全 文 ：植　物　学　报　 1994, 36( 12): 905— 910
Acta Bot anica Sinica
芸苔属花粉 -下胚轴原生质体融合
再生杂种小植株*
李昌功　周　嫦　杨弘远
(武汉大学生命科学学院植物生殖生物学研究室 ,武汉 430072)
摘　　要
从青菜 (Brassica chinensis L. )单胞中后期至二胞早期花粉分离出原生质体 ,用聚乙二醇
法诱导其与甘蓝型油菜 (B . napus L. )下胚轴原生质体融合。通过控制双亲原生质体的数量与
比率 ,提高了异源融合率。融合体在离体条件下发生细胞分裂 ,形成愈伤组织 ,再生了小植株。
染色体计数与酯酶同工酶酶谱分析初步证明获得了 1株异源三倍体 , 2株异源四倍体。 这是
以游离花粉时期的原生质体与体细胞原生质体融合 ,取得 “配子 -体细胞杂交”成功的首次报
道。
关键词　花粉原生质体 ;原生质体融合 ;配子 -体细胞杂交 ;青菜 ;甘蓝型油菜⒇
REGENERATION OF HYBRID PLANTLETSVIA POLLEN-
HYPOCOTYL PROTOPLAST FUSION IN BRASSICA SPP.
Li Chang-gong , Zhou Chang and Yang Hong-yuan
( Laborator y of Plant Reproductive Biolog y, College of Li fe Sciences Wuhan University, Wuhan 430072)
Abstract
It has been reported that “ gameto-somatic hybridization” was induced by fusion of
microspore tetrad protoplasts wi th somatic pro toplasts in Nicotiana and Petunia. How ever,
since the success of isolation of pollen pro toplasts in recent y ears, the use of pro toplasts at
pollen stage as one of the fusion partners in such hybridization is a novel experimentation.
Young pollen protoplasts w ere isolated f rom the pollen g rains of Brassica chinensis at mid-late
unicellular to early bicellular stage the pollens for 1. 5— 2. 5 h at 25℃ in a CPW solution
containing 0. 8% of cellulase, 0. 5% pectinase, 0. 1% pectolyase, 13% mannitol, 10%
⒇ 收稿日期: 1994-04-14　接受日期: 1994-07-26
　　在根尖压片与染色体计数工作中得到了宋运淳教授和刘立华高级工程师的热情指导 ,特表谢忱。
　* 国家自然科学基金资助课题。
g lucose, 0. 3% potassium dex tran sulphate and 3 mmol /L MES. The purified pollen proto-
plasts were then fused w ith the hypoco tyl protoplasts of B. napus by PEG method.
Heterokaryons were identified by means of visualization of the fluorescence f rom FITC-
prelabeled pollen protoplasts. In order to increase heterokaryons and reduce hypocotyl
homokary ons, the densti ty of hypocoty l protoplasts w ere lowered and the ratio of the
number of hypocoty l vs. pollen protoplasts w ere adjusted f rom 1∶ 3 to 1∶ 6. The fusion
products w ere cultured in a liquid KM8p medium supplemented wi th 0. 4 mol /L g lucose, 0.
8 mg /L 2, 4-D, 0. 25 mg /L N AA, 0. 5 mg /L BA, 500 mg /L glutamine and 3 mmol /L
MES where cell division and callus formation took place. The calli, af ter being t ransferred
to a M S medium supplemented w ith 2. 0 mg /L BA, 3% sucrose and 0. 4% agarose,
di fferentiated into a few shoots. The shoots w ere t ransferred onto a half-streng th M S
medium supplemented wi th 2% sucrose, 0. 1— 0. 2 mg /L N AA, 0. 5 mg /L IBA and 20%
potato juice fo r root formation. Finally , three plant lets w ere reg enerated. Chromosome
counts by root-tip squash method revealed that one plant let w as 2n= 48, corresponding to
an allot riploid resulted f rom a fusion betw een one pollen protoplast of B . chinensis ( 2n= 20)
and one hypocotyl protoplast of B. napus ( 2n= 38) , and the other tw o plantlets w ere 2n=
58, w hich might be an allotetraploid originated f rom a fusion betw een two pollen protoplasts
and one hypocotyl protoplast. The isozyme pat terns of leaf esterases showed that all the
three plantlets had bands characteristic of both parents. This is the first case of success in
“ gameto-somatic hybridization” by using pollen protoplasts rather than tet rad protoplasts as
the haploid partner.
