变异，又有 2 个或多个性状同时变异。前
者变异频率高，后代在个别性状上发生变异，基
本上保持原品种特性，稳定速度快，育种周期
短，是改良优良品种单一缺点的有效手段之一；
后者可产生丰富的变异群体，从而作为育种工作
中的一种变异体来源，从中筛选出综合性状优良
的品种(Cooper 和 Sears 1986; Larkin 和 Rvan
1984)。近年来，许多研究者对小麦体细胞无性
系在形态特征、穗部性状、产量构成因子等性状
以及在容重、粒重、蛋白质含量、面团形成时
间、SDS 沉淀值等品质性状方面的变异进行了深
入的研究(高明尉等1994；梁竹青1995；张怀刚
等1997，1998；叶兴国等1998；胡尚连等1998；
孙岩等1999)。在鉴定小麦无性系变异中常用的手
段是田间农艺性状考察、分子标记差异分析、染
色体核型带型分析等，其中，鉴定醇溶蛋白是一
种快速、简单的手段。目前，国内外比较通用
的鉴定分析小麦醇溶蛋白的方法是酸性聚丙烯酰胺
凝胶电泳(acid polyacrylamide gel eletrophoresis,
APAGE)技术，虽然该项技术已应用于小麦种子纯
度鉴定、种质资源遗传多样性、1B/1R 易位系鉴
定、品种差异分析等研究领域中(Zillam和Bushuk
1979; 张学勇等1995)，而用于检测体细胞无性系
变异的报道还相对较少。另外，分子标记技术可
直接用于检测样品中 DNA 水平的差异，简单重复
序列(simple sequence repeat, SSR)标记或称微卫星
(microsatellite)由于在小麦基因组中多态性极高，
且有染色体组特异性，相对于RFLP (restriction
fragment length polymorphism)、RAPD (random
amplified polymorphic DNA)等标记而言，有操作
简单、稳定性高和花费小等优点(Lee 等 1995；
Röder等 1995)，因此，已成为目前研究小麦最有
效的分子标记技术之一(Plaschke等1995；Peng等
1999；景蕊莲和昌小平 1999；Prasad 等 2000；
崔国惠等 1999)。
本文用APAGE技术和 SSR标记研究获得的40
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月490
个组织培养株系的醇溶蛋白位点和 SSR 位点是否
发生遗传变异，以及变异特点，同时结合田间农
艺性状考察，筛选变异材料，以期为小麦育种的
研究提供参考。
材料与方法
使用International Seed Testing Association
(ISTA)于 1986年颁布的标准程序，对 40株组织
培养小麦(Triticum aestivum L.)单株收获的种子进
行醇溶蛋白位点分析，每个单株分别随机选取 1
粒种子用于检测。小麦品种(系)来源有 ‘ 川育
12 ’、‘ 异源 2 号 ’、‘ 川农 16 ’、‘80-8 ’、‘ 川育
16 ’、‘Y1496 ’、‘98-1266 ’、‘ 川麦 32 ’。以未
经组织培养的相应品种在正季收获的种子为对
照。所有材料均由小麦研究所转基因研究室提
供。
SSR 检测用 CTAB 法提取 23 个组织培养单株
总 DNA。共 34 个 SS R 引物：EM P- I、g- g l i、
W M S 1 2 0 、W M S 5 1 2 、W M S 1 0 8 、W M S 1 4 9 、
W M S 1 5 4 、W M S 1 5 7 、W M S 1 6 4 、W M S 1 8 、
W M S 1 8 6 、W M S 1 9 0 、W M S 1 9 4 、W M S 2 4 、
W M S 2 6 4 、W M S 2 8 2 、W M S 3 2 5 、W M S 3 2 8 、
W M S 3 7 4 、W M S 4 3 、W M S 4 6 、W M S 4 8 0 、
W M S 4 8 4 、W M S 5 、W M S 5 2 、W M S 5 4 4 、
W M S 5 7 0 、W M S 6 0 、W M S 6 0 1 、W M S 8 2 、
Xgdm126、Xgdm129、Xgdm67、Xgdm98 由北
京赛百胜公司合成，引物序列及在小麦染色体上
的定位见文献(Röder等1995, 1998; Plaschke等
1995; Pestsova等 2000)。扩增反应用PTC220型
热循环仪(MJ 公司生产)。
PCR 反应参照Röder 等(1995)的方法，并稍
加改动。反应总体积25 mL，其中含1 U Taq DNA
聚合酶(TaKaRa公司)、1× 缓冲液、1.5 mmol·L-1
MgCl2、200 mmol·L-1 dNTPs、65 ng引物和50~100
ng 模板 DNA。扩增前 94℃预变性 4 min；然后
在94℃中变性1 min，55或60℃ (视引物而定)退
火 1 min，72℃延伸 2 min，扩增 40 个循环；最
后，在 72℃延伸 10 min。扩增产物中加适量上
样缓冲液后点样，在含0.5% EB和 3.0%的琼脂糖
凝胶中以 1×TAE 缓冲液为介质，100 V 稳压电泳
2 h。BIO-RAD 凝胶成像系统拍照、记录。
实验结果
1 组织培养再生植株醇溶蛋白位点变异
为了避免由于种子不纯造成的实验误差，每
