全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月1106
甘蓝型油菜 ‘沪油 15’中两个CBF类转录因子的克隆与分析
庄静 1,2, 朱波 2, 金晓芬 2, 彭日荷 2, 乔玉山 1, 章镇 1, 熊爱生 2,*, 姚泉洪 2,*
1南京农业大学园艺学院, 南京 210095; 2上海市农业科学院生物技术研究所, 上海 201106
提要: 以拟南芥CBF家族转录因子AP2保守域的氨基酸序列为信息探针, 搜索油菜UniGene数据库, 得到2个UniGene: Bna.
2193和Bna.2260, 序列拼接得到 2个 cDNA序列(BnaCBF-1和BnaCBF-2)。通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜 ‘沪
油 15’的DNA和 cDNA中克隆了上述基因。序列分析显示, 克隆的 BnaCBF-1-Hy15与 BnaCBF-1基因序列完全一样, 而
BnaCBF-2-Hy15与 BnaCBF-2的基因序列差异很小, 只有 4个氨基酸位点不同, 且都没有内含子。从 cDNA序列、氨基酸
序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性 /亲水性、序列比对、进化树、功能域、二级结构、三级结构进行了预测。
结果显示, ‘沪油 15’来源的 BnaCBF-1-Hy15和 BnaCBF-2-Hy15转录因子属于AP2/ERF家族中的DREB-A1亚族, 是亲水
性蛋白, 在蛋白质的三级结构上与 atCBF1相似。
关键词: 转录因子; CBF; 生物信息学; 甘蓝型油菜 ‘沪油15’
Cloning and Analysis of CBF Transcription Factors from Brassica napus L. cv.
‘Huyou 15’
ZHUANG Jing1,2, ZHU Bo2, JIN Xiao-Fen2, PENG Ri-He2, QIAO Yu-Shan1, ZHANG Zhen1, XIONG Ai-Sheng2,*, YAO Quan-
Hong2,*
1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Biotechnology Research Institute, Shanghai
Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China
Abstract: Two CBF family transcriptional regulators were isolated from Brassica napus by in silico cloning
method using the conserved domain amino acid sequence of atCBF1 as probe. Based on the sequences of
BnaCBF-1 and BnaCBF-2 from Bna.2193 and Bna.2260, BnaCBF-1-Hy15 and BnaCBF-2-Hy15 genes were
isolated from B. napus cv. ‘Huyou15’ by RT-PCR and PCR using cDNA and DNA as template. DNA se-
quencing and analysis indicated that there was no difference between BnaCBF-1-Hy15 and BnaCBF-1, bnt
four amino acid residues difference between BnaCBF-2-Hy15 and BnaCBF-1. No intron localized on the two
genes, respectively. Then, cDNA and deduced amino acid sequence, composition, hydrophobicty and
hydrophilicity, physical and chemical characterization, phylogenetic tree, conserved domain sequence, function
domain, and molecular modeling were predicted and analyzed. BnaCBF-1-Hy15 and BnaCBF-2-Hy15 were
part of the DREB-A1 subfamily, and were hydrophilic protein. The two proteins and atCBF1 had similar
three-dimension structure.
Key words: transcription factor; CBF; bioinformatics; Brassica napus cv. ‘Huyou15’
收稿 2008-07-14 修定 2008-10-29
资助 国家 “8 63 ” 项目(2 00 6AA10 Z1 17 )、上海市自然科学
基金(08ZR1417200)和上海市青年科技启明星跟踪计划
(08 QH 14 02 1)。
* 通讯作者 ( E - m a i l : Y a o q u a n h o n g @ s a a s . s h . c n ,
Xiongaisheng@saas.sh.cn; Tel: 021-62203180)。
CBF (C-repeat binding factor)类转录因子(又称
dehydration responsive element binding protein,
DREB), 是近年来植物抗逆境研究中的热点, 受到广
泛关注。通过与 CRT (C-repeat)/DRE (dehydration
responsive element)顺式元件的特异结合, 能够调节
植物体内多个基因协同表达, 提高植物的抗逆能力
(王少峡等 2004; Yamaguchi-Shinozaki和 Shinozaki
1994)。有研究表明, 一个大的转录因子基因家族
往往包含彼此相近的基因亚家族(Riechmann等
2000; Nakano等 2006)。CBF类转录因子是AP2/
ERF超级家族的一部分, 后者还包括ERF、AP2和
RAV亚族(Sakuma等 2002; Zhuang等 2008)。CBF
类转录因子在耐受非生物胁迫中起作用, CBF基因
和 CRT顺式元件结合, 能够激活与低温、干旱、
高盐相关的下游基因的转录(Stockinger等 1997)。
CBF类转录因子的转基因植株中CBF的过量表达
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导致受胁迫诱导基因的强烈表达, 从而增强转基因
植株对干旱、低温、高盐耐受性(Jaglo-Ottosen等
1998; Kasuga等 1999; Ito等 2006; Qin等 2007)。
本文通过电子克隆技术结合RT-PCR手段从上
海市农业科学院培育的在长江中下游地区广泛种植
的双低甘蓝型油菜品种‘沪油15’中克隆了2个CBF
类转录因子(BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-2-Hy15), 采
用生物信息学方法对两者推测的氨基酸序列从氨基
酸组成、理化性质、疏水性及结构功能进行了预
测和分析。
材料与方法
文中数据库来源于NCBI (美国国立生物技术
信息中心, National Center for Biotechnology
Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。CBF类
转录因子电子克隆时, 下载油菜(Brassica napus L.)