Key words　 Pollen pro toplast; Protoplast fusion; Gameto-somatic hybridization;
Brassica chinensis; Brassica napus
植物性细胞 (广义的概念 )与体细胞的融合 ,最初是从小孢子四分体的实验开始的。
Pirrie和 Pow er首次将 N icotiana glutinosa四分体原生质体与 N . tabacum叶肉原生质体
融 合 , 获 得了 种间 杂 种植 株 , 并称 之为 “配子 -体细 胞 杂交” ( gameto-somatic
hybridization )
[1 ]。 类似的实验相继在烟草属与矮牵牛属的种间与种内杂交中获得成
功 [2- 4 ]。 但是 ,迄今还没有关于游离花粉的原生质体与体细胞原生质体融合成功的报道。
这是因为游离花粉外壁富含孢粉素 ,无法酶解。近年 ,花粉原生质体分离技术的突破为其
融合奠定了技术基础。本文以青菜幼嫩花粉原生质体与甘蓝型油菜下胚轴原生质体进行
融合与培养 ,再生了小植株 ,初步证明是种间杂种。
材 料 和 方 法
(一 )花粉原生质体的制备
将青菜 ( Brassica chinensis L. )品种“南京白”含单胞中后期至二胞早期的花蕾 ,置入分
离液 ( CPW [5 ]附加 13%甘露醇 , 10%葡萄糖 , 0. 3%葡聚糖硫酸钾 , 3 mmol /L MES, pH
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5. 6) ,压出花粉。经过滤、离心后 ,在酶液 (上述分离液附加 0. 8%纤维素酶 , 0. 5%果胶酶 ,
0. 1% pectolyase)内于 25℃酶解 1. 5— 2. 5 h。过滤、离心与洗涤后 ,得到纯化的花粉原生
质体 ,调整其密度至 3× 105- 6× 105个 /mL。
(二 )下胚轴原生质体的制备
纵剖甘蓝型油菜 (Brassica napus L. )品种“ 4312”无菌苗的下胚轴 ,置入质壁分离液
( CPW附加 13%甘露醇 ) 0. 5— 1. 0 h,转入酶液 ( CPW附加 0. 8%纤维素酶 , 0. 8%果胶
酶 , 6%甘露醇 , 4%蔗糖 , 3 mmol /L MES, pH 5. 6) , 25℃酶解 14— 18 h。过滤、离心、洗涤
后收集原生质体 ,调整至所需密度。
(三 )融合
将花粉原生质体与下胚轴原生质体悬浮液混合 ,用融合液 [40%聚乙二醇 ( PEG, MW
6000) , 6%葡萄糖 , 50 mmol /L CaCl2· 2H2O ]诱导融合。 参照 Terada等 [6 ]的方法并作修
改:先滴数滴融合液于培养皿底 ,再将原生质体混合液轻滴于其上 , 15— 30 min后加入
W5洗液 [ 7] ,静置 0. 5— 1 h ,再用 W5洗液洗涤 1— 2次后转入培养基进行培养。
(四 )培养
采用液体浅层培养法 ,培养基为 KM8p附加 0. 8 mg /L2, 4-D, 0. 25 mg /L N AA, 0. 5
mg /L BA, 500 mg /L谷氨酰胺 , 0. 4 mol /L葡萄糖 , 3 mmol /L MES, pH 5. 6。两周后 ,每周
加 1次稀释培养基 ( K3附加 0. 3 mg /L 2, 4-D, 0. 5 mg /L BA, 3%蔗糖 , pH 5. 6)。在扩增培
养基 ( M S附加 0. 2 mg /L 2, 4-D, 0. 5 mg /L BA, 3%蔗糖 , 0. 4%琼脂糖 , pH 5. 6)上增殖愈
伤组织。在分化培养基 ( M S附加 0— 0. 2 mg /L 2, 4-D, 1— 3 mg /L BA, 3%蔗糖 , 0. 4%琼
脂糖 , pH 5. 6)上诱导愈伤组织分化出芽。 在生根培养基 ( 1 /2 M S附加 0. 1— 0. 2 mg /L
N AA, 0. 5 mg /L IBA, 2%蔗糖 , 20%马铃薯汁 , pH 5. 6)上促进生根。
