全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 5期，2004 年 10 月604
转基因植物选择标记基因及其安全性问题
王永飞1,* 马三梅1 亦如瀚2
暨南大学1 生物工程学系，2 环境工程系，广州 510632
The Selectable Marker Genes in Transgenic Plant and Their Bio-safety
WANG Yong-Fei1,*, MA San-Mei1, YI Ru-Han2
1Department of Bioengineering, 2Department of Environment Bioengineering, Jinan University, Guangzhou 510632
提要 就目前使用的选择标记基因和提高选择标记基因安全性的策略进行了评述。
关键词 转基因植物；选择标记基因；生物安全性
收稿 2003-12-24 修定 　 2004-02-12
资助　 暨南大学引进人才启动基金(692017 和 692016)、广东
省重点科技攻关项目(2002A2070605)和广东省自然科
学基金(2000162)。
*E-mail:tmsm@jnu.edu.cn, Tel: 020-85228476
自从 1983 年世界上首次获得转基因植物以
来，植物转基因技术已得到了飞速的发展。目
前，全球抗虫、抗病、抗除草剂和品质改良等
的转基因植物已达120多种，2001 年的种植面积
已达5 260多万公顷[1]。在遗传转化过程中一般使
用选择标记基因来鉴别转化的细胞、组织或植
株。但随着转基因植物种类和种植面积的迅猛增
加，转基因植物中选择标记基因的生物安全性已
成为人们普遍关注的问题之一[2]。本文主要就目
前使用的选择标记基因和提高选择标记基因安全性
的策略作评述。
1 目前所使用的选择标记基因
在植物遗传转化所利用的表达载体中，除含
有目的基因和各种表达调控元件外，一般情况下
还插入了供选择用的标记基因[ 3 ]。经过遗传转
化，表达载体上所有的插入序列一同整合到受体
植物染色体基因组中。选择标记基因(selectable
marker gene)的主要功能是：此种基因的产物赋予
转化细胞产生一种选择压力，致使未转化的细胞
在施加选择剂条件下不能生长、发育和分化。而
转化细胞对该选择剂具有抗性，可以继续存活，
因而有利于从大量的细胞或组织中筛选出转化细胞
及植株[4]。此方法已成为植物遗传转化一种较为
方便、快捷的转基因植物鉴定方法[5]。
植物基因工程所应用的选择性标记基因都具
有以下4个特征[3]: (1)编码一种正常植物细胞中不
存在的产物，例如酶和蛋白质等；(2)基因较小，
易构成嵌合基因；(3)能在转化体中得到充分表
达；(4)容易检测，并能定量分析。早期研究中，
常用的选择标记基因主要有两大类[6]。一类是编
码抗生素抗性的基因，例如，新霉素磷酸转移酶
(neomycin phosphotransferase)基因Ⅱ(nptⅡ)、潮
霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase)基
因(hpt)和二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)
基因(dhfr)等；另一类是编码除草剂抗性的基因，
例如，草丁膦乙酰转移酶(phosphinothricin
acetyltransferase)基因(bar)、5-烯醇丙酮酰草酸-
3- 磷酸合成酶(5-enoylpyruvate shikimatr-3-
phosphate)基因(epsps)等。目前在转基因植物所使
用的抗性选择标记基因来源及其编码的基因产物和
使用的选择试剂见表 1。
2 选择标记基因的安全性问题
利用选择标记基因进行筛选确实为植物的遗
传转化提供了便利。但是，一旦完成筛选而得到
所需要的转化植株之后，选择标记基因就变成不
需要的和多余的，甚至是有害的[4]。选择标记基
因的潜在危险性主要包括以下几个方面：(1)转基
因作物本身可能变为杂草[10]; (2)选择标记基因通过
花粉和种子等途径在种群之间扩散，可能转移到
杂草，产生抗除草剂的“超级杂草”；或者向
