全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月1182
植物微原生质体的融合
吴紫云，华玉伟，黄华孙 *
中国热带农业科学院橡胶研究所，农业部热带作物栽培生理学重点开放实验室，海南儋州 571737
Plant Microprotoplast Fusion
WU Zi-Yun, HUA Yu-Wei, HUANG Hua-Sun*
Key Laboratory of Physiology of Tropical Crop of Ministry of Agriculture, Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical
Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China
提要：文章就植物微原生质体融合技术的基本原理和技术的应用作了介绍和展望。
关键词：体细胞杂交；微核化；微原生质体；微原生质体融合
收稿 2007-08-08 修定 2007-11-05
资助 国家自然科技资源平台项目(2005DKA21 000-5-11)。
* 通讯作者(E-mail：huayuwei667@yahoo.com.cn；Tel：
0 89 8-23 3 00 57 3)。
自从1972年Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏
烟草的体细胞杂种以来，体细胞杂交已在许多植
物的种内、种间、属间甚至科间成功实现。研
究重点由模式植物向重要农作物和经济作物转移，
同时，将体细胞杂交与常规选育程序相结合，在
农作物和经济植物的育种以及生产中的应用潜力已
开始显现(Heath和 Earle 1997；Grosser等 1998；
McGrath等 2002；Hu等 2002)。植物体细胞杂交
(plant somatic hybridization)是以原生质体培养为基
础，人工诱导不同亲本的原生质体融合，并通过
异核体的培养产生体细胞杂种的技术，包括对称
融合(symmetric protoplast fusion)和非对称融合
(asymmetric protoplast fusion)。前者是将供体植
物原生质体的整个基因组转移到受体中，这不仅
将目的基因转移到受体中，同时也将不利基因转
移到受体中，而且由于基因组不协调导致营养和
生殖生长发生异常(Liu等 2005)。后者是将供体植
物的原生质体的部分基因组转移到受体原生质体。
在融合前，往往先对一方亲本的原生质体进行射
线辐射、药物预处理，钝化细胞核，然后再和
另一亲本的原生质体融合。由于辐射等处理会造
成一方亲本部分核物质或全部核物质的丢失，非
对称融合在转移部分核物质或只保留一方亲本的核
物质形成非对称杂种或胞质杂种方面有其独特之
处，因而备受重视。尽管如此，但供体原生质
体经辐射处理后，其供体染色体会发生断裂或基
因丢失，从而会影响其在杂种后代中的遗传稳定
性(Famelaer等 1990；Wijbrandi等 1990)。
植物微原生质体融合(microprotoplast fusion)
(又称微细胞杂交、微核技术、微融合技术)是 20
世纪90年代发展起来的一项实现部分基因组转移
而又避免染色体损伤的新的不对称融合技术。迄
今，采用微原生质体融合技术已在多种植物中获
得微原生质体融合杂种( Ve r hoeven 等 1 9 9 1；
Ramulu等 1993，1994；Rutgers等 1997；Matthews
等 1999；Binsfeld等2000；Saito和Nakano 2002a；
Louzada等 2002)。本文对植物微原生质体融合技
术的基本原理以及这项技术的应用作介绍和展望。
1 植物微原生质体融合技术的原理
微原生质体融合技术最先是在人和其他哺乳
动物的研究中进行的，植物微原生质体融合是在
此基础上发展起来的将一种植物的一条或几条染色
体转移到另一种植物中的新的非对称原生质体融合
的方法。其原理是采用适当浓度的微核诱导剂，
包含DNA合成抑制剂和纺锤体毒素两大类，常用
的如秋水仙素( c o l c h i c i n e，C O L )、安磺灵