(五 )显微观察
用 Olympus IM T-2倒置显微镜观察。部分花粉原生质体用异硫氰酸荧光素 ( F ITC)
5— 10μg /mL活染 ,充分洗涤后再进行融合试验 ,以观察荧光标记的融合体。融合率计算
方法: 异源融合率= (与花粉原生质体融合的下胚轴原生质体数 /下胚轴原生质体总数 )
× 100%。同源融合率= (参加同源融合的下胚轴原生质体数 /下胚轴原生质体总数 )
× 100%。
(六 )染色体计数
再生植株根尖用饱和对二氯苯水溶液处理 3 h,甲醇∶乙酸 ( 3∶ 1)固定 2 h以上 , 1
mol /L HCl 60℃水解 10 min,改良卡宝品红染色压片。
(七 )酯酶同工酶酶谱分析
用聚丙烯酰胺不连续体系垂直板凝胶电泳法。 浓缩胶 4% ,分离胶 10% ,电极缓冲液
为 Tris-甘氨酸缓冲液 , pH 8. 7。样品提取液为 pH 8. 2的磷酸缓冲液。稳定电压 20 V /cm。
0. 1%醋酸 -α-萘酯 , 0. 1%醋酸 -β -萘酯 , 0. 1%坚牢蓝 RR盐中染色。
实 验 结 果
(一 )青菜幼嫩花粉原生质体的分离
幼嫩花粉酶解 1. 5— 2. 5 h后释放出原生质体 ,分离率约 20%— 40% (图版Ⅰ , 1)。延
90712期　　　　　　李昌功等: 芸苔属花粉-下胚轴原生质体融合再生杂种小植株
长酶解时间不能提高分离率 ,反而引起原生质体破损。酶解后的悬浮液中除花粉原生质体
外 ,尚有花粉粒 ,花粉外壁等杂质。采用 10μm孔径尼龙筛网过滤可得到较纯净的花粉原
生质体群体 (图版Ⅰ , 2)。
(二 )花粉原生质体与下胚轴原生质体的融合
青菜幼嫩花粉原生质体与甘蓝型油菜下胚轴原生质体形态不同 ,大小悬殊 ,容易辨别
(图版Ⅰ , 2、 3)。所用的融合液能有效地诱导这两种原生质体融合 ,但形成的异源融合体在
形态上很难与下胚轴原生质体区分。用 FITC预先标记的花粉原生质体进行融合 ,可清楚
地观察到花粉原生质体与其异源融合体均呈特异的绿色荧光 ,使之明显地区别于下胚轴
原生质体 (图版Ⅰ , 3— 6)。
为了提高异源融合效果 ,试验了双亲原生质体密度与数量比率的影响。 表 1显示 ,当
双亲原生质体的密度均为 15× 104个 /mL、比率为 1∶ 1时 ,总的异源融合率为 26. 8% ,下
胚轴原生质体同源融合率为 24. 7% 。降低下胚轴原生质体的密度 ,提高花粉原生质体的
密度 ,使二者的比率改变为 1∶ 3— 1∶ 6时 ,异源融合率提高到 40. 8%— 52. 7% ,同源融
合率则相应下降。但如果下胚轴原生质体密度过低 ,虽双亲数量比率达 1∶ 9,异源融合率
却不进一步提高。
表 1　原生质体密度与比率对花粉-下胚轴原生质体融合效果的影响
Table 1　 Effect of density and ratio of pollen-hypocotyl pro toplasts on fusion results
下胚轴
原生质体
Hypocotyl
protoplas t
( 104 /m L)
花粉
原生质体
Pollen
protoplast
( 104 /mL)
比率
Ratio
统计的下胚轴
原生质体数
Hypocotyl
p rotoplast
counted
异源融合体
Heterokaryons
一对一融合 1)
“One to one”
fusion
一对二以上融合
“ One to tw o or
more” fusion
No. % No. %
总计
Total
(% )
下胚轴
同源融合体
Hypocotyl
homok aryons
No. %
15 15 1∶ 1 535 99 18. 5 44 8. 3 26. 8 132 24. 7
10 30 1∶ 3 517 127 24. 6 83 16. 2 40. 8 106 20. 5
7 42 1∶ 6 296 102 34. 5 54 18. 2 52. 7 37 12. 5
5 45 1∶ 9 339 112 33. 0 58 17. 1 50. 1 24 7. 0
