全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月 187
小麦成熟胚高频植株再生系统的建立
丁莉萍 何光源*
华中科技大学中英HUST-RRes作物基因工程和基因组学联合实验室, 武汉 430074
提要 在研究小麦成熟种子不同预处理时间、不同种类和浓度生长调节物质、分化培养基中是否添加 CuSO4、不同外植
体类型和不同放置方式对小麦成熟胚愈伤组织诱导和分化的基础上，建立了一套高效、可靠、重复性好的小麦成熟胚高
频植株再生系统。以小麦成熟种子完整胚作为外植体的诱导频率为 100%; 除掉胚的原胚芽部位生长出的芽苗后，转分
化的分化频率达到 42.50%。
关键词 小麦; 成熟胚; 植株再生系统; 正交试验
High Frequency Plant Regeneration from Mature Embryo of Wheat Seeds
DING Li-Ping, HE Guang-Yuan*
China-UK HUST-RRes Crop Genetic Engineering and Genomics Jiont Laboratory, Huazhong University of Science & Technology,
Wuhan 430074
Abstract Factors which affected frequencies of the embryogenesis and plant regeneration were studied by
using wheat (Triticum aestivum) mature seeds in order to obtain a high frequency plant regeneration system.
The factors included different pretreatments of the seeds, different concentrations and kinds of hormones, whether
the medium added CuSO4 and different explants and different placements. The experimental results indicated
that the frequency of callus induction from wheat mature embryo was 100%, after removing the buds from the
original embryo and transferring them to regeneration medium, its frequency of plant regeneration was 42.50%.
Key words Triticum aestivum; mature embryo; plant regeneration system; orthogonal test
收稿 2003-09-29 修定 　 2004-01-15
资助　 国家重点基础研究发展计划“九七三”计划(2002-
CB111301)。
* 通讯作者(E-mail:hegy@hust.edu.cn)。
实践证明，利用植物基因工程改良小麦品
质，增强抗逆性等优良性状是一项受人关注的途
径。转化方法很多，但转化效率并不乐观。其
原因在于建立稳定的小麦再生体系较困难，而植
株的再生频率常是决定小麦遗传转化效率和成败
的关键[1]。且基因型的依赖性很强，只有少数几
种模式品种再生频率较高，一些农艺性状较好的
栽培品种往往因无法建立良好的再生体系而不能
使用。迄今，人们采用小麦幼胚、幼穗、成熟
胚、悬浮系以及原生质体进行离体培养均已获得
再生植株[2]。 从已有报道来看，认为幼胚是最有
效的用于小麦离体培养的转化受体[3]，但其常受
季节和时间的限制，难以重复试验。而小麦成
熟胚培养具有取材方便、方法简便、实验周期
短、一年四季可做、出愈率高、愈伤组织成长
快和一次成苗率高等优点[4]，可能有助于解决这
一问题。
本文以湖北省主栽品种鄂麦12为材料，在探
讨多种因素对小麦成熟胚植株再生的影响以及优化
小麦成熟胚组织培养条件的基础上，建立了小麦
成熟胚组织培养高频植株再生系统。
材料与方法
供试材料小麦(Triticum aestivum)品种鄂麦12
(EM12)，半冬性、高产、低品质，为湖北省主栽
品种。由湖北省农业科学院粮食作物研究所提供。
取颜色、大小一致的小麦成熟种子，置于适
量清水中，加数滴Tween80，搅拌 3~5 min，无
菌水洗涤1次，再加0.01% HgCl2 消毒 20 min左
右，以无菌水洗涤 3~5 次。放置在无菌、铺有吸
水海绵的平皿中，吸胀处理，露白后，在无菌条
件下将材料按不同接种方式接种于诱导培养基上。
通过混合水平的正交试验设计[5]，将生长调
节物质的种类和浓度、种子预处理时间、分化培
养基中添加CuSO4 对芽苗分化的影响组成 3个要
素，采用L16(8 × 28)正交表[5]，设计了16组平行
试验。每组处理至少 80 个外植体，进行正交试
验，筛选出以小麦成熟胚为外植体获得高频植株
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再生系统的条件，并在此基础上研究不同类型外
植体和不同放置方式对小麦成熟胚愈伤组织诱导和
分化的影响。因素与水平见表 1。
诱导培养基以MSS AA/2[6]为基本培养基，其
主要成分为：M S 培养基的大量元素，L 培养基
的微量元素，M S 培养基的铁盐及维生素，1 0 0
mg.L-1 肌醇，20 mL.L-1 3AA(谷氨酸胺、脯氨酸
和天冬酸胺)，30 g.L-1 蔗糖，8 g.L-1 琼脂，pH
5.7，添加 2 种不同的生长调节物质，即 4- 氨
基-3,5,6-三氯吡啶甲酸(picloram) 或2,4-二氯苯氧
乙酸 (2,4-D)，以促进愈伤组织的生长。
分化培养基为R[6] 培养基，另外添加5 mg.
