全 文 ：从葡蟠刀o r。二。二 tl’a Ka z l’ nok z’ (构树 )
叶肉原生质体到植株再生
冈成 美
引 言
通过体细胞杂交和操纵原生质体转移来
改 良作物是育种方法的一个新途径 , 木本植
物也是如此 ,有着优良性状的中选植株 ,可 以
用常规的方法或试管内的繁殖技术进行无性
繁殖 。
原生质体培养植株再生是运用原生质体
技术的先决条件 , 但在木本植物上 , 这方面
可用 的资料甚少 。 针叶树方面 , 达到的最先
进阶段是从花旗松 、 海岸松 、 大果松的子叶
分离的原生质体 , 及从扭叶松的细胞悬浮液
培养获得了细胞团 。 在阔叶树方面 , 已报导
从苹果属愈伤组织 , 葡萄属愈伤组织和花揪
属茎尖等的原生质体再生愈伤组织 , 但未见
有器官的发生 。 仅有的例外是柑桔类 , 从珠
心愈伤组织原生质体通过胚胎发生再生了新
植株 。
实际上 , 在木本植物方面 , 迄今还未见
有 阐述从叶肉原生质体培养获得能繁殖的植
株再生的报导 。 本文描述了木本植物从葡蟠
〔B r o u s : o o e t f a aK z i n o壳公(构树 ) 〕的叶肉原生
质体获得植株再生的培养过程 。 构树和桑树
同属桑料 。
材料与方法
新梢培养物的发生与维持
采于日本蚕丝试验场的 构 树 种 子 , 用
10 % (体积比 ) 的次氯酸钠溶液 (含有效氯
约 10 % ) 表面消毒 10 分钟 , 用无菌蒸馏水冲
洗三次 , 然后在含有 2 %蔗糖 , 0 . 8% 琼 脂
的M S基本培养基上无菌发芽 。 从 40 天 苗 龄
大山胜夫
的实生苗上切下带有子叶和一对初生叶的新
梢外植体 ,移植到含有 1 m g’ 1一 ` BA 的M S培
养基上 。 每隔 30 天 , 重复地将生有若干幼叶
和部分发育腋芽增殖的新梢 , 转 移 到 含 有
o
.
Zm .g l一 ’ B A 的 M S 培养基上 , 置 于 25 士
1
.
5℃ , 光周期为 12 小时 (温一白荧 光 灯 ,
3 , 0 0一 4 , 0 0勒克司 )的培养室中培养 。
原生质体的分离
从 30 一 50 天梢龄的新梢上采取长 30 一 40
毫米 的叶片 , 将其切成 1一 2 毫米见方的小
块 。 在注有 5 毫升酶液 ( P H S . 5) 的20 毫升爱
伦美氏锥形烧瓶中培养。 酶液含有 o . SM (摩
尔 )甘露醇 , 0 . 05 %果胶酶 y 23 和 1 %纤维素
酶On oz uk 。 R 一 ` “ 。 将烧瓶置放在旋转振荡 器
上 (每分钟75 一 10 0转 ) , 在 25 ℃漫射光下培
养 3 小时 ,酶的混合物通过 一 层 iM r ac lot h滤
膜 , 然后在 1 o Og( 重力加速度 )下离心 2分钟
沉降分离出原生质体 。 用 巴斯德移吸管去除
上清液后 , 将原生质体重新悬 浮在 5 m 10 . 5
M甘露醇水溶液中 , 在 1 0 09 下离心 2分钟 , 经
2 次 以上的清洗 , 随之用血球计数器测定原
生质体的密度 , 最后将原生质体悬浮在培养
基上进行试验 。 酶溶液和所有的供原生质体
培养的培养基都要经微孔滤 膜 ( 0 . 4 5件m ) 消
毒 。
原生质体的培养
将原生质体培养在含有 1 . 5毫升液 体 培
文中缩写说明 : N A A : a 一奈 乙 酸 ; a气 : 6节基嚓岭 ;
峨 一D : 2 , 4一二氯苯氧 乙酸 。
养基的 35 义 1 0毫米a Fc l。 。塑料培养皿中 , 培
养皿用石蜡封口并将其置于湿润的塑料容器
内 。 常用的培养基是改 良八仃培养 基 , 含 有
z o o m g
·
I一 I N H 4 N O 3
、
l 0 0 0 m g
·
I
一 `
K N O
3 、
3 7 0m g
·
I一 ` M g S O
` · 7 H
:
O
、
2 2 0 m g
·
l一 ’ C a C I :
1 一 ` · ZH ZO
、
1 7 0 m g
.