　　
1)一对一融合:一个下胚轴原生质体与一个花粉原生质体之间的融合。 2)一对二以上融合:一个下胚轴原生质体
和两个及两个以上花粉原生质体之间的融合。
1)“ One to one” fusion means a fusion betw een one hypocotyl protoplast and one pollen protoplas t. 2) “ One to tw o or
more” fusion means the fusion betw een one h ypocotyl protoplas t and two or more pollen protoplas ts.
(三 )融合后的发育与植株再生
融合后原生质体在适合的培养基上能持续发育。培养 2— 3 d开始第 1次细胞分裂
(图版Ⅰ , 7) ; 4— 5 d第 2次分裂 (图版Ⅰ , 8) ; 2周左右形成肉眼可见的多细胞团 (图版Ⅰ ,
9)。愈伤组织经增殖后转到分化培养基上 (图版Ⅰ , 10) ,有显著的褐化死亡现象 ,存活较好
的 31块愈伤组织中仅有 4块出芽 ,分化率为 12. 9% 。以后进一步诱导生根 ,形成完整小
植株。 在存活的 3株 (图版Ⅱ , 11— 13)中 ,叶片不同程度皱缩 ,生长亦较缓慢 ,与油菜原生
质体再生植株相比 ,在形态与发育上有一定区别。
(四 )再生植株的鉴定
1. 染色体计数　青菜 2n= 20;甘蓝型油菜 2n= 38(图版Ⅱ , 18、 19)。对融合后再生的
1号苗 5个根尖 , 2号苗 8个根尖 , 3号苗 5个根尖进行染色体计数 ,结果表明 , 1号苗 2n
= 48, 2号与 3号苗 2n= 58(图版Ⅱ , 15— 17) ,均与双亲染色体数及油菜下胚轴原生质体
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同源融合产物的染色体数 (应为 2n= 76)不同。 据此 ,初步推断 1号苗可能源于 1个青菜
花粉原生质体与 1个油菜下胚轴原生质体的融合 ,为异源三倍体 ; 2、 3号苗可能源于 2个
青菜花粉原生质体和 1个油菜下胚轴原生质体的融合 ,为异源四倍体。
2. 酯酶同工酶分析　亲本不同个体的酯酶酶谱是稳定的。 融合后原生质体再生的 3
个小植株既有青菜特有的酶带 ( Rf 0. 43, 0. 48) ,又有甘蓝型油菜所特有的酶带 ( Rf 0. 39,
0. 55) ,显示出杂种酶谱的特征 (图版Ⅱ , 14)。
讨　　论
花粉原生质体兼具花粉、单倍体、原生质体三方面的特性 ,是植物细胞工程中有特色
的实验体系。幼嫩花粉原生质体具有脱分化的潜力 ,但其离体培养迄今仅在萱草中取得一
定进展 [8 ] ,尚未能再生植株。本文作者曾试探过青菜、甘蓝型油菜与紫菜苔 3种芸苔属植
物的幼嫩花粉原生质体培养 ,仅在青菜中诱导了 1次细胞分裂。另一途径则是利用花粉原
生质体与具有再生能力的体细胞原生质体融合 ,开展“配子 -体细胞杂交”。本实验证实了
这一思路的可行性。
杂种细胞筛选是原生质体融合工作中的重要环节。 花粉原生质体迄今不能单独再生
植株 ,因而在融合实验中可以简化筛选程序 ,只需考虑体细胞亲本一方再生植株。前人在
四分体与体细胞融合研究中 ,先后利用营养缺陷型 [1 ]、白化突变体 [2, 3 ]、显性的抗性基因 [ 4]
等特殊材料作亲本 ,成功地筛选出杂种。本实验没有采用这类材料 ,而是借鉴以前大、小两
种原生质体融合实验的经验 [9 ] ,降低大原生质体的密度以及调整两种原生质体的数量比
率 ,以提高异源融合率。本实验获得的 3个小植株 ,可能分别为异源三倍体和异源四倍体 ,
均不可能为体细胞原生质体单独发育或其同源融合的产物。 酯酶同工酶酶谱分析为其杂
种特性提供了佐证。
本实验所采用的幼嫩花粉原生质体为单胞中、后期至二胞早期的。 从理论上推测 ,参
加融合的应为单胞时期的小孢子核或二胞时期的营养核 ;生殖细胞因有原生质膜包围 ,似
