全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月 181
胡萝卜体细胞胚胎发生中的细胞组织化学和蛋白质组成变化
周燕1,2 高述民1,* 李凤兰1
1 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083；2 中国科学院文献情报中心，北京 100080
提要 研究胡萝卜体细胞胚不同发育阶段的细胞组织化学和蛋白质组成变化的结果表明: 胚性愈伤组织主要源自维管束
周围的细胞。球胚形成前期，淀粉粒和糊粉粒极性分布已很明显。子叶胚期，芽开始分化，有大量糊粉粒累积。在体细
胞胚发育过程中，淀粉粒在胚性愈伤组织形成初期和球胚后期、糊粉粒在胚性愈伤组织形成后期和球胚期各有两次累积
高峰。
关键词 胡萝卜；体细胞胚；组织化学；蛋白质组成
Changes in Histochemistry and Protein Pattern During Somatic Embryogenesis
of Carrot
ZHOU Yan1,2, GAO Shu-Min1,*, LI Feng-Lan1
1College of Biological Science and Technology, Beijing Forest University, Beijing 100083; 2Library of Chinese Academy of
Sciences, Beijing 100080
Abstract Changes in histochemistry and protein pattern during somatic embryogenesis of carrot were studied.
Embrogenic callus mainly originated from the cells around vascular bundle. The polarity distributions of starch
grains and aleurone were extremely evident in the early stage of globular embryo. Shoot began differentiation in
cotyledonary embryo and the plenty of starch grains accumulated in it. Two peaks of starch grains appeared in
the early stage of embryogenic callus formation and the late stage of globular embryos, while the two peaks of
aleurone grains appeared in the late stage of embryogenic callus formation and the whole globular embryo stage
during somatic embryogenesis.
Key words carrot; somatic embryo; histochemistry; protein pattern
收稿 2003-07-14 修定 　 2003-12-01
资助　 国家自然科学基金(30070613 和 39630040)。
* 通讯作者(E-mail:gsm689@sohu.com, Tel:010-62338717)。
近20年来植物器官发生和形态建成(pattern
formation)的发育分子生物学研究已取得了实质性
进展，相继克隆到一些与之相关的基因，并对部
分基因的结构、功能以及一些重要的蛋白和调控
因子亦作了较详细的研究[1～5]。但迄今人们对植
物器官形成和形态建成机制细节的了解还较少。
目前，一些植物体细胞胚胎培养过程中的淀粉
粒、ADP- 葡萄糖焦磷酸酶活性及亚基组成、核
糖体含量变化已有了一些报道[6,7]。从形态发育来
说，其中的关键是调节基因协同表达，形成分化
的组织、器官[8] 。本文研究胡萝卜体细胞胚形成
过程中器官和组织形态的发生、组织化学和可溶
性蛋白的变化规律，初步分析器官发生和形态建
成中的细胞和蛋白分子特征。
材料与方法
植物材料为胡萝卜(Daucus carota) ，购自日本。
体细胞胚的诱导培养参照文献 9 的方法。取
10 d 左右苗龄的无菌苗，剪取下胚轴3~4 mm 的
切段，接种在含有2,4-D 1.0~1.5 mg.L-1 的 MS琼
脂培养基上，于26℃、17 h.d-1 光照(光强为2 000
mmol.m-2.s-1)下诱导愈伤组织。在相同的培养基上
继代培养，20 d 继代 1次。挑选200 mg 白色透
明、疏松的愈伤组织细胞，接种在盛有35 mL MS
液体培养基(无 2,4-D)的 100 mL三角瓶中，置于
26℃、17 h.d-1 的光照下，以100 r.min-1 的转速
振荡悬浮培养，每周继代 1 次诱导体细胞胚。同
时以 OLYMPUS 倒置显微镜镜检悬浮培养细胞以
便及时分选所需材料。
显微组织化学观察时，取各典型时期培养材
料，用 F A A 固定，琼脂石蜡包埋。由于愈伤组
织细胞及前期体细胞胚较小，不宜直接进行石腊
包埋切片。因此，先用 6 ％的琼脂包埋，包埋
温度 50℃左右，并注意将材料搅起，使其均匀
植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月182
分布，然后进行石腊包埋切片。切片厚度 8~10
mm，先用高碘酸-锡夫 (periodic acid-Schiff，PAS)
染色、再用萘粉黄S(naphthol yellow S)复染[10]，
观察形态结构及淀粉粒、糊粉粒的变化和含量。
以 SDS-PAGE 分析可溶性蛋白时，于球形
胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚期分别取样，