I一 ` K H : P O 4及 M S 的微
量元素和铁 ;还含有。 . 5川 g · I一 `烟酸 、 0 . 51 1 9 .
l 一 `盐酸毗哆醇 , I ln g · I一 `盐酸硫胺 素 、 10 0
切 9 . 1一 `肌醇 、 I Om g · I 一 ’ 葡 萄糖和 7 2 . 99 · l一 `
( o
.
4M )甘露醇 。 激素是 o . Zm g . I一 ’ N A A 和
o
.
l m g
·
I一 ’ B A
。培养基的 p H 调节到 5 . 6 。 所
有培养物在黑暗下培养 8 周 , 培养基无须更
换或稀释 。 将诱导出的原生质体小愈伤组织
转移到含有 0 。 8%琼脂的芽再生培养基 的 表
面上 ,在 25 士 1 . 5℃ , 光周期为 12小时 (温一 白
荧光灯 3 , 0 0一 4 , 0 0勒克司 )的环境 中培养 。
结果证实了一个普遍的趋向 , 在原生质体培
养中 , 蔗糖差于葡萄糖 。
生长素和细胞分裂素对于原生质体的分
裂是必需的 , N A A 似乎 比 2 , 4 一 D有 更 好 的
增殖效果 。 N A A和 B A的最适浓 度 分 别 为
0
.
1一 1和 0 · l m g · I一 ` 。
表 1 N H ` N O 3对培养8周后葡蟠原生质体
细胞群落形成的影响
N H ` N O 3浓度 a )
重复 1
群落形成的程度 b )
3 4
o m g
·
l一 1
1 00
2 00
4 10
8 2 5
I G50
十 十 十 十 十 十 + 十 十 十
+ 十 十 + + + + + 十 十 + 十 +
+ + + + + + 十 + +
护 , , . . . . . . . 、 r ,门 , 巴 .内 , 』一 , . . 吧竺 , , , 护 . , , 尸~ 州啥 , 碑 , . 『 , . , 口 . ~ 下 , , 一卜 ~ 一 甲曰, , ~ ` 尸 一一 , . . 和甲 , r r ~ , . 咋, . , , . 目 创~ , ~ , , , .
结果与讨论
在培养皿内生长的叶材料每 1 0 毫 克 鲜
重可产生 1 一 2 x 1 0 ”个原生质体 , 原生质体的
直径范围为 1 0 一 2 。微米 。 M S培养基能使细胞
壁再生 , 偶尔也会发生未形成细胞群落的细
胞分裂 , 这是由于这些细胞团块逐渐变成褐
色之故。在八昭培养基上细胞的环死现象是由
于高浓度的氮 ,特别是由于钱盐 。这一问题可
以用改良的 八峨夕培养基来克服 , 所谓改 良的
M S培养基将刀万 ;入0 5减少到 20 0m g · I一 ` , 这
一改良培养基维持了细胞分裂并且形成了群
落。 有时原生质体还能生长在含有尺四 O 。作
为唯一氮源的培养基中 , 但是低水平 ( 1 0 0一
40 Om g
·
I
’ ` )刃万 、刀O 。 的存在再加 大叭心 。 其
效果更好 (表 1 ) 。 还 有 报 导 , 在 马 铃 薯
场 e妙 e sr f c o n和 A s to r a c e a e 的原生质体的培
养中 , 高浓度的馁盐有着有害的影响 。
另一个影响维持细胞分裂的临界因子是
糖的种类 。 在用蔗糖或果糖时 , 有时细胞分
裂能发生 , 但其子细胞的原生质很少 , 没有
淀粉的积累而最后停止分裂 , 相反 , 葡萄糖
能维持细胞分裂并形成了群落 (表 2 ) 。 这一
a )
. 其他主要盐类有 : 9 5 0功 g · l一 〕 K N 0 3 . s 7。川 g · l一 I M g -
5 0 ` · 7 H 0 2
、
2 2 0m g
·
l
一 I C a C I:
·
ZH : O 和 1 7 0 m g · 1一 1
K H : P O ;
。
b )
. 肉眼评估 : 一 无 , 十 差 ; + + 好 , + + 千 极好 。
表 2 糖类对培养 8周后葡蟠原生质体细
胞群落形成的影响
群落形成的程度 a)
重复 1 2
蔗搪 2 %
果糖 2 %
葡萄糖 2 % + + + + + + + + + + + + + +
a )同表 .1
从原生质体形状改变来判断 , 在改 良的