其它植物中转移，从而对生态环境和生物多样性
产生潜在的危害[11]; (3)在健康领域，人们担心转
问题讨论Discussion
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表1 转基因植物早期研究中使用的主要选择标记基因[3~9]
基因 基因编码的产物 选择试剂 基因来源
npt II/aph II/ 新霉素磷酸转移酶II, 或称为 卡那霉素、新霉素、Geneticin(G418)、巴龙霉素、 大肠杆菌(Escherichia coli)、
neo 氨基葡萄糖苷磷酸转移酶II 氨基羟丁基卡那霉素 A(即 B B K 8 )、氨基葡萄糖苷 转座子 Tn5
bar/pat 草丁膦乙酰转移酶 草甘膦、草丁膦、双丙氨膦 链霉菌(Streptomyces hygro-
scopicus)、Stroptomyces virido-
chromogenes
bla b- 内酰氨酶 青霉素、氨苄青霉素 大肠杆菌
aadA 氨基葡萄糖苷腺苷转移酶 链霉素、壮观霉素 Shigella flexneri
hpt 潮霉素磷酸转移酶 潮霉素 B 大肠杆菌
nptⅢ 新霉素磷酸转移酶Ⅲ 氨基羟丁基卡那霉素 A(即 BB K 8 )、卡那霉素、新霉 Streptococcus faecalis的R质粒
素、Geneticin(G418)、巴龙霉素
epsps/aroA 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸 草甘膦 农杆菌 CP4(Agrobacterium
CP4)、玉米(Zea mays)、矮牵牛
(Petunis hybrida)
gox 草甘膦氧化还原酶 草甘膦 Achrombacter LBAA
bxn 溴苯腈水解酶 溴苯腈 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella
pneumoniae var. iozaenae)
als 乙酰乳糖合成酶 磺酰脲类除草剂、咪唑啉酮 拟南芥(Arabididopsis thaliana)、
烟草 (Nicotiana tabacum)、甘蓝
型油菜(Brassica napus)
cat 氯霉素乙酰转移酶 氯霉素 转座子 T n 9、噬菌体 P 1
tdc 色氨酸脱羧酶 4-甲基色氨酸 Catharaanthus roseus
uidA/gus b-葡糖苷酸酶 葡糖苷酸 大肠杆菌
nptⅠ 新霉素磷酸转移酶I 卡那霉素、新霉素、Geneticin(G418)、氨基葡萄糖苷 转座子 Tn 6 0 1、大肠杆菌
gent 庆大霉素乙酰转移酶 庆大霉素 细菌
strl/spc/spt 链霉素磷酸转移酶 链霉素 转座子 Tn5
dhfr 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 细菌质粒 pR67
基因食品的标记基因及其产物可能对人或动物健康
有害[8]; (4)标记基因可能被转移到人或动物肠道微
生物或上皮细胞，从而降低抗生素在临床治疗中
的有效性[12]。另外，由于转基因植物中标记基因
的存在，若要对该植物进行多次遗传操作则会受
到一定的限制[3]; 若标记基因与目的基因由同一启
动子驱动，还可能造成目的基因的失活[13 ]。目
前，虽然有的抗生素抗性基因如npt II已通过安
全性评价[14]，但还是不能彻底消除人们对转基因
植物的担忧，从而影响了大众对转基因植物的接
受。
3 提高标记基因安全性的策略
解决选择标记基因的生物安全性问题主要有3
种途径：一是利用无争议的生物安全标记基因；
二是在转化时仍使用标记基因，但获得转基因植
株后再将其去除；三是利用无选择标记基因的转
化系统。
3.1 利用无争议的生物安全标记基因 提高标记基
因的安全性最为有效的办法就是利用无争议的生物
安全标记基因。目前发现的生物安全标记基因主
要有绿色荧光蛋白基因、甜菜醛脱氢酶基因、6-
磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因、核糖
醇操纵子、谷氨酸 -1- 半醛转氨酶基因、异戊烯
基转移酶基因、吲哚 -3- 乙酰胺水解酶等。与常
