全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1067
UGPase 和反义4CL 基因对转基因烟草纤维素和木质素合成的调控
梁海泳 夏秀英* 冯雪松
大连理工大学环境与生命学院，辽宁大连116026
提要 用根癌农杆菌介导法将源于紫穗槐的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因、反义4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)
基因以及两者的双价基因分别转移至烟草中。PCR 和 Southern 杂交检测证实外源基因已整合到转基因烟草基因组中。测
定全纤维素和 Klason 木质素含量的结果显示，增强 UGPase 基因的表达可提高转基因植株的纤维素含量，但对木质素含
量没有影响；抑制 4CL 基因的表达可显著降低转基因植株的木质素含量，但对纤维素含量没有影响；转移双价基因的转
基因植株中纤维素含量增加而木质素含量降低。
关键词 木质素；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；4- 香豆酸辅酶 A 连接酶；纤维素；烟草
UGPase and Anti-sense 4CL and Their Regulation of Synthesis of Lignin and
Cellulose in Transgenic Tobacco (Nicotiana tabacum L.)
LIANG Hai-Yong, XIA Xiu-Ying*, FENG Xue-Song
School of Environmental and Biological Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian, Liaoning 116026, China
Abstract UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) gene, anti-sense 4-coumavate: coenzyme A ligase (4CL)
gene and the gene harboring both UGPase and 4CL were transformed into tobacco (Nicotiana tabacum L.) by
Agrobacterium tumefaciens-mediated. The results of PCR and southern blotting indicated that they were all
integrated into the genome successfully. The analysis of holocellulose and Klason lignin contents showed
enhancing the expression of UGPase could improve cellulose content, which didn’t affect lignin content;
down-regulating the expression of 4CL could reduce lignin content, which didn’t affect cellulose content;
cellulose content in transgenic tobacco harboring UGPase and 4CL increased, while lignin content was reduced.
Key words lignin; UDP-glucose pyrophosphorylase; 4-coumarate: coenzyme A ligase; cellulose; Nicotiana
tabacum L.
收稿 2006-07-31 修定 　2006-11-16
资助 辽宁省博士启动金(20031080)。
*通讯作者(E-mail: xiaxiuying@yahoo.com.cn, Tel: 0411-
84706356)。
采用基因工程技术调控木质素及纤维素的生
物合成，培育高纤维素和低木质素含量的植物新
品种，对造纸、纺织和饲草等原料生产来说，其
意义是不言而喻的。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化
酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)是催
化纤维素的前体——尿苷二磷酸葡萄糖( U D P -
glucose, UDPG)合成的。已有研究表明，醋酸杆
菌中的 UGPase 基因与纤维素的生物合成密切相
关。但有关此酶在高等植物纤维素合成中的作用
及与其相关基因工程的研究极少，只有 X u e 等
(1998)的转移细菌UGPase基因提高烟草纤维素含
量、增加生物量的一篇报道。另外，4 - 香豆酸
辅酶A连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase, 4CL)
是控制木质素生物合成的关键性限速酶。目前，
已从多种植物中克隆到 4CL 基因并反义转化至烟
草、杨树、火炬松等植物中。已有研究表明，
4CL 基因表达受抑后木质素含量普遍下降，但转
基因植物的生长、发育和形态结构并不受影响，
因此认为 4CL 基因是理想的调控植物木质素合成
的目标基因(Wei 等 2005)。本文采用根癌农杆菌
介导法，将紫穗槐的 UGPase 基因、反义 4CL 基
因以及两者的双价基因转移至烟草基因组中，观
察这 2 个基因对烟草中纤维素和木质素合成的影
响，旨在探索用这一手段调控植物纤维素和木质
素合成的可行性。
材料与方法
烟草(Nicotiana tabacum L.)组培苗由我们实验