个材料选取正季收获的种子3粒作为对照材料进行
纯度鉴定，取 3 粒种子的 APAGE 电泳图谱一致的
材料作为对照材料并与组织培养材料的种子醇溶蛋
白进行对比分析的结果表明，在 8 个四川小麦品
种(系)的 40粒再生单株收获的种子中，有2个品
种部分单株种子的醇溶蛋白位点发生了变异。这
2个基因型分别是 ‘98-1266’ 和 ‘ 异源2号 ’。‘98-
1266’在12个单株中有5株的醇溶蛋白与未经组织
培养的相应品种比较有差异(图1)，表现为5粒种
子在 w区迁移率最小的 2 条带缺失，特别是 ‘98-
1266’-7 (图1中3号样品)在a区有1条迁移率较大
的新带出现。‘ 异源2号 ’ 的8个组织培养单株中
有 2 个单株的醇溶蛋白位点有差异，发生变异的
区域是 a区和 b区，主要表现在这两个区出现了
一些新的迁移率较大的条带，其中 a 区 2 条，b
区2条(图2)。在测试的40个再生单株的收获种子
中，有 7 粒种子的醇溶蛋白位点与未经组织培养
图1 小麦‘98-1266’组织培养再生
单株醇溶蛋白位点变异
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的相应品种相比有差异，可能是组织培养的过程
中由于激素、培养条件等一些理化因子的影响所
致。
2 组织培养再生植株SSR位点变异
在用于检测的34个 SSR引物中，有5个引物
扩增的产物在部分品种的一些组织培养再生单株
中表现出差异性，这些引物分别是 WMS 1 8、
W M S 2 6 4、W M S 3 2 8、X g d m 6 7、X g d m 9 8，它
们在小麦染色体上的定位分别是 4 B S 、3 B S 、
2 A L 、7 D L 、6 D L 。其具体变异表现为：在
WMS18 位点上，组织培养再生单株 ‘80-8’-8 明显
地缺少了主带(图 3-a) ；这个单株的WMS264位点
上，其扩增片段比对照少了 1 条片段较大的条带
(图 3-b)。在 WMS328 位点上，‘ 川麦32’ -1 也少
了 1 条迁移率最小的带，同时出现了 1 条迁移率
较大的弱带(图 3-c) ；用 Xgdm67引物对这些材料
扩增时，在 ‘ 川麦32’-7中出现了1个新的扩增片
段，其长度较大(图 3-d)。在不同的品种上发生
了位点变异的 SSR 标记是 Xgdm98，其变异表现
图2 小麦‘异源2号’ 组织培养再生
单株醇溶蛋白位点变异
图3 小麦组织培养再生植株SSR位点的变异
　　a:‘80-8’ 在 WMS18 位点的变异，由左至右为对照、‘80-8’-1、‘80-8’-3、‘80-8’-8、‘80-8’-9；b:‘80-8’ 在 WMS264 位点
的变异，由左至右为对照、‘80-8 ’-1、‘80-8 ’-3、‘80-8 ’-8、‘80-8 ’-9；c: ‘ 川麦 32 ’ 在 WMS328 位点的变异，由左至右为对
照、‘ 川麦 32 ’-1、‘ 川麦 32 ’-7、‘ 川麦 32 ’-8；d: ‘ 川麦 32 ’ 在 Xgdm67 位点的变异，由左至右为对照、‘ 川麦 32 ’-1、‘ 川麦
32’-7、‘ 川麦 32’-8；e:‘ 川育 12’ 在 Xgdm98 位点的变异，由左至右为对照、‘ 川育 12’-1、‘ 川育 12’-3；f:‘Y1496’ 在 Xgdm98
位点的变异，由左至右为对照、‘Y 1 4 9 6 ’- 1、‘Y 1 4 9 6 ’- 3、‘Y 1 4 9 6 ’- 6。
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为：(1)‘川育12’-1比 ‘川育12’-3少了1条迁移率
较小的带(图3-e) ；(2)在‘Y1496’-3和‘Y1496’-6中
都出现的1条迁移率略大于未经组织培养的相应品
种和 ‘Y1496’-1的扩增条带(图3-f)。
讨　　论
小麦组织培养过程中的体细胞无性系变异是
一种常见的现象。孙岩等(1999)检测小麦组织培
养种子和经辐射处理的组织培养种子醇溶蛋白的结
果表明，两者均有醇溶蛋白的变异，于是认为，
鉴定醇溶蛋白是一种快速鉴定体细胞无性系变异的
有效手段。我们对转基因受体系统中获得的40余
个组织培养再生单株，以 APAGE 检测醇溶蛋白位
点，以 SSR 检测 23 个单株的总 DNA，分别在生
化水平和 DNA 水平上检测到了这种变异的存在，
据此我们认为，SSR 标记在小麦中良好的稳定性
和重复性，可以作为鉴定变异的手段，其检测的
效率可随标记数的增加而提高。
近年来，许多研究者采用小麦体细胞无性系
变异与育种相结合的方法，获得了一些在形态变
异、农艺性状改良、品质指标发生变化的育种新
材料(张怀刚等1997，1998；叶兴国等1998；胡
尚连等1998；孙岩等1999)。本文中由于检测群
体较小，获得的变异材料不多，在 40 个种子中
仅有 7 粒存在变化，采用 SSR 标记虽然也检测到
了 7 株变异材料，但这些变异在小麦育种中的应
用价值还十分有限。尽管如此，我们仍然认为，
植物转基因再生植株经过分子检测后被确定为非转
化植株中也可能存在丰富的变异类型，如果用多
种遗传标记和田间性状考察方法鉴定这些材料中的
遗传变异，或许这些非转化植株可以得到有效利
用，也应予以重视。
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