规标记基因不同，这些标记基因没有抗生素或除
草剂抗性，相对来说对生物是安全的，因此称之
为生物安全标记基因[12]。
3.1.1 绿色荧光蛋白基因 绿色荧光蛋白(green fluo-
rescent protein, GFP)是从维多利亚水母(Aequorea
victoria) 中分离纯化出的一种可以发出绿色荧光的
物质[15]。与其他选择标记相比，GFP 的检测具有
不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位
素，也不需要测定酶的活性等优点。同时，GFP
生色基团的形成无种属特异性，在原核和真核细
胞中都能表达，其表达产物对细胞没有毒害作
用，并且不影响细胞的正常生长和功能。所以，
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在含有甘露糖的培养基上只有转化细胞能正常生
长，而非转化细胞将被淘汰。目前，pmi 基因已
广泛用于水稻[20]、玉米[21~23]、小麦[23]和甜菜[24,25]等
植物的转化系统。
许多植物细胞不能利用木糖。然而在 XYL 的
催化下能将木糖转变成木酮糖(xylulose)，再经过
磷酸戊糖途径分解代谢，为细胞生长所利用。在
以木糖为主要碳源的培养基上，转化细胞因能利
用木糖而呈现优势生长，非转化细胞则因碳源供
应不足而使生长受到抑制[26]。Haldrup等[27]将xylA
分别转化到马铃薯、烟草和番茄愈伤组织后，再
将愈伤组织置于木糖的培养基上进行筛选，得到
了能够在该培养基上正常生长的转基因植株。以
木糖作为筛选标记，具有更高的转化效率，比卡
那霉素筛选系统高 10 倍左右。
一般生物细胞不能利用核糖醇作为碳源。而
大肠杆菌 C 菌株却能在以核糖醇为碳源的培养基
上生长。这是因为 C 菌株中有两个紧紧串联的操
纵子，即atl和rtl[28]。大肠杆菌B菌株和K-12菌
株是生物工程中最常用的菌株，但由于缺少这两
个操纵子而不能分解代谢核糖醇。Reiner[29]发
现，当把atl和rtl从C菌株分别转到B菌株和K-
12 两菌株中后，两菌株都能在以核糖醇为碳源的
培养基上正常生长。因此认为核糖醇操纵子
(ribitol operon)可以作为一种非抗生素选择标记应用
于植物遗传转化。
3.1.4 谷氨酸-1-半醛转氨酶基因 在叶绿素生物合
成的第一阶段，谷氨酸首先在谷氨酸-1-半醛转氨
酶(glutamic acid -1-semialdehyde-aminotransferase,
G S A - A T )的催化转化为 d- 氨基乙酰丙酮( 5 -
aminolaevulinic acid, ALA)。3-氨基-2,3-二氢苯甲
酸(3-amino-2,3-dihydrobenzoic acid, gabaculine)是
一种植物毒素，它能强烈抑制 GSA-AT 活性，使
A L A 不能合成，从而导致叶绿素的生物合成中
断。到目前为止，已经分离出了许多抗Gabaculine
的突变体[30]。其中有一个命名为GR6 的突变体携
带有hemL 基因[31]。hemL 作为一种选择标记基因
与抗生素或除草剂抗性基因的选择原理相似，都
是利用一种抗性基因使转化细胞基因获得某种抗
性，从而能够在含有该选择剂的培养基上正常生
长，而非转化细胞由于缺少此种抗性，生长即受
利用 gfp 作为选择标记基因，可以很方便地从大
量的细胞或组织中筛选出转化细胞和植株，并且
可用来追踪外源基因的分离情况。因此，gfp 已
在烟草[16]、水稻[17]等植物中得到了应用。
3.1.2 甜菜醛脱氢酶基因 利用植物本身就具有的
基因作为选择标记基因，也可以减轻大众对转基
因作物的担心。例如Daniell等[18]用菠菜的甜菜醛
脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase, BADH)基因
作为烟草叶绿体转化的筛选标记基因，在筛选过
程中BADH可以把毒性的甜菜醛(betaine aldehyde,
BA)转化为没有毒性的甘氨酸甜菜碱(glycine betaine,
GA)。运用 BA 作为选择标记比传统的选择标记的
转化效率明显提高；并且 GA 作为一种渗透保护