L-1和0.01 mg.L-1 2,4-D，并研究加入分化培养基
中10 mmol.L-1 CuSO4 对植株再生的影响。
由成熟胚诱导而来的愈伤组织主要有两种，
我们认为其中一种来源于胚轴，另一种来源于胚
根。前一种愈伤组织多呈淡黄致密状(图 1)，有
较强的再生植株的能力；后一种愈伤组织则多为
白至灰色水浸状，基本上没有分化能力。每次
均挑取色鲜致密部分传代于相同的培养基上，在
(25 ± 1)℃下暗培养25~35 d 后，统计愈伤组织
数，计算愈伤组织诱导频率；继而转入分化培养
基中， (25±1)℃、光周期16 h光/8 h暗下培养
30 d(光照度1 500~2 000 lx)后，统计生根愈伤组
织数、出芽愈伤组织数以及再生植株数。
结果与讨论
1 不同因素对小麦成熟胚愈伤组织诱导与分化的
影响
据观察，以小麦成熟胚盾片为外植体接种
5~7 d后，开始形成愈伤组织，形态多为乳白色，
水浸状，随后愈伤组织继续长大，颗粒状明显，
颜色加深为乳黄色，形成团不很大，比幼胚愈伤
组织团小，转分化后 5 d 左右就有绿点出现。由
表 2 可见，以成熟胚盾片为外植体的诱导频率为
60.56%~98.00%，生根频率为 12.81%~60.78%，
绿苗频率为 10 . 6 4 % ~ 7 2 . 4 6 %，分化频率为
8.32%~33.60%。由统计分析(表 3)可知，各试验
因素对小麦成熟胚分化频率的影响程度为：A ＞
C＞ B。加入诱导培养基 MSS AA/2中的 picloram
和2,4-D，对小麦成熟胚愈伤组织的诱导分化都有
较好的作用， picloram的分化频率稍高于2,4-D。
以 P1.0和 D4.0为宜，分化频率都达到27%以上；
P2.0 和 D8.0，分化频率则在 10% 左右。这正如
方差分析[10]所表明的，因素A即生长调节物质的
种类和浓度对小麦成熟胚愈伤组织的诱导分化效果
差异显著(表 3)。由此可见，调节生长调节物质
的浓度对愈伤组织的诱导和分化十分重要。另
外，因素 B 和 C，即种子预处理时间和分化培养
基中添加 CuSO4 对愈伤组织诱导和分化的影响作
用较小，各水平间差异未达到显著水平(表 3)。
综上所述，我们认为获得到小麦品种鄂麦12
成熟胚高频植株再生系统的最佳组合为：成熟种子
在 26℃下预处理12 h，诱导培养基为MSSP1.0
(MSS AA/2 中添加生长调节物质 1.0 mg.L -1
picloram)，分化培养基中可以不添加 CuSO4。
2 外植体类型和放置方式对小麦成熟胚愈伤组织
诱导与分化的影响
以上述系统为基础，将成熟种子于26℃下预
处理 12 h 后，以 MSSP1.0 为诱导培养基，RKT
5.0 mg.L-1+0.01 mg.L-1 2,4-D为分化培养基，进一
步研究完整种子、胚处受伤的完整种子、离体完
整胚、盾片 4 种类型外植体和正放及反放方式对
小麦成熟种子愈伤组织诱导和分化的影响。结果
(表 4)表明，以离体完整胚作为外植体的，80 个
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

因素
水平
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ
A P0.5 P1.0 P1.5 P2.0 D2.0 D4.0 D6.0 D8.0
B H 12 H 24
C C + C -
因素A、B、C依次指不同种类和浓度的生长调节物质、种
子不同预处理时间和分化培养基中添加 CuSO4 对芽苗分化的影
响。其中， P0.5、P1.0、P1.5、P2.0分别表示浓度为0.5、1.0、
1.5、2.0 mg.L-1 picloram， D2.0、D4.0、D6.0、D8.0分别表