不可能参与核的融合。前人在四分体与体细胞原生质体融合的研究中 ,仅着重于遗传学鉴
定。我们认为 ,今后在“配子-体细胞杂交”工作中 ,对于融合后的细胞学行为仍有深入研究
的必要。
参 考 文 献
1　 Pirrie A, Pow er J B. The production of fertile triploid somatic h yb rid plan ts ( Nicot iana glut inosa ( n )+ N . tabacum
( 2n) via gametic: somatic protoplas t fusion. Theor Appl Genet , 1986. 72: 48— 52
2　 Lee C H, Pow er J B. Int raspecif ic gametosomatic h ybridi zation in Petunia h ybrida . Plant Cel l Rep, 1988. 7: 17— 18
3　 Lee C H, Pow er J B. In tra- and interspecifi c gametosomatic hybridization wi thin th e genus Petunia. Plant Cell Tiss
Org Cul t , 1988. 12: 197— 200
4　 Pental D, M ukh opadhyay A, Grover A et al . A selection method for the synth esi s of triploid h ybrids by fusion of
microspore protoplas ts ( n) w ith somatic cell protoplas ts ( 2n) . Theor Appl Genet , 1988. 76: 237— 243
5　 Banks M S, Evans P K. A comparison of the isolation and culture of m esoph yll protoplasts from several Nicot iana
species and thei r hybrids. Plant Sci Lett , 1976. 7: 409— 416
6　 Terada R, Yamashito Y, Nishibayashi S et al. Somatic h ybrid s betw een B rassica oleracea and B . campestr is: selection
by the use of iodoacetamide inactivation and regen eration abili ty. Theor Appl Genet , 1987. 73: 379— 384
7　 M enczel L, Nagy I, Kizz Z R et al . Streptomycin-resis tan t and sensi tive somatic hybrids of Nicot iana tabacum+ N .
knightiana: correlation of resis tance of N . tabacum plastid s. Theor A ppl Genet , 1981. 59: 191— 195
90912期　　　　　　李昌功等: 芸苔属花粉-下胚轴原生质体融合再生杂种小植株
8　周嫦 . 萱草花粉原生质体培养启动胚胎发生分裂 . 植物学报 , 1989. 31: 409— 413
9　莫永胜 ,杨弘远 . 几种具二细胞型花粉植物精细胞的分离和融合 . 植物学报 , 1992. 34: 688— 697
图 版 说 明
图 版 Ⅰ
1. 刚分离的幼嫩花粉原生质体群体。× 400　 2.纯化的花粉原生质体群体。× 400　 3. 纯化的下胚轴原生质体群
体。× 260　 4— 6. FITC标记的幼嫩花粉原生质体与下胚轴原生质体融合。 4. 融合前的荧光 -明视野图像。× 550　 5.