(oryzalin)、草胺磷除草剂(cremart)、甲基氨草磷
( a m i p r o p h o s - m e t h y l，A P M )、甲氨喋呤
(methotrexate，MTX)、氯苯胺灵(chlorpropham，
CIPC)等。这些药剂可使正在分裂的植物细胞停
留在有丝分裂中期，数小时后，染色体解开螺
旋，形成内含多个微原生质体的微核化细胞，每
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个微原生质体内含有一条或几条染色体，由于有
丝分裂停留在中期，每条染色体的两个姐妹染色
单体仍在一起，着丝点不分开。通过酶解去掉微
核化细胞的细胞壁获得微核化原生质体，再用离
心等技术分离出带有一条或几条染色体的微原生质
体，诱导其与完整的受体原生质体融合，从而实
现部分基因组的转移(图 1)。这种染色体的转移是
通过微核进行的，染色体不会受到损伤(罗立新
2003；车建美和赖钟雄 2000)。微原生质体融合
主要包括 3个步骤：微原生质体诱导、分离以及
富集、微原生质体融合和植株再生。
1.1 微原生质体诱导
1.1.1 微原生质体的材料 具有快速分生能力的植
物组织都可用于微核化，目前用于微核诱导的材
料主要有 2种。一是通过快速生长的胚性悬浮细
胞系(图 1)。通常，建立大量、稳定的胚性悬浮
细胞系(embryogenic cell suspension culture)是微核
的诱导和分离的基础，胚性悬浮细胞系是指在一
定条件下具有体细胞胚发生能力的细胞悬浮培养
物。由于胚性悬浮细胞系分散均匀，生长旺盛，
细胞内含物充实，可以分离得到大量有活力的原
生质体，并易培养，试验重复性好，悬浮细胞
系取材方便，不受季节和环境条件的限制等优
点，所以悬浮细胞系成为原生质体培养、细胞融
合、外源基因转化及细胞突变体筛选的极好材料
(McCormick 1993；Nagata和 Kumagai 1999；
Sharma 1999)，也成为微原生质体诱导的重要材
料。二是发育中小孢子母细胞(microsporocytes)。
由于高等植物减数分裂通常是同步的，所以只需
对小孢子母细胞纺锤丝进行阻断而不需积累中期细
胞，小孢子母细胞经过纺锤体毒素(或纺锤体抑制
剂、有丝分裂阻抑剂)处理，在减数分裂形成四
分体的过程中，胞质分裂即可形成大量的微核化
细胞(图 2)。Saito和Nakano (2002b)用以上两种材
料分别建立了有效的微原生质体制备方法——从
萱草(Hemerocallis hybrida)悬浮细胞制成体细胞微
原生质体和从发育中的麝香百合 ( L i l i u m
longiflorum)小孢子制成备配子微原生质体。研究
表明，通过花粉母细胞获得的微原生质体更有优
势，因为，不需要花多长时间和大量劳力就可以
建立和维持细胞悬浮系，毋需额外对细胞周期进
行同步化处理，甚至不用超速离心等。
1.1.2 微原生质体诱导的方法 植物细胞微核化研
究的早期，多用辐射和化学诱导处理，但这两种
方法都会导致植物遗传破坏，如染色体断裂和突
变等。后来采用适当浓度的有丝分裂阻抑剂处理
细胞，有人认为在细胞分裂过程中延长中期阻抑
剂处理，可以提高微核化的频率。R a mu l u 等
(1990)用COL (能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使
染色体停滞在分裂中期)、安磺灵(微管的解聚
剂，使微管分散的药剂，可与微管蛋白二聚体结
合，抑制微管的聚合)、APM (APM作用原理是
由于内源性 Ca2+浓度对核膜的形成有很大影响，
APM扰乱线粒体对钙的摄取，所以影响核的形
成)三种纺锤体毒素处理普通烟草( N i c o t i a n a
plumbaginifolia)悬浮细胞时发现，APM和安磺灵
比 COL抑制效果更强，微核化细胞的频率更多，
图 1 微原生质体融合的一般过程(Verhoeven等 1991)
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产生的微核更多。随后，他们又发现草胺磷除草
剂也能有效诱导植物细胞微核化，而且，他们认
为悬浮细胞通过草胺磷除草剂处理，中期染色不