的 U n i G e n e 数据库到本地主机 , 以拟南芥
(Arabidopsis thaliana)的CBF家族AP2保守域的氨
基酸序列为信息探针, 搜索整个油菜 EST数据库,
得到相关的EST序列片段。利用CAP3程序(CAP3
sequence assembly program, http://pbil.univ-lyon1.fr/
cap3.php)对检索到的油菜 CBF类转录因子进行序
列拼接和分析(Huang和Madan 1999)。文中的序
列分析、蛋白质和核苷酸的多重序列比对、分子
系统进化树的构建、蛋白质基本性质的分析、蛋
白质三维模型的同源建模分析与图形绘制参考庄静
等(2008)文章进行。
取生长健壮的油菜‘沪油15’幼苗提取总RNA,
以总RNA为模板, Oligo (dT)为引物, 在AMV反转
录酶的作用下合成cDNA第一链后, 以此为模板进
行 PCR扩增。采用 CTAB法抽提油菜幼苗的总
DNA (Richards等 1998)。根据电子克隆获得的
BnaCBF-1和 BnaCBF-2基因序列, 设计 2对引物,
两端分别引入Bam HI和 Sac I酶切位点。Bna.2193-
F: GGATCCATGACCTCAT TTTCTACCTTTTC; Bna.
2193-R:GAGCTCTCAGAATTCATAACTCC-
AAAGGGACAC; Bna.2260-F: GGATCCATGACCTCA-
TTTTCTGCCTTCTC; Bna.2260-R=Bna.2193-R。采
用大连宝生物公司 PCR试剂盒在 50 µL的体系中
进行 PCR反应, 反应参数为: 94 ℃下变性 30 s, 55
℃下退火 30 s, 72 ℃下延伸 1 min, 共扩增 30个循
环。扩增片段回收后克隆到 pMD-18-Simple T载
体上进行鉴定和序列测定。
结果与讨论
1 油菜CBF类转录因子 cDNA序列的获得
以拟南芥CBF类转录因子atCBF1 (AT4G25490.1)
AP2保守域 YRGVRQRNSGKWVSEVREPN-
KKTRIWLGTFQTAEMAARAHDVAALALRGRSACLNFA
为信息探针, 从油菜的UniGene数据库中搜索得到
2个相关的UniGene: Bna.2193和 Bna.2260。利用
CAP3程序分别对Bna.2193和Bna.2260中的序列进
行拼接和分析, 得到 2个编码蛋白质的 cDNA, 分
别命名为BnaCBF-1和BnaCBF-2, 上述两个序列均
包含一个 645 bp的ORF阅读框, 编码 214个氨基
酸。
2 BnaCBF-1-Hy15和 BnaCBF-2-Hy15转录因子
基因克隆
分别以引物 Bna.2193-F、Bna.2193-R和 Bna.