每种样品取 3 g，加 6 mL 提取液[5%-ME、2
mmol.L-1 苯甲基磺酰氟(PMSF)、60 mmol.L-1 Tris-
HCl(pH 7.5)]，每克样品含0.1 g聚乙烯吡咯烷酮
(PVP)及少许石英砂研磨。4℃下以24 000× g离
心30 min，取50 mL(约 600 mg蛋白)上清液进行
SDS-PAGE 垂直平板电泳，银染，用岛津双波长
色谱扫描仪CS-930 在波长 590 nm 处扫描。
结果与讨论
1 体细胞胚胎发生的组织化学观察
据观察，外植体(下胚轴) 细胞中淀粉粒和糊
粉粒含量极少，而一旦经过愈伤化培养后，靠近
维管组织的薄壁细胞中则含有大量的糊粉粒和淀粉
粒。离体的非胚性愈伤组织与胚性愈伤组织均为
薄壁细胞。非胚性愈伤组织主要来源于外植体表
皮与外皮层细胞，细胞较大，细胞质中淀粉粒及
糊粉粒含量极少；而胚性愈伤组织主要来源于外
植体下胚轴中柱及内皮层细胞或子叶维管束周围细
胞，细胞较小，细胞质浓，细胞质初始富含淀
粉粒及少量的糊粉粒，随着胚性的建成，细胞质
则含有较多的糊粉粒及少量的淀粉粒。从外表上
看，此时的胚性愈伤组织为浅黄色，呈较致密的
小颗粒状。观察体细胞胚发育过程的结果表明，
能进行有丝分裂形成体细胞胚的细胞往往核大、
细胞较小。当细胞经几次分裂形成顶端分生组织
细胞和胚柄结构之后，才具有明显的极性。胚性
单细胞富含淀粉粒，但是，仅凭光学显微镜尚看
不出极性的分布。有关极性分化的更细微差异尚
待进一步电镜切片的观察。愈伤组织发生明显的
变化可能与合子胚的授粉受精一样，是由于环境
信号(激素等)的刺激，愈伤组织吸收强度和激素
含量增加，引起胚性愈伤中碳水化合物和蛋白质
的增高。可见，愈伤细胞中累积大量的淀粉粒和
糊粉粒，可作为胚性愈伤细胞分化的标志。
处于不同发育阶段的体细胞胚中淀粉粒和糊粉
粒的含量以及分布随形态结构的不同而变化。胡萝
卜体细胞胚的发生经历八细胞期(图 1-a)。进入球
形胚形成初始阶段，多细胞原胚始终被一层外被包
围，与周围细胞间有明显界限。随着胚体发育，
形态和组织化学上的极性化非常明显，即胚体顶部
内层细胞含大量的淀粉粒和糊粉粒，胚柄细胞内含
大量游离多糖，胚柄附近细胞内含大量的淀粉粒，
表明胚柄在胚胎营养中起作用(图1-b); 至球形胚形
成时，近顶部内层细胞逐渐累积大量的糊粉粒，
而淀粉粒很少；在胚体表皮细胞及基部细胞则富含
淀粉粒，无糊粉粒(图 1-c); 至球形胚后期，近顶
部内层细胞富含糊粉粒，无淀粉粒，而表皮细胞
和基部细胞除富含淀粉粒外，还含有少量的糊粉
粒，此期为糊粉粒累积高峰期。
胡萝卜整个体细胞胚发生过程中，有两次多
糖累积高峰，表现为淀粉粒增加。第一次是在胚
性愈伤组织形成初期，一方面为胚胎发育提供能
量，另一方面转化为糊粉粒。第二次是在球形胚
后期，为胚体的进一步发育和成熟胚萌发、植株
的再生准备能量。这两个过程均属于高能耗过
程。以上表明，淀粉粒的出现与胚胎发生潜能的
实现密切相关。
糊粉粒的积累有两次高峰：第一次在胚性愈
伤组织形成后期，第二次在球形胚期。Sengupta
和Raghvan[11]等用双标记法测定胡萝卜悬浮液细胞
中蛋白质和 RNA 合成时也曾得到类似的结果，即
胚状体形成的细胞中蛋白质和 RNA 合成速度均高
于无胚状体发生的细胞。
胚芽的形成始于子叶胚，原基处富含大量的糊
粉粒(图1-d)。次生胚源于子叶胚的表皮细胞(图1-e)。
图1 胡萝卜体细胞胚发生的组织化学变化
Fig.1 Changes in histochemistry during somatic
embryogenesis of carrot
a.八细胞期；b.球胚形成前期；c.球胚形成期；d.子叶胚胚
芽形成期；e.次生胚形成期。
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2 不同阶段体细胞胚中可溶性蛋白组成的变化
胡萝卜体细胞胚在发育的不同阶段，其可溶
性蛋白种类存在着一定的差异(图 2、表 1)。
由图 2 和表 1 可见，依各期胚中可溶性蛋白
变化可分为 4 个区。Ⅰ区：各期蛋白组分和含量
图2 不同阶段胡萝卜体细胞胚中可溶性蛋白单向电泳后的扫描图
Fig.2 Scanning pattern of soluble protein identified by SDS-PAGE at different stages of carrot somatic embryo
a.球形胚；b.心形胚；c.鱼雷形胚；d.子叶胚。
相同；Ⅱ区：球形胚比其它3期主要少ⅡA蛋白，
鱼雷形胚比其它 3 期含量普遍要高，子叶胚与心
形胚含量相近；Ⅲ区：各期含量基本相同；Ⅳ
区：由球形胚到子叶胚，高分子量蛋白的含量依
次减少，而低分子量蛋白的含量却依次增加，呈
规律性的递变(图 2)。总之，从球形胚发育到子
叶胚，峰数呈现先下降再回升的变化趋势。可溶
性蛋白种类有减少也有增加。与球形胚相比，心
形胚减少3种而增加1种；鱼雷胚减少8种而增加
5 种，变化最大；子叶胚仅减少 1 种，与球形胚
相似程度最高(表 1)。另外，从球形胚到鱼雷胚
多肽种类的差异有一个过渡过程，表明采用SDS-
PAGE 分析技术可以看出可溶性多肽的变化规律。
这与上述形态学的结果(即球形胚期有糊粉粒累积
高峰)相吻合。
参考文献
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表1 不同阶段胡萝卜体细胞胚中可溶性蛋白的变化
Table 1 Changes in soluble proteins of carrot somatic
embryo at different stages
阶段 峰数/条 蛋白条带分子量/kD
球形胚 20 —
心形胚 18 +17.7、-25.3、-41.7、-77.6
鱼雷形胚 17 +16.0、+17.3、+20.7、+48.0、+54.1、
-16.6、-19.1、-20.7、-29.1、-40.9、
-50.0、-70.2、-80.7
子叶胚 19 -26.9
“+”表示有此条带，“-”表示无此条带。