发生着丝点分裂和染色单体分离，可直接转变成
微核。而且，悬浮细胞和原生质体的混合物用草
胺磷除草剂(3.7~15.0 µmol·L-1)处理 48 h后用含细
胞松驰素(cytochalasin-B，CB)的细胞壁水解酶和
草胺磷除草剂处理 18 h，微核化的频率显著高于
用草胺磷除草剂(3.7~15.0 µmol·L-1)处理 18 h的悬
浮细胞(Ramulu等 1994)。但用这些单一的试剂进
行处理往往存在有丝分裂中期指数不高，重复性
不好等问题。最近发展起来的利用羟基脲
(hydroxyurea，HU)和有丝分裂阻抑剂(或纺锤体毒
素)双阻断法诱导植物细胞有丝分裂同步化，获得
频率较高的有丝分裂中期指数(metaphase index，
MI) (Saito和Nakano 2001)。HU是一种DNA合成
的抑制剂，可暂时阻止细胞周期进程，使细胞停
留在DNA加倍的 S期，一旦除去HU后，细胞就
同步进入下一个时期，再用APM等有丝分裂阻抑
剂处理，使大量细胞停留在中期。陈成彬和宋文
芹(1999)用 HU和APM同步化诱导小麦、大麦、
黑麦、蚕豆、玉米、水稻等植物有丝分裂，其
有丝分裂中期指数可达 50%以上，中期染色体占
80%~90%，有丝分裂正常，未见染色体畸变现象。
1.2 微原生质体的分离和富集 微原生质体分离的
具体过程包括微核化原生质体的分离与纯化、微
核和微原生质体分离以及微原生质体的富集。在
微核形成过程中，着丝粒未分开，每个微核含有
一对或多对两个完全相同的姐妹染色单体。细胞
微核化后的溶液中加入细胞壁降解酶，以除去细
胞壁，其高速离心和反复洗涤后，可以得到纯化
后的原生质体。含较大基因组的亚原生质体和含
有较多数量染色体的微原生质体比含一条或几条染
色体的微原生质体的密度大，这可用密度梯度高
速离心加以分开，Ramulu等(1993)用渗虑(percoll)
密度梯度-超速离心法将微原生质体和原生质体分
离出来，完整的原生质体位于高糖浓度的等渗溶
液表层。分离过程中会产生不同类型的核，如G1
和 G 2 核、中期染色体、分离的姐妹染色单体、
微核等。在微核化缓冲液中，这些微核分散在微
原生质体中，再将得到的微原生质体通过不同孔
径的过滤器进行纯化成小的微原生质体。含一条
或少数几条染色体的微原生质体即可分离出来，
较大的亚二倍体微原生质体和微核则过滤掉。分
离出来的微原生质体可用显像密度计和流式细胞仪
检测(Ramulu等 1984；Binsfeld等 2000；Louzada
等 2002)。Louzada等(2002)将柑橘(Citrus spp.)的
悬浮细胞用APM处理后，用 Percoll密度梯度离
心，再用孔径为 20 µm的滤网过滤，在得到的微
原生质体中，75.2%的含有 1条染色体，17.1%
含有 2条，4.6% 含有 3条，2.0% 含有 5条和 5
条以上的染色体。
1.3 微原生质体融合 在人类和其他哺乳动物中，
微原生质体融合已是一门很成熟的技术。但在植
物中，这种技术还有很多需要优化。在哺乳动物
中，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)诱导和
微注射是最广泛使用的两种微融合方法。在植物
图 2 高等植物发育中的小孢子制备微原生质体的流程
(Saito和Nakano 2002b)
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中，目前主要还是采用类似动物的 PEG诱导并结
合高 Ca2+和高 pH的处理方法(Keller和Melchers
1973；Kao和Michayluc 1974)。
PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白
质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，
当 PEG分子量足够大时，可作为邻近原生质体表
面之间的分子桥而使之粘连(Benbadis和de vir ville
1982)。PEG也能连接 Ca2+等阳离子，Ca2+可在
一些负极化基团(如磷酸根离子)和 PEG之间形成
“钙桥”，而促进原生质体间的连接。高 Ca 2+和