2260-F、Bna.2260-R从 ‘沪油 15’幼苗的DNA和
图 1 PCR克隆 ‘沪油 15’的 BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-Hy15转录因子基因
Fig.1 Isolation of BnaCBF-1-Hy15 and BnaCBF-2-Hy15 genes by PCR from ‘Huyou15’
M: DNA分子量标记; 1: DNA中扩增的 BnaCBF-1-Hy15产物; 2: cDNA中扩增的 BnaCBF-1-Hy15产物; 3: DNA中扩增的 BnaCBF-
2-Hy15产物; 4: cDNA中扩增的 BnaCBF-2-Hy15产物; 5、6: BnaCBF-1-Hy15酶切鉴定; 7、8: BnaCBF-2-Hy15酶切鉴定。
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图 3 油菜BnaCBF-1、BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-2、BnaCBF-2-Hy15与拟南芥 atCBF1转录因子的多重序列比对
Fig.3 Alignment of BnaCBF-1, BnaCBF-1-Hy15, BnaCBF-2, BnaCBF-2-Hy15 from B. napus and atCBF1 from Arabidopsis
图 2 BnaCBF-1-Hy15和 BnaCBF-2-Hy15的 cDNA和编码氨基酸序列
Fig.2 cDNA and deduced amino acid sequences of BnaCBF-1-Hy15 and BnaCBF-2-Hy15
cDNA中扩增得到650 bp左右特异的预期片段, 而
且DNA和cDNA中扩增的条带大小一致(图1)。由
于从DNA和 cDNA模板中扩增得到的片段大小基
本一致, 初步判断, ‘沪油 15’中的 2个CBF类转录
因子基因序列中均没有内含子。通过TA克隆的方
法将上述 4个片段分别克隆到T载体中, 使用两端
引入的切点, 以 Bam HI和 Sac I进行酶切, 分别得
到 650 bp左右的酶切片段(图 1)。将克隆正确的
上述质粒进行序列测定和氨基酸序列分析, 结果显
示 ‘沪油15’的BnaCBF-1-Hy15与Bna.2193电子克
隆的BnaCBF-1氨基酸序列完全一样; ‘沪油 15’的
BnaCBF-2-Hy15与Bna.2260电子克隆的BnaCBF-2
氨基酸序列的一致性为98.13%, 有4个氨基酸残基
不同(图 2、3)。拟南芥的 atCBF1 (AT4G25490.1)
和 BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-2-Hy15转录因子的
氨基酸序列具有很高的同源性, 尤其在AP2区域, 都
具有一个保守的WLG和一个YRG元件, 而且氨基
酸序列符合典型的 CBF类转录因子的特征(图 3)。
3 BnaCBF-1-Hy15和 BnaCBF-2-Hy15转录因子
的进化树分析
为了进一步分析本文从 ‘沪油 15’中克隆的
BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-Hy15与AP2/ERF类
相关转录因子之间的进化关系, 选取了拟南芥中
AP2/ERF家族转录因子进行同源进化比对, 构建同
源进化树。结果表明, BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-
2 - H y1 5 和 a t C B F 1 ( AT 4 G 2 5 4 9 0 )、a t C B F 2
(AT4G25470)、atCBF3 (AT4G25480)、atCBF4
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(AT5G51990)同处于DREB-A1分支上, 在进化关系
上属于AP2/ERF家族中的DREB-A1亚族(图 4)。
4 BnaCBF-1-Hy15和 BnaCBF-2-Hy15转录因子
氨基酸组成成分及理化性质分析
采用ExPASy方法(Gasteiger等 2003), 对来源
于‘沪油15’的CBF类转录因子与同属于DREB-A1
亚族的拟南芥相关转录因子进行进行氨基酸组成成
分及理化性质分析, 结果见表 1。虽然上述转录因
子同属于DREB-A1类, 但是氨基酸数目有一定的差
异, 理论等电点(theoretical pI)都在酸性范围(pI<6)。
表 1 BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-2-Hy15与拟南芥中DREB-A1亚族转录因子氨基酸组成成分及理化性质
Table 1 Composition and physical and chemical characterization of amino acid sequences on the DREB-A1 subfamily from
Arabidopsis and BnaCBF-1-Hy15 and BnaCBF-2-Hy15
植物 转录因子 登录号 氨基酸 分子量 /Da pI 脂肪族氨基 芳香族氨基 碱性氨基 酸性氨基 不溶蛋白
数目 酸比例 /% 酸比例 /% 酸比例 /% 酸比例 /% 比例 /%
拟南芥 CBF1/DREB1B AT4G25490 213 23829.63 4.99 1 2 1 0 1 2 1 5 57.2
CBF2/DREB1C AT4G25470 216 24264.23 5.00 1 3 1 0 1 3 1 5 56.2
CBF3/DREB1A AT4G25480 216 24236.12 5.08 1 3 1 0 1 3 1 5 64.7