剂，还可以提高转基因植株的再生率。例如在BA
选择下，12 d 内有 80% 的转化叶盘出现转化芽，
每个叶盘平均达到23个转化芽；而用壮观霉素选
择，45 d 内只有 15% 的转化叶盘出现转化芽，每
个叶盘平均只有1~2个芽[18]。
3.1.3 与糖代谢途径相关的基因 离体培养的细胞
不能进行光合作用，必须在培养基中添加一定浓
度的碳源(如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等)后细胞才
能进行正常的生长分化。近年来，正是利用这一
点产生了3种非抗生素标记基因，即：6- 磷酸甘
露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase, PMI)基
因(pmi)、木糖异构酶(xylose isomerase, XYL)基因
(xylA)和核糖醇操纵子(ribitol operon)。它们能分
别使转化细胞利用6-磷酸甘露糖、木糖和核糖醇
为碳源，而非转化细胞由于不具有这些基因，会
产生碳饥饿而不能正常生长，从而达到高效选择
的目的。
pmi基因编码的6-磷酸甘露糖转移酶(mannose-
6-phosphotransferase)可催化 6- 磷酸甘露糖
(mannose-6-phosphate, M-6-P)转变为6-磷酸果糖
(fructose-6-phosphate, F-6-P)。在含甘露糖的培养
基上，植物内源己糖激酶(hexokinase)催化甘露糖
磷酸化为 M-6-P，消耗 ATP，非转化细胞由于不
能利用M-6-P，造成 M-6-P 积累并大量消耗ATP，
长期处于饥饿状态，生长处于停滞；而整合了外
源pmi基因的转化细胞则能将M-6-P转变为细胞可
以利用的F-6-P，这就避免了M-6-P的大量积累并
产生 ATP，为细胞正常生长提供能量[19]。因此，
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到抑制甚至死亡[32]。所不同的是，hemL 不具有
抗生素或除草剂抗性，这样就避免了由于抗生素
或除草剂基因在转基因植物中的存在而引起的争
论。
3.1.5 与激素代谢途径相关的基因 与激素代谢途
径相关的基因包括异戊烯基转移酶(isopentenyl
transferase, IPT)基因(ipt)、吲哚-3-乙酰胺水解酶
(indole-3-acetamide hydrolyse, IAAH)基因(iaah)及
b-葡糖苷酸酶(b-glucuronidase, GUS)基因(gus)。
ipt 基因从农杆菌的 T-DNA 中克隆而来，编
码IPT，参与植物吲哚乙酸(indole acetic acid, IAA)
的合成，IAA 可以促进器官发生，因此转化的细
胞在未加 IAA 的培养基上能继续生长，可形成不
定芽。相反，未转化的细胞在不含 IAA 的培养基
中不能正常生长和分化而死亡[33]。进一步的研究
发现，在烟草和莴苣中，采用 ipt 的选择效果优
于卡那霉素抗性基因[34]。
iaah是另外一种与激素代谢相关的安全的选
择标记基因，也是通过调节植物体内激素代谢而
使转化细胞与非转化细胞的生长与分化造成一定的
差异，从而达到筛选出转化细胞的目的[35]。
gus基因在一定条件下也有与ipt 基因的相似
效果。在培养基中添加葡萄糖苷酸，含有 gus 基
因的转化细胞因子能在 GUS 的作用下进行水解，
释放出激动素(kinetin)，从而促进转化细胞的生
长，未转化细胞则逐步死亡[36]。
此外，用基因枪方法将花色素苷基因b和 c1
转入小麦24 h 以后，转化细胞中即有红/紫色色
素形成。花色素苷基因能够在种子的子房和果皮
中表达。因此用花色素苷编码基因作为转基因后
代的选择标记也可避免使用抗生素基因或抗除草剂
基因作为选择标记基因[37]。
3.2 用标记基因获得转基因植株后的去除 目前，
去除转基因植物中标记基因主要采用共转化、位
点特异重组酶系统、转座子和同源重组等方法。
3.2.1 共转化法去除标记基因 共转化的原理是将
目的基因和选择标记基因分别组装在两个不同质粒
上，同时转化目标细胞。由于两个质粒载体可同
时整合到细胞的不同染色体上。转化植株的后代