高pH可增加质膜的流动性，因而也大大提高融合
频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作
用 。
PEG 既是促融剂又是渗透压稳定剂，一般
PEG浓度控制在 40%时的诱导效率比较高。低浓
度低分子量的 PEG促融效果不好，也容易导致原
生质体破裂。但高浓度 PEG 会导致原生质体收
缩，降低融合频率，而且过高浓度的 PEG 对原
生质体有毒害作用。Ca2+的作用主要是它是原生
质体间的联系者，不仅可促进原生质体之间的粘
合，而且可使这种粘合作用更为稳定，从而更好
地促进原生质体间的融合，另外，它还起着维持
原生质体与融合体之间稳定性的作用，防止他们
破裂，这种作用在许多物种的原生质体融合研究
中均得到证实(Keller和Melchers 1973；Kao和
Michayluc 1974；Benbadis和 de vir ville 1982)。
Ramulu等(1995，1996a)将马铃薯(Solanum
tuberosum)微原生质体与二倍体番茄(Lycopersicon
peruvianum)原生质体按1:1、2:1或3:1的比例混合
于培养皿中后，加入PEG4000 [终浓度为8%~10%
(W/V)]和W5培养液，融合 7 min后，吸去 PEG
和培养液，加入高 pH缓冲液(240 mmol·L-1 KCl、
100 mmol·L-1 CaCl2、3 mmol·L-1 MES，pH 7.0)处
理 20 min，微原生质体和原生质体混合物静置
后，加入诱导愈伤组织的固体培养基后进行培
养，得到了预期效果。Binsfeld等(2000)则采用
8% (W/V)的 PEG6000，另加 90 mmol.L-1甘露醇、
60 mmol·L-1 CaCl2、25 mmol·L-1甘氨酸和 6%
DMSO的混合溶液，没有用W5等培养液，融合
产物有 18%~20%的恢复生长。
1.4 植株再生和杂种鉴定 杂种后代基因组或染色
体组的组成主要取决于：转入受体原生质体中的
供体基因组片段；供体染色体在受体中的遗传稳
定性。后代染色体的组成有可能会出现以下三种
情况：一是 G2期的供体(一条染色体含两条完整
姐妹染色单体)与G2期的受体融合后，经过有丝分
裂，形成的杂种后代含有一条供体染色体。二是
G2期的供体(一条染色体含两条完整姐妹染色单体)
与G1期的受体融合后，受体细胞经S期－G2期－
M期后，形成的杂种后代含有两条完全相同的供
体染色体。三是 S期供体细胞与位于 S期以后的
受体细胞融合，由于供体细胞周期比受体细胞周
期早，供体体细胞的染色质会提早组装成染色
体，这种现象称为染色体未成熟的凝集(premature
chromosome condensation，PCC)，从而导致DNA
或染色体断裂，形成的杂种后代染色体可能会含
有完整的供体染色体或者供体DNA染色体片段，
也可能没有。
两种方法可以筛选出含有供体部分基因组的
杂种，一是在受体细胞中出现隐形互补基因的条
件致死突变；另一是供体基因中携带显性的药物
抗性。目前杂种后代分析的方法主要有卡那霉素
抗性分析(kanamycin resistance)、GUS基因活性检
测( G US a c t i v i t y )、D ot 印迹分析( d o t - b l o t
analysis)、Southern印迹杂交分析(southern-blot
analysis)、核中 DNA含量的流式细胞分析(flow
cytometric analysis of nuclear DNA content)和基因
组原位杂交分析(genomic in situ hybridization)等
(Ramulu等 1996a，b)。
获得微原生质体融合的杂种植株还与以下几
种情况有关：在微原生质体和原生质体的混合样
本中，微原生质体占相当大的一部分比例；微原
生质体与原生质体发生多重融合；供体和受体细
胞好的亲和性(能发生有效融合，供体基因在受体
中能稳定遗传) ；不可避免的体细胞变异(如供体
基因组双链重复，融合产物发生多态化) ；受体
具备诱导原生质体快速高效的再生植株的成熟技术
(Ramulu等 1992)。特别是在愈伤组织时期和杂种