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室保存。
质粒pBU、pBa4CL 及 pBU-a4CL 分别携带紫
穗槐(Amorpha fruticosa Linn.) UGPase基因、反
义4CL 基因及 UGPase- 反义 4CL 双价基因，由我
们实验室构建( 图 1 ) 。所用植物表达载体为
pBI121，农杆菌菌株为 LBA4404。
SacI、EcoRI和BamHI酶均购自宝生物(大连)
有限公司；DNA 片段回收试剂盒购自北京鼎国生
物工程公司；Southern杂交试剂盒(DIG high prime
labeling and detection starter kit II)购自Roche生物
公 司 。
烟草转化和筛选时，挑取农杆菌接种于添加
50 mg·L-1 卡那霉素的YEB液体培养基中，于27℃
下﹑以140次 ·min-1震荡培养过夜，以1%比例稀释
于新鲜YEB 中，于27℃下、以160 次 ·min-1 继续
培养。当OD600 达到 0.4~0.5时，将剪好的烟草叶
片放入其中，浸泡5~10 min，用无菌滤纸吸干表
面多余菌液后，接种于MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1
mg·L-1 NAA 的叶片再生培养基上，于 25℃下暗培
养2~3 d。当叶片周围出现肉眼可见的菌落时，转
入附加50 mg·L-1卡那霉素和300 mg·L-1头孢霉素的
再生培养基中培养。分化出绿色芽体后，转入
MS+0.1 mg·L-1 NAA+50 mg·L-1卡那霉素的培养基
中进行生根筛选。长出不定根后，移至营养钵中。
植物总 DNA 提取采用 CTAB 法。扩增 UGPase
基因所用引物为 35S：5 CTAACAGAACCGCCG-
TAAAGAC 3，35S/UR: 5 CGTAAGGCACAACC-
ACTTCATCG 3；扩增反义 4CL 基因所用引物为
35S/AR: 5 CTTCCCTTCACCTTACTGCTT 3；
PCR 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s、55℃
30 s、72℃ 1 min，30 个循环；72℃ 7 min。
Southern 杂交检测按试剂盒所示方法进行，
烟草总DNA用EcoRI进行酶切，以含35S启动子的
UGPase基因及反义4CL基因片段为模板标记探针。
测定Klason木质素及全纤维素含量时，取移
栽后生长 4 个月、生长状态一致的转基因和对照
植株，剥去树皮，取茎杆，测定 Klason 木质素
与全纤维素含量。每一株系和对照各取 3 株，参
照贾彩红等(2004)文中方法，测定结果取平均值。
观测转基因植株细胞壁时，分别取转基因及
对照植株相同部位茎杆，用冷冻切片机横切成5 mm
厚的薄片，放在 400× 显微镜下观测细胞壁厚度。
图1 质粒 pBU、pBa4CL 及 pBU-a4CL 结构
Fig.1 Structure of plasmid pBU, pBa4CL and pBU-a4CL
实验结果
1 烟草抗性植株的获得和PCR检测
烟草叶片经农杆菌浸染，并在筛选培养基上
培养 20 d 后，可见抗性芽分化，30 d 后抗性芽
可长至1 cm。将获得的抗性芽转移至生根筛选培
养基中，筛选出可正常生根的植株用于后期检
测。共获得抗性植株 113 株，其中转 UGPase 基
因的 34 株(标记为 U1~U34)、转反义 4CL 基因的
38株(标记为A1~A38)、转双价基因的41株(标记
为 T1~T41)。
抗性植株PCR的部分结果(图2)表明，以35S/
UR 为引物，转 UGPase 基因及双价基因植株均扩
增到约 700 bp 的目的条带；以 35S/AR 为引物，
转反义4CL基因及双价基因植株扩增到约1 000 bp
的目的条带，扩增产物均与阳性对照一致，而非
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转基因阴性对照没有扩增出相应条带。此结果初
步表明 UGPase 基因、反义 4CL 基因及双价基因
均已整合到烟草基因组中，本文 PCR 检测到的阳
性率分别为 86%、91% 和 79%。其中转双价基因
植株 PCR 阳性率较低，这可能与外源基因较大，
转化成功率低有关。但转双价基因植株均扩增到
UGPase基因及反义4CL 基因片段，双价基因共转
化率可达 10 0 %。
2 烟草抗性植株的Southern 杂交检测
PCR 检测呈阳性的转基因植株进行Southern
杂交分析的结果(图 3)显示，以UGPase 基因片段
为探针，转基因植株 U9、T28 均出现杂交信号，
而未转基因的植株未出现杂交信号；以反义 4CL
基因片段为探针，转基因植株 A21、T28 出现杂
交信号。此结果表明目的基因已成功整合到转基
因植株基因组中。其中，转双价基因植株 T28 用
2种探针检测均出现杂交信号，说明2个基因能够
共转化、共整合。
3 烟草中Klason木质素与全纤维素的测定
图4显示，转UGPase 基因烟草的Klason 木
质素含量没有变化，全纤维素含量有所升高，株
系 U9 升高幅度最大(为 6.3%)，株系 U3 只升高
2.4%；转反义4CL 基因烟草的全纤维素含量没有
变化，Klason 木质素含量降低29.6%~41.2%，其
中株系 A19 降低幅度最大；转双价基因烟草全纤
维素含量和Klason木质素含量均有变化，变化幅
度与转单价基因一致，全纤维素升高3.4%~6.8%，
Klason 木质素含量降低28.1%~42.8%，株系 T28
的纤维素升高6.8%而 Klason 木质素降低42.1%，
变化幅度最大，与转单价基因最好的结果一致。
可见通过双价基因转化，可以获得 2 个基因均高
图3 转基因烟草Southern杂交检测