经过遗传分离，便可获得仅含有目的基因的转基
因植株[38]。这种方法比较简单，适用于多种转化
体系。但此法必须保证具有较高的共转化频率，
同时还应保证标记基因和目的基因共整合到受体基
因组的不同位点。虽然经过对各个转化参数的优
化，在有些植物共转化法中两个基因同时整合到
受体植物的效率已能达到用单一质粒转化方法的效
率[39]，但在实际上应用中，由于位于不同转化质
粒载体中的转基因共整合频率往往较低，并且常
常整合在受体基因组的同一位点上[40]，这就使共
转化和遗传分离策略的应用受到了限制。
为了克服共转化的缺点，可以将选择标记基
因和目的基因分别插入到同一质粒中两个相互独立
的 T-DNA 区内，构建成含有两个 T-DNA 的农杆
菌超级双元载体(super binary vector, SBV)。例如
Komari等[41]将卡那霉素的抗性基因nptⅡ或潮霉素
抗性基因hptⅡ和gus基因构建成农杆菌SBV，分
别转化烟草和水稻，结果在转基因植株中的标记
基因和报道基因共整合频率约为 50%。分析转基
因植株 F1 代的结果表明，60% 以上的株系可获得
无标记基因的gus转基因植株。在Komari工作的
基础上，Lu等[42]对质粒的构建方法作了进一步改
进，他们将两个独立的 T-DNA 序列改建成含 1 个
左边界 T-DNA 和 2 个右边界 T-DNA 的序列。目
的基因位于左边界 T-DNA 和右边界 T-DNA 之间，
而标记基因在两个T-DNA 右边界之间。用含该T-
DNA 的质粒转化水稻，其中 35%~64% 的转基因
后代标记基因与目的基因发生了分离。由于这种
质粒比含两个独立 T-DNA 序列的质粒小，容易操
作，所以转化频率相对较高。不过，标记基因
和目的基因的遗传分离必须经过有性世代才能实
现，这不仅会增加育种时间，而且也无法应用于
无性繁殖的植物。
3.2.2 位点特异重组酶系统去除标记基因 位点特
异的重组(site specific recombination)系统是由重组
酶和其识别的位点组成。在重组酶的介导下，在
两个识别位点之间的 DNA 片段并不是转移到基因
组的其它地方，而是在识别位点上被切除掉，或
发生倒置[43]。因此，利用位点特异重组酶系统可
以去除转基因植物的选择标记基因。具体方法：
是在最初设计转化载体时，在标记基因的两端加
上重组酶识别序列；在得到转化植株后，再将重
组酶基因通过转化或有性杂交的方式导入植物体，
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重组酶基因表达后就把可以标记基因去除掉[44]。
但此法程序繁琐，应用中受到很大的限制。
为了加快去除标记基因的进程，可以将重组
酶基因与标记基因连接到同一载体上。通过化学
诱导表达的启动子驱动重组酶基因。在化学诱导
剂的作用下，重组酶基因表达，就可以将标记基
因去除。这就是所谓的多基因自动转化(multi-
auto-transformation, MAT)载体系统。Sugita等[45]
采用 MAT 载体系统，将重组酶与化学诱导表达的
谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)
启动子 GST-27融合，以ipt为选择标记基因转化
烟草，在转化当代就获得了单拷贝的无选择标记
基因的转化植株。MAT 载体系统可以免去有性杂
交或二次转化的过程，在转化的当代就能获得无
标记基因的转化植株，因此，M A T 载体系统特
别适用于以营养器官繁殖的植物遗传转化。
表2 4个位点特异重组系统的特性[43,44,46]
系统 来源 重组酶及其大小 识别位点及其大小
Cre/lox 噬菌体 P1 Cre: 38.5 kD loxP: 34 bp
FLP/FRT 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2 m质粒 FLP: 48 kD FRT: 34 bp
R/RS 接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii )的pSR质粒 R: 56 kD RS: ≤58 bp
Gin/gix 噬菌体 M u Gin: 21.7 kD gix: 34 bp
