全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 25
西伯利亚蓼硫堇基因的克隆和序列分析
刘昌财1,2，刘关君1,*，刘桂丰1，李晓泽1
1 东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；2 中国人民解放军 61699 部队，湖北枝江 443200
提要：根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的硫堇(THI)基因的部分序列，应用 RACE 技术克隆了具有 Poly A 的全
长 cDNA 序列。基因全长 789 bp，5 非翻译区 90 bp，3 非翻译区 276 bp，开放阅读框编码 140 个氨基酸。序列分析表
明，该编码蛋白与大多数植物 THI 蛋白前体高度相似，N 端具 24 个氨基酸的信号肽，中间 46 个氨基酸为成熟 THI 部分，
C 端的 70 个氨基酸为酸性多肽部分。西伯利亚蓼 THI 蛋白与丹参等双子叶植物 THI 蛋白有较高的同源性，具保守的植物
THI 标签序列 C-C-X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C。此成熟 THI 蛋白带正电荷，偏碱性，推定可能具有抗病原微生物活性，为一
种新的植物 THI 蛋白，GenBank 登录号为 DQ981482。
关键词：西伯利亚蓼；硫堇；基因克隆；RACE
Gene Cloning and Sequence Analysis of Thionins from Polygonum sibiricum Laxm.
LIU Chang-Cai1,2, LIU Guan-Jun1,*, LIU Gui-Feng1, LI Xiao-Ze1
1College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2 The No. 61699 Army of Chinese People’s Liberation
Army, ZhiJiang, Hubei 443200, China
Abstract: A partial sequence of a thionins (THI) gene was obtained from a random clone in Polygonum sibiricum
SSH library and THI was cloned by using rapid amplification of cDNA end (RACE) technology. The acquired
gene was 789 bp in full length, including 5 untranslated region of 90 bp, 3 untranslated region of 276 bp with
Poly A, and an open reading frame (ORF) encoding 140 amino acid. Sequence analysis indicated that the protein,
such as most of the plant THI, was a precursor which could be divided into three distinct domains, including an
amino-terminal (N-terminal) signal peptide, a mature THI and a carboxy-terminal (C-terminal) acidic domain,
which were composed of 24, 46 and 70 amino acid respectively. THI was found to be highly homologous with
that from other dicotyledon. All of them possessed a conserved plant THI signature sequence of “C-C-X(5)-R-
X(2)-[FY]-X(2)-C”. The mature THI had positive charge and showed slightly high basic. As result, it was
possibly involved in antimicrobial activity and was identified as a new plant THI. The gene accession nucleotide
sequence number in GenBank was DQ981482.
Key words: Polygonum sibiricum; thionins (THI); gene cloning; RACE
硫堇(thionins，THI