再生这两个阶段最为重要，直接决定着实验的成
功与否。
2 影响微原生质体融合效率的因素
2.1 影响微原生质体诱导的因素 影响植物细胞微
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核化的因素很多，其中，以不同的微核诱导剂最
为重要。所用的微核诱导剂主要包括APM、HU、
安磺灵、cypermethrin、CIPC、COL、alphabro-
monaphthaline (ABN)、colcemid、8-hydrox-
yquinoline (8HQ)、cycloheximide等(Matthews等
1999)。这些诱导剂对不同植物、不同组织以及
不同材料的最佳浓度不同，应该做多次实验摸
索，不可盲目套用他人的实验结果。除了用不同
的微核诱导剂处理以外，还有其它几个必须考虑
的因素，如微核化细胞的分裂活性、供体物种或
基因型、植物的不同组织、细胞同步化水平、诱
导处理顺序、供体细胞生长速率等都是决定微核
化率大小的因素，Ramulu等(1988a，b)认为悬浮
细胞有丝分裂频率与微核化水平有很大关系。他
们(1988b)通过大量的比较实验发现，在相同处理
条件下，不同物种或基因型所得到的细胞微核化
水平不一样。一般来说，植物组织需更长的处理
时间，采用的纺锤体毒素浓度更高。这些植物组
织并不需要十分完整，相反，切成小块的组织可
能更有效。此外，药剂(如 APM和 CB)处理的顺
序不同，对微核化频率的影响也很大(Ramulu等
1991)。对于发育中的小孢子来说，还应该注意
小孢子的发育时间，一般来说，小孢子母细胞处
于终变期到减数分裂中期 I为最佳时间。
2.2 影响微原生质体分离的因素 对于配子微原生
质体分离来说，微原生质体分离过程主要涉及的
是细胞壁的降解和顺序过滤。悬浮细胞等一类材
料，还要用到连续密度梯度超速离心。细胞壁降
解得到的微核化的原生质体，其产率直接影响到
后面微原生体的产量。细胞壁能否彻底降解，主
要与细胞壁降解相关的酶有关系，目前常用的酶
有：纤维素酶(cellulase onozuka R-10、cellulase
onozuka RS、meicelase P)、果胶酶(pectolyase Y-
23、macerozyme R-10、macerozyme)、半纤维
素酶(hemicellulase H-2125、rhozyme HP-150)、崩
溃酶(driselase)。这些酶都没有固定的使用浓度，
一般以几种酶混合使用的效果为佳。对于悬浮细
胞来说，为了分离微原生质体，Ramulu 等(1993)
分离马铃薯微原生质体时，用了连续密度梯度超
速离心方法，离心后的离心管从上到底部会出现
一条大带和三条小带，需仔细的吸出这几条包含
有原生质体和微原生质体的带，然后从中富集微
原生质体。富集微原生质体时，他们采用了不连
续密度梯度超速离心和顺序过滤两种方法。通过
比较发现，顺序过滤比不连续密度梯度超速离心
更加有效。过滤时需选择合适孔径的尼龙网，孔
径过大，收集到的原生质体含有较多的染色体或
完整的原生质体；孔径过小，微原生体产率小甚
至得不到微原生质体。他们用的尼龙网其孔径分
别是 48、20、15、10、5 µm，大约有 80% 的
微原生质体DNA在 1至 4条染色体上，有近 90%
微原生质直径在 2.5~10 µm之间。
2.3 影响微原生质体融合的因素 供体微原生质体
和受体原生质体能否高效和高质融合，关键在融
合方法。目前有化学方法[NaNO3法、高 Ca2+和
高 pH法、PEG法、聚乙酸乙烯脂(PVA)及聚乙烯
吡咯烷酮(PVP)法]和电场诱导融合法。在植物
中，主要采用 PEG诱导并结合高 Ca2+和高 pH法
方法。PEG 诱导融合成功的关键是：PEG 的种
类、纯度、浓度、处理时间、原生质体的生理
状况和密度。PEG的分子量一般选用 1540、4000
或 6000，用 PEG6000的多一些。高 Ca2+和高 pH
溶液处理时间的长短也十分重要，时间过长，原
生质体损害严重，融合率降低；过短则不融合。
此外，供体微原生质体和受体原生质体的比例对
微融合也有一定的影响。
3 微原生质体融合技术在植物学研究中的应用
微原生质体融合技术已在百合属(Lilium) (Saito