M S培养基上培养时 , 在 3一 7天里 ,原生质体
体积增大 , 重新形成了细胞壁 。 细胞壁的再生
通常与频繁的发芽相关联 。 在导出芽的隆起
部可以看到活跃的细胞环流 , 有时由于母细
胞本身也是次生原生质体 , 它会与母细胞完
全分开 。 有趣的是这一萌芽隆起现象并不妨
害进一步的细胞分裂 , 而且是导致随之而来
的有丝分裂的细胞壁合成活跃的象征 。 原生
质体的首次分裂 ,大多培养10 一20 天间可见 ,
饲 料 效 率 的 营 养 生 理 学 分 析
福田纪文
饲料效率是指产品与生产这些产品所需
的饲料消费量的比值 。 对蚕来说 , 饲料效率
就是产丝量或产卵量对所耗用的桑叶或人工
饲料的比值 。 本研究从蚕的饲料效率中具有
重要作用的蚕对饲料的消化率着眼 , 对现行
蚕品种对不同配方的人工饲料的消化能力进
行了试验 。 其结果不仅有助于开发饲料效率
高的人工饲料 , 而且能给以提高饲料效率为
目标的桑 、 蚕品种改良指出一个方向。
一 、 实验方法
1
. 加入人工饲料中的营养物质的 消 化
率的测定方法 : 以一定配方的人工饲料为对
照饲料 , 以待测营养物质取代原配方中的纤
维素粉组成试验饲料 , 以对照饲料的消化率
为 a , 试验饲料的消化率为 b , 对照饲料中纤
维素粉的含量百分比为 C , 则被测营养物质
的消化率 y为 : y = (b 一 a) c/ 。
2
. 测定试验饲料和对照饲料消化 率 的
方法 :
( 1) 常用方法 : 以食下干物量减去粪尿
的干物量求出消化量 , 消化量占食下干物量
的百分率即消化率 (正确地 说 是 近 似 消 化
率 ) 。
(2 ) 氧化铁法 : 在人工饲料中加入一定
量 的铁砂后喂蚕 , 将排泄的粪尿加水磨碎 ,用
磁铁回收铁砂 , 算出食下量及消化率 。
3
. 加入人工饲料的营养物质的配 制 方
法 :
( 1) 大豆类营养物质 : 提纯大豆蛋白 (含
蛋自9 0% ) 、 高蛋白豆饼 (含蛋白70 % ) 、 脱脂
大豆粉 (含蛋白 40 % ) 、 冻豆腐 、 黄豆面 、 及
此时 , 叶绿体在形态学上已经退化 , 随后淀
粉粒在质体中积累 。
在 4 周 内 ,持续的细胞分裂形成了群落 ,
再过 4 周 , 细胞群落发育成肉眼可见的小愈
伤组织 。 在群落中有些细胞分化成管状分子 。
在一个用改良M S培养基的实验中 , 其 布满
效率 ( 用分裂的原生质体数占原生质体总数
的百分率来表示 ) ,在培养 4 周后 ,约为 10 % 。
当直径 0 . 1一工毫米的 25 块小愈伤组织转
移到含有 0 . l m g . 卜` N A A和 l m g . l一 ’ B A 而不
含甘露醇的 30 毫升M S改良培养基中 ,有 45 %
的接种体体积增大 , 颜色转绿 , 平均有 41 %
的生长小愈伤组织在 20 一30 天内出现了新梢
芽的再生长 。在其他的激素组合 中 , 如 0 . l m g
l
一 ` N A A 加 0 . i m g · l一 ` B A和 i m g · l一 ` N A A 和
1m g’ l一 ` B A 中 , 小愈伤组织有增殖 , 但形成
的芽较稀少 。 把形成愈伤组织 的芽转移到含
有 0 . 1一 l m g . l一 ` B A 的M S 培养基中 , 产生
了大量的小新梢 , 它们大多矮小 , 但也有些
伸长正常。 在转移到含 有 o . 05 m g . l一 ` N A A
的培养基中 , 1 4个新梢中有 9 个在 2 一 3 周
内长出了根 。
若干作者曾经从各种角度讨论了作为原
生质体来源的新梢培养的优越性 , 在本研究
中也证实了这些优越性 , 即移植的植物材料
易于无性繁殖 , 易于制备和无菌原生质体产
量高 , 同时提供了相 当稳定的结果 。 葡蟠的
这一技术系统的建立 , 证明了木本植物从叶
肉原生质体中再生植株是能够成功的 。
( 图版 6 幅 , 参考文献 19 篇略 )
杨今后译 自《 J . P l a nt F h ys i或 . 》
V O I
.
1 19
。
P P 4 5 5一 4 6 0 ( 1 9 8 5 )
龚 垒校