目前已发现了 Cre/lox、FLP/FRT、R/RS 和
Gin/gix 4个位点特异重组系统，它们的重组酶和
其识别位点及大小归纳见表 2。
3.2.3 转座子去除标记基因 转座子(transposon)是
指一段可在染色体组内移动的特定的 DNA 序列，
可将其从一个位点切除下来，插入到一个新的位
点上。它一般通过特定的酶识别某一种 D N A 序
列，识别插入到另外位点上去的 D N A 片段。例
如，玉米中的 Ac/D s 转座子，可以把特定重复
DNA 之间的基因切除下来，在 Ac 转座酶的作用
下将其转移到另一位置上[47]。有时转座作用并不
伴随再次插入而是该转座子丢失。基于这一原
理，采用转座子系统也可以将选择标记基因去
除。具体的方法有以下2种：(1)将标记基因置于
转座子与重复序列Ds之间，转座作用发生后，标
记基因随转座作用而与目的基因分离或丢失。例
如，Ebinuma 和 Komamine[35]采用这种途径，将
ipt 基因置于Ds 之间，再用MAT 载体系统得到了
高转化频率且仅含有目的基因的转基因烟草。(2)
将目的基因置于Ds之间，目的基因即随转座作用
的发生而与选择标记基因分离。Goldsbrough等[48]
采用nptⅡ为选择标记基因，以gus基因作报告基
因转化番茄，结果在转基因植株后代中发现nptⅡ
和 DS-gus-DS 结构的重组分离现象。
3.2.4 同源重组去除标记基因 两个同源序列之间
分生的染色体内重组(intrachromosmomal homolo-
gous recombination)可以诱导DNA片段缺失[5]。方
法是把标记基因放在两个 DNA 同源序列之间，发
生同源重组后，标记基因即被去除，这样的细胞
经过再生，可得到无标记基因的植株。例如，
Fischer等[49]采用同源重组的原理，在addA基因
两端加上重复序列(direct repeats)，经过几代的细
胞分裂后 a d d A 基因即可从叶绿体中除去。
Lamthan和Day[7]及Maliga[50]采用同样的方法也曾
获得了只含有目的基因的转基因烟草。
3.3 无选择标记基因的转化系统 如果在遗传转化
过程中，不使用选择标记基因就能获得只含有目
的基因的转基因植株，这应该是最经济和最有效
的方法。de Vetten等[51]的研究结果即是这方面的
成功事例。据他们报道，利用致病性强的农杆菌
菌株 AGL0 转化外植体，可用 PCR 分析方法选择
转化细胞，而不必用选择标记基因。此法的具体
步骤是：在构建表达载体时，只将目的基因和启
动子及终止子插入在 T-DNA 的左边界和右边界之
间。然后用农杆菌菌株 A G L 0 浸染马铃薯外植
体。由于 A G L 0 菌株含有超强致病力
(supervirulent)的农杆菌A281质粒pTiBo542Ti[52]的
致病区域序列，所以 A G L 0 菌株的转化效率较
高。共侵染之后，每个外植体可以产生 1~2 个再
生芽。再生芽培养成小植株后用特异的引物进行
PCR 检测，结果发现 5 次转化实验的转化频率在
1.3%~5.6% 之间，平均为 4.5%。经 PCR 检测为
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阳性的转基因植株，有 45% 的在表型上出现所需
的性状。这个系统不需要经过遗传分离或位点特
异重组酶系统去除标记基因，因此该系统尤其是
为营养繁殖的植物(如马铃薯和木薯)提供了一种有
效的产生无标记基因的转基因植株方法。
4 结论和展望
在解决选择标记基因的生物安全性问题的 3
种途径中，去除选择标记基因的研究虽然取得了
很大进展，但还存在选择效率低和步骤繁琐等问
题，到目前为止尚未建立起一套高效的去除选择
标记基因的系统。而无选择标记基因转化系统的
研究才刚刚起步，其在其它转基因植物中的应用
还待进一步验证。采用无争议的生物安全标记基
因可以排除人们对标记基因安全性的担心。相信
随着功能基因组学和蛋白质组学的进展，植物转
基因技术必将不断合理化和精确化，最终采用无
争议的生物安全标记基因研究解决有关生物安全性
的问题。
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