融合后异核体的明视野图像。× 550　 6. 图 5的相应荧光图像。× 550　 7— 10.培养的融合后原生质体进行细胞分裂
与形成愈伤组织。 7.第 1次分裂 (培养 3 d )。× 320　 8.第 2次分裂 (培养 5 d )。× 320　 9.形成的多细胞团 (培养 11
d)。 × 100　 10. 形成的愈伤组织。
图 版 Ⅱ
11— 13.再生的杂种小植株。 11. 1号苗。 12. 2号苗。 13. 3号苗。 14.杂种小植株及其亲本的叶片酯酶同工酶酶
谱 ,从左至右依次为: A. 青菜 ; B. 1号苗 ; C. 2号苗 ; D. 3号苗 ; E. 甘蓝型油菜 ; F. 青菜与甘蓝型油菜的混合样品的
酶谱。 箭头示杂种植株的互补酶带位置。 15— 19.杂种小植株及其亲本的根尖染色体。 15. 1号苗 ( 2n= 48) ; 16. 2号
苗 ( 2n= 58) ; 17. 3号苗 ( 2n= 58)。 18.青菜 ( 2n= 20)。 19. 甘蓝型油菜 ( 2n= 38)。
Explanation of Plates
PlateⅠ
Fig. 1. A population of young pollen protoplast s just released f rom the pollen g rains.× 400　 Fig. 2. A population of
puri fied pollen protoplas ts.× 400　 Fig. 3. A population of pu rifi ed h ypocotyl protoplast s.× 260　 Figs. 4— 6. Fusion
betw een an FITC-prelabeled pollen protoplast and a h ypocotyl protoplast.× 550　 Fig. 4. Fluorescence-bright fi eld image of
a pai r of protoplast s just before fusion. Fig. 5. Brigh tfi eld image of a heterokaryon jus t af ter fusion. Fig. 6. Fluorescence
image corresponding to Fig. 5. Figs. 7— 10. Cell division and callus formation of cul tured PEG-treated protoplast s. Fig. 7.
Fi rst divi sion af ter 3 days of culture.× 320　 Fig. 8. Second division af ter 5 days of cul ture.× 320　 Fig. 9. Multicellular
cluster af ter 11 days of culture.× 100　 Fig. 10. Form ed callus.
PlateⅡ
Figs. 11— 13. Regenerated plant let s. Fig. 11. No. 1 plantlet. Fig. 12. No. 2 plantlet. Fig. 13. No. 3 plantlet. Fig. 14.
Leaf es terases i s ozyme pat terns of th e pollen-somatic hybrids and th ei r parents. From lef t t o right: A. Brassica chinensis.
B. No. 1 plant let. C. No. 2 plant let. D. No. 3 plan tlet. E. B . napus. F. Ex t ract mix ture of B. chinensis and B .napus ( 1∶
1 ) . Arrow s show complemen tary band sites of th e h ybrid plant let s. Figs. 15— 19. Root-tip ch romosomes of th e pollen-
somat ic h ybrid s and thei r parents. Fig. 15. No. 1 plantlet ( 2n= 48) . Fig. 16. No. 2 plant let ( 2n= 58) . Fig. 17. No. 3 plantlet
( 2n= 58) . Fig. 18. B. chinensis ( 2n= 20) . Fig. 19.B .napus ( 2n= 38) .
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李昌功等:芸苔属花粉 -下胚轴原生质体融合再生杂种小植株 图 版 Ⅰ
Li Chang- gong et al.: Regeneration of Hybrid Plant lets via Pollen-hypocoty l　　 Protoplast Fusion in Brassica spp. Plate Ⅰ
See explanation at the end of tex t
李昌功等:图版Ⅱ Li Chang- gong et al.: Pla teⅡ
See explanation at the end of tex t