和Nakano 2002a)、萱草属(Hemerocallis) (Binsfeld
等 2000)、茄属(Solanum) (Ramulu等 1994；
Rutgers等 1997；Matthews等 1999)、烟草属
(Nicotiana) (Verhoeven 和 Ramulu 1991；Ramulu
等 1993)、番茄属(Lycopersicon) (Ramulu等
1991)、甜菜属(Beta)和菲律宾木橘属(Swinglea)
(Louzada 等2002)等植物中成功获得了微原生质体
融合的杂种，在柑属(Citrus) (Zhang等 2006)中也
成功分离了微原生质体。Ramulu等(1996a，b)以
制备出的马铃薯(S. tuberosum)微原生质体与二倍体
番茄(L. peruvianum)正常原生质体融合后，获得
单体附加系，这一附加系只含有马铃薯的一条染
色体。
Ramulu等(1995；1996a，b)用 PEG诱导出
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含有一条或几条染色体(具有卡那霉素抗性和GUS
特性)的供体马铃薯(S. tuberosum)，其微原生质体
与正常的番茄(L. peruvianum)原生质体融合后得到
大量的再生植株，再生植株具有卡那霉素抗性和
GUS特性。Ramulu等(1995)分析 111株烟草微融
合再生植株形态的结果表明，其中有 19株通过微
融合直接所获得的单体附加系中有3 株可以检测到
标记基因的表达(KanR或GUS)。Rutgers等(1997)
用含有 npt II和Uid A基因的供体马铃薯微原生质
体与番茄原生质体融合，再生植株同时具有 npt II
和Uid A基因。基因原位杂交表明，这些植株含
有 2个 npt II和 1个Uid A基因的马铃薯供体染色
体和受体的全部染色体。Binsfeld等(2000)采用两
种多年生的供体向日葵(Helianthus giganteus和H.
maximiliani)的微原生质体与受体向日葵(H. annuus)
的胚轴原生质体融合后，得到的有 16个杂种后代
中期细胞中含有 2~8个附加染色体。这些都显示
微原生质体融合技术可以高效地将供体的目标性状
转移给受体。
4 结语
植物微原生质体融合技术已在多种植物中获
得成功应用。通过有性杂交将种群中优良性状如
高产和抗性基因集中于一体，需要较多群体和多
次杂交，而微原生质体融合可以避免有性杂交带
来的基因重组和交换，因此可在较少的融合杂种
中获得具有目标性状的融合杂种，从而大大提高
育种效率。植物微原生质体融合技术对非对称原
生质体融合进行了改进，它是经微核来转移染色
体，避免染色体操作所带来的染色体损伤，杂种
遗传稳定。而且，它是在细胞水平上进行一条或
几条染色体的转移，在一定程度上可克服杂交不
亲合或杂交不孕等造成的生殖隔离。同时，作物
的许多农艺性状、抗病虫以及抗胁迫性状多为数
量性状，由多基因编码，它们集中成串或散布在
染色体上，部分染色体转移将有利于这些性状导
入受体中。植物微融合技术也兼有细胞核融合和
细胞质融合的过程，杂种不仅含受体的全部细胞
核和细胞质，而且有部分的供体细胞核和细胞
质，基因组及胞质互作致使杂种在营养生长方面
可能超过受体植株，这对利用营养器官的植物来
讲是有意义的。因而，微原生质体融合技术在作
物种质创新和育种中有一定的潜在应用价值。
微原生质体融合技术是一种非常有效的获得
附加系的方法。这些附加系可以作为遗传学、分
子生物学的基础材料，如获得代换系或重组系、
推动物质渗入育种(introgressive breeding)、建立
特异染色体 -DNA文库(chromosome-specific DNA
libraries)、辐射杂种基因定位(radiation hybrid
mapping)等。附加系的获得也将有助于作物农艺
性状的遗传分析、基因表达调控、基因克隆等研
究如基因定位、研究染色体的三维结构和供体染
色体的空间排列以及它们与基因表达和转化的关
系。部分附加系甚至可能直接应用于育种实践。
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