CBF4 AT5G51990 224 24955.88 5.56 1 3 9 1 5 1 5 69.1
DREB-A1 AT1G12610 209 23616.50 5.24 1 5 9 1 4 1 6 61.4
DDF2 AT1G63030 181 20649.43 5.49 1 6 8 1 5 1 6 51.9
油菜 BnaCBF-1-Hy15 — 214 23848.04 5.21 1 6 9 1 3 1 4 57.6
BnaCBF-2-Hy15 — 214 23751.74 5.12 1 4 9 1 3 1 5 57.4
图 4 BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-Hy15转录因子进化树
Fig.4 Phylogenetic analysis of BnaCBF-1-Hy15 and BnaCBF-2-Hy15
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碱性氨基酸、酸性氨基酸、芳香族氨基酸和脂
肪族氨基酸的比例也都较接近, 蛋白质可溶性预
测中不溶蛋白的比例都在 55%~70%之间。利用
D N A M AN 程序分别对 B n a C B F - 1 - H y 1 5 和
BnaCBF-2-Hy15氨基酸序列进行了疏水性 /亲水
性分析。结果表明, BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-
2-Hy15具有类似的疏水区域, 总体来看, 大部分
的氨基酸属于亲水性氨基酸(疏水性分值小于 0),
因此油菜的该类 CBF转录因子属于亲水性蛋白
(图 5 )。
5 BnaCBF-1-Hy15和 BnaCBF-2-Hy15转录因子
的功能域和二级结构预测与分析
用 Blast-Conserved Domains Search软件分析
BnaCBF-1-Hy15和 BnaCBF-2-Hy15保守功能域
(Schaffer等 2001)的结果显示, 两者分别在 45~120
位氨基酸间含有 AP 2 结构功能域(图 6 - a )。将
BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-Hy15与拟南芥相关的
DREB类转录因子保守功能域氨基酸序列进行同源
序列比对分析表明, BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-
Hy15在AP2区域均含有 3个反向平行的β折叠,
还包含有由一段保守度较高的核心序列形成的
一个α螺旋, 这些结构在参与识别顺式元件及转
录因子或 DNA的相互作用中起关键作用(图 6-
b ) 。
图 6 BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-Hy15与拟南芥DREB类转录因子的保守功能域预测分析
Fig.6 Prediction of conserved domain sequences of BnaCBF-1-Hy15, BnaCBF-2-Hy15 and
their comparison with DREB transcription factors from Arabidopsis
a: 保守结构域的预测; b: 保守结构域的序列比较。
图 5 BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-Hy15氨基酸序列的疏水性分析
Fig.5 Analysis of hydrophobicty of deduced amino acid sequences in BnaCBF-1-Hy15 and BnaCBF-2-Hy15
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6 BnaCBF-1-Hy15和 BnaCBF-2-Hy15转录因子
的三级结构预测与分析
BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-2-Hy15和拟南芥
atCBF1转录因子的DNA结合域比较保守, 分别有
7个和 8个氨基酸位点的差异。与已知DNA结合
域晶体结构的 atERF1比较, BnaCBF-1-Hy15、
BnaCBF-2-Hy15和拟南芥atCBF1该区域与atERF1
的同源性分别为 57.9%、57.9%和 59.6%。以拟
南芥 atERF1 (PDB ID: 1gcc)为模型, 通过 SWISS-
MODEL (http://swissmodel.expasy.org/repository/)
三维结构同源建模的结果表明, DNA结合域具有十
分相似的三维结构(图 7)。AP2保守域包括 3个 β
折叠和 1个与 β折叠接近平行的 α螺旋(Allen等
1998)。BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-2-Hy15和
atCBF1在该区域氨基酸位点的变化并没有引起
DNA结合域空间结构的变化(图 7)。
图 7 BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-2-Hy15和 atCBF1转录因子的DNA结合域三维结构
Fig.7 Three-dimension structure of DNA binding domain in BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-2-Hy15 and atCBF1 proteins
图中球棒标注的为 BnaCBF-1-Hy15、BnaCBF-2-Hy15 和 atCBF1 转录因子 DNA结合域差异的氨基酸。
参考文献
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