Fig.3 Southern blotting analysis of transgenic tobacco
a 和 c：以 UGPase 基因片段为探针进行杂交；b 和 d：以反义 4CL 基因片段为探针进行杂交。M：0.12~21.2 kb DNA 分子量。
a 中 1 ：U 9 ；2 ：阴性对照；P ：质粒 p B U 。b 中 1 ：阴性对照；2 ：A 2 1 ；P ：质粒 p B a 4 C L 。c 和 d 中 1 ：T 2 8 ；2 ：
阴性对照；P：质粒 p B U - a 4 C L 。
图2 抗性烟草的PCR检测
Fig.2 PCR analysis of resistant tobacco
a ：以 3 5 S / U R 为引物检测 U G P a s e 基因；1 ：U 9 ；2 ：U 1 2 ；3 ：T 1 ；4 ：T 7 ；5：T 2 8 ；6 ：阴性对照；7 ：质粒 p B U ；
M ：D L 2 0 0 0 标准分子量。b ：以 3 5 S / A R 为引物检测反义 4 C L 基因；1 ：A 1 0 ；2 ：A 2 1 ；3 ：T 1 ；4 ：T 7 ；5 ：T 2 8 ；
6 ：阴性对照；7 ：质粒 p B a 4 C L ；M ：D L 2 0 0 0 标准分子量。
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效表达的转基因株系。
4 转基因烟草细胞壁的显微镜观察
Taylor等(2003)的研究结果表明，纤维素含
量与细胞壁厚度呈正相关。本文观察转基因株系
T28、U9、A23 与未转基因植株细胞壁厚度的结
果表明，全纤维素含量提高最多的T28与 U9细胞
壁比未转基因的厚，且细胞排列紧密，而全纤维
素含量没有变化的 A23 细胞壁厚度没有变化(图
图4 转基因烟草中的全纤维素和Klason木质素含量变化
Fig.4 Changes in holocellulose and Klason lignin contents of transgenic tobacco
对照：未转基因烟草；U 3 ~ U 2 7 ：转 U G P a s e 基因烟草；A 5 ~ A 2 3 ：转反义 4 C L 基因烟草；T 1 ~ T 3 6 ：转双价基因烟草。
图5 转基因烟草细胞壁的观察
Fig.5 Observation of cell wall of transgenic tobacco
a ：T 2 8 ；b ：U 9 ；c ：A 2 3 ；d ：未转基因烟草。
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5)。由此我们也认为细胞壁厚度在一定程度上能
够反映出纤维素含量的多少。
5 烟草茎杆颜色的检测
Kajita等(1996)的工作表明，转反义4CL基因
烟草的茎杆呈红褐色，并认为这是木质素中含有
过多的羟基肉桂酸造成的。Tsai 等(1998)认为，
调控木质素生物合成中的任何一个酶，只要影响
到松柏醛含量，即可引起木质素的颜色改变。贾
彩红等(2004)在抑制4CL基因表达的转基因毛白杨
中也见到，转基因植株的木质素含量降低多寡与
茎杆的颜色深浅和分布呈正相关。本文也有类似
的现象。木质素降低最多的 T 3 6 ，其茎杆褐色
深，且条带较宽，带数也较多；木质素降低较
少的 A5 茎杆褐色浅，且条带数量少；而木质素
含量没有变化的 U12 与未转基因烟草，其茎杆为
乳白色，无褐色条带状出现(图 6)。
图6 转基因烟草植株的茎杆颜色比较
Fig.6 Comparison of stem color in transgenic tobacco plants
1 ：U 1 2 ；2 ：A 5 ；3 ：T 3 6 ；4 ：未转基因烟草。
讨 论
Hu等(1998)与Li等(2003)根据杨树4CL基因
表达的受抑和木质素含量下降的同时纤维素含量呈
补偿性增加的结果推测，4CL 可能是碳水化合物
与木质素合成代谢的调控节点。但贾彩红等
(2004)的研究却得出相反的结论，她们将反义
4CL 基因转化至毛白杨中，转基因植株中木质素
含量下降最高为41.37%，但全纤维素含量与未转
基因的没有明显差别，据此她们认为 4CL 可能不
是碳水化合物和木质素合成代谢的调控节点。
Wei等(2005)根据火炬松4CL基因表达受抑和木质
素含量显著降低的同时纤维素含量呈补偿性增加的
结果认为，木本植物中纤维素和木质素的生成受
一种互补机制所调控，这种机制在草本植物中并
不一定存在。本文结果表明，烟草 4CL 基因表达
受抑和木质素含量明显降低时，纤维素含量并未
见增加，这一现象的出现，是由于 4CL 本身并不
是碳水化合物和木质素合成代谢的调控节点呢？还
是由于烟草属于草本植物的缘故呢？这有待进一步
探 讨。
高等植物中，UDPG 作为纤维素合成酶的高
能底物，其催化合成途径有2条：(1)蔗糖合成酶
途径；( 2 ) 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶途径
(Borovkov 等 1997)。转化 UGPase 基因是否会增
加UDPG 含量进而提高纤维素含量，至今只有Xue
等(1998)的这一篇报道。本文中，转化紫穗槐
UGPase 基因可提高烟草纤维素含量，说明外源
UGPase基因可能有调控纤维素合成的作用，但这
种提高的幅度不大，其原因也需深入研究。
若4CL 不是碳水化合物与木质素合成代谢的
调控节点，而又想获得纤维素合成增加的植物材
料，那么深入研究纤维素合成相关基因的调控是
非常重要的。本文中双价基因共转化率可达
100 %，转基因可分别表达，互不干扰，似乎可
用于植物品质改良。
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参考文献
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