全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 613
一种改进的烟草悬浮细胞继代方法
赵文明，杨万年 *
华中师范大学生命科学学院，武汉 430079
收稿 2006-12-07 修定 　2007-04-09
* 通讯作者(E-mail：zwmxp@mails.ccnu.edu.cn；Tel：
02 7-67 86 72 23 )。
在植物细胞悬浮培养过程中，对影响细胞系
均一性和质量的细胞团块形成的克服方式一般有2
种。一是分级过滤继代，即用不同目数的细胞筛
除去大的细胞团块和细胞碎片，将小细胞团和单
细胞转移到新培养基中作继代培养。此方法操作
繁琐，容易污染。另一种是取上层细胞悬液继
代，继代时先摇匀悬浮细胞，静置几秒钟后，用
移液管把一定体积的上层细胞悬浮转移到新的培养
基中培养(李浚明 2002；Chawla 2004)。此方法
操作较简单，但要得到好的悬浮细胞，必须频繁
继代且不易控制所转移细胞的质和量，转移细胞
时静置时间太短，大细胞团常常堵塞移液管口，
放置时间过长则会导致转移的细胞量过少，难于
形成细胞系。为此我们介绍一种改进的悬浮细胞继
代方法，操作简单，可以得到均一的悬浮细胞。
取大约 1 g烟草(Nicotiana tabacum L. cv Wis-
consin-38)愈伤组织，转入盛有 40 mL MS+0.5
mg·L-1 2,4-D+0.25 mg·L-1 KT培养基的150 mL 三角
瓶中，置于摇床上以 120 rpm的转速于 25 ℃下震
荡培养。每周继代 1次，取出一部分旧的培养基
转移到新鲜培养基中。1个月后，采用 2种方法
继代。一种仍采用普通的更换培养基方法，旧培
养基与新鲜培养基的比例为 1:4，新鲜培养基 20
mL，每 8 d继代 1次。另一种则采用改进的方法，
每 8 d继代 1次，旧培养基与新鲜培养基的比例
为 1:2，新鲜培养基为 20 mL。操作时用大拇指
将 5 mL移液器的按钮完全按下，让吸头伸到三角
瓶底。放松大拇指后快速提起移液器，再快速放
下，吸头仍旧伸到瓶底。这样细胞悬浮液会在提
起和放下过程中被吸起。如此回复 2~3次，可吸
到 5 mL的细胞悬浮液，然后转移到新鲜培养基
中。反复进行以上步骤。操作时要迅速，提起
移液器时不可脱离液面，即吸头口一直保持在细
胞悬浮液中。测定生长周期时，2种不同继代方
法的悬浮细胞各 3瓶，为便于抽干水分，先用 200
目尼龙滤器过滤，再用中速滤纸抽干。称量滤纸
和细胞的总重量减去滤纸的湿重(滤纸湿重预先称)
即为细胞鲜重。结果可以总结为以下两点。
(1)改进的方法所得到的悬浮细胞系以小细胞
团为主，呈淡黄色，没有大的细胞团(图 1-a)。一
般只需经过 2 次继代，即可得到分散性好的细
胞；(2)改进方法继代后的细胞周期约为 15 d，明
显分为滞后期、对数生长期、直线生长期和停滞
期(图 2)。对数生长期细胞倍增时间约为 2 d，这
·小方法·
图 1 两种继代方法得到的烟草悬浮细胞
a ：改进的方法；b ：普通的方法。
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图 2 烟草悬浮细胞系的生长周期
和李浚明(2002)的结果一致。对数生长期和直线 生长期长达 8 d，生长达到高峰时的细胞鲜重比刚
继代时的增加 21倍。而普通方法因继代的材料较
多，整个细胞周期约为 11 d，但生长周期的各个
时期不如前者明显，生长达到高峰时的细胞鲜重
增加约 3倍。改进方法的细胞周期容易确定，细
胞对数生长期长。
参考文献
李浚明(2002). 植物组织培养教程. 北京: 中国农业大学出版社,
78~80
Chawla HS (2004). Introduction to Plant Biotechnology. Beijing:
Science Press, 57~73