示浓度为 2.0、4.0、6.0、8.0 mg.L-1 2,4-D；H12 和 H24 为种子
在26℃下分别预处理12 和 24 h；C+ 和 C-分别表示分化培养基
中加和未加 CuSO 4 的情况。表 2 和 3 同此。
图1 小麦成熟胚诱导的胚性愈伤组织
Fig.1 Embryogenic calli from wheat mature embryo
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愈伤组织分化出的芽苗，我们先切除去部分种子
胚上原胚芽部位已长出的芽苗，然后将愈伤组织
转入分化培养基中，3 d 左右就有绿点产生，30
d再生成植株(图2)。另外，以完整种子和在胚处
受伤的完整种子分别接种，诱导 3~4 d 两者均开
始出现愈伤组织，且出愈率高(95%以上)，出愈效
果优于成熟胚盾片，多呈团状，较小，淡黄色，
表3 正交试验结果的统计分析
Table 3 The statistical analysis for the results of the
orthogonal test
因素 A B C
K 1 30.54 180.94 161.30
K 2 61.38 162.56 182.20
K 3 56.27
K 4 27.01
K 5 33.96
K 6 59.34
K 7 52.67
K 8 22.33
极差(R=Kmax-Kmin) 39.05 18.38 20.90
方差 897.15 21.11 27.30
F值 10.81* 1.55 2.30
表2 不同因素影响下小麦成熟胚愈伤组织诱导与分化的正交试验[L16(8×28)]
Table 2 Orthogonal analysis of the data abtained from the experiment of factor affecting on
callus induction and plant regeneration from wheat mature embryo cultures

试验编号
因素
诱导频率/%

生根频率/% 绿苗频率/% 分化频率/%
A B C
1 P0.5 H 12 C - 80.70 25.00 23.21 10.34
2 P0.5 H 24 C + 60.56 34.30 41.82 20.20
3 P1.0 H 12 C - 98.20 42.86 72.46 33.60
4 P1.0 H 24 C + 70.44 30.09 57.87 27.78
5 P1.5 H 12 C - 97.05 40.74 70.37 30.23
6 P1.5 H 24 C + 90.01 12.81 61.90 26.04
7 P2.0 H 12 C - 89.40 34.08 32.20 12.80
8 P2.0 H 24 C + 80.23 29.54 29.89 14.21
9 D2.0 H 12 C + 90.77 50.68 38.69 20.23
10 D2.0 H 24 C - 82.30 48.53 42.08 13.73
11 D4.0 H 12 C + 98.00 60.78 59.67 31.46
12 D4.0 H 24 C - 71.36 42.20 40.40 27.88
13 D6.0 H 12 C + 98.33 52.07 47.44 28.27
14 D6.0 H 24 C - 97.01 49.64 35.38 24.40
15 D8.0 H 12 C + 81.54 27.89 20.04 14.01
16 D8.0 H 24 C - 76.39 13.01 10.64 8.32
胚中有34个再生成植株，再生频率为42.50%，明
显比其它 3 种外植体的分化效果好。离体完整胚
接种于诱导培养基后，2~3 d左右开始出现愈伤组
织，5 d 内相继全部出现愈伤组织，形态多为淡
黄色，成团状，比幼胚愈伤组织大，胚性较好。
为了便于区分种子胚上原胚芽部位生长出的芽苗和
表4 外植体类型和放置方式对愈伤组织诱导分化的影响
Table 4 Effects of different explants and different placements
on callus induction and plant regeneration
外植体 放置方式 诱导愈伤 生根愈伤 绿苗愈伤 再生植株
组织数/个 组织数/个 组织数/个 数/个
完整种子 正放 40 4 6 1
反放 39 5 4 2
受伤种子 正放 38 11 9 4
反放 40 14 10 5
胚 正放 40 27 25 24
反放 40 11 13 10
盾片 正放 13 3 2 1
反放 27 15 12 8
接种的外植体均为40个。
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但诱导半个月左右，真菌污染严重，以至后期分
化频率低。此系统不宜用作高频率植株的再生。
另外，我们又作了这样的试验，即将完整种
子和胚处受伤过的完整种子按腹沟朝下(正放)和腹
沟朝上(反放)，离体完整胚按盾片向下、胚芽不
直接接触培养基(正放)和盾片向上、胚芽直接接
触培养基(反放)各两种方式进行接种。结果(表4)
显示，完整种子和胚处受伤过的完整种子接种
后，放置方式对愈伤组织诱导和分化无明显的影
响；离体完整胚的正放与反放对诱导频率也无明
显影响，正放比反放的分化频率高。这与柳建军
等[7]的结果一致。接种到诱导培养基上的盾片朝
下反放比朝上正放的愈伤组织诱导频率高，这可
能是盾片朝下反放时受伤部位容易吸收培养基中营
养，愈伤组织生长受到促进所致。
总之，植物遗传转化能否成功，建立良好的
植物受体系统十分重要。Cheng等[8]曾以小麦幼胚
作为转化受体，成功获得转基因植株。但迄今还
未见用小麦成熟胚为转化材料获得转基因植株的报
道。小麦成熟胚有良好的再生能力，以之作为转
化受体，可大大地缩短实验周期，比较容易获得
转基因植株[9]。影响小麦愈伤组织诱导和再生频
率的因素很多。如外植体的来源[10]、基因型[11]和
培养基[12]等。Özgen等[13]通过小麦成熟胚与幼胚比
较，研究基因型影响小麦成熟胚愈伤组织诱导再
生的结果表明，小麦成熟胚的组织培养效果比幼
胚好。Delporte等[14]认为用分子筛筛选直径小的成
熟胚为小麦转化受体的再生频率比未成熟胚的 高。
另外，继代培养、胚的接种方式、胚的不同放置
方式、成熟胚存放时间、干燥、光照和低温处理
均对小麦成熟胚愈伤组织诱导分化有影响[15]。本
文从诱导培养基中添加不同种类和浓度的生长调节
物质、小麦种子预处理时间、分化培养基中添加
Cu S O 4、不同外植体类型和不同放置方式着手，
探讨小麦成熟胚愈伤组织诱导分化的最佳条件，
建立了一套小麦鄂麦12成熟胚组织培养高频植株
再生系统。
此外，我们采用小麦成熟种子离体完整胚
为外植体的诱导频率达到 100%，分化频率达到
42.50%，比幼胚分化效果好。我们认为其原因有
二：(1) 成熟种子原胚芽部位的生长代谢影响了内
源激素的自身调节能力，当内源激素与添加的生
长调节物质之间的调节作用达到一定的平衡关系
时，愈伤组织即呈现出良好的分化状态；(2) 成熟
种子原胚芽部位的生长代谢物促进了胚轴细胞的脱
分化，继而提高了芽苗分化频率。据此我们认
为，小麦成熟胚可作为外植体用于小麦遗传转
化，其研究潜力可能是广阔的。
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图2 小麦成熟胚分化的苗
Fig.2 Buds regenerated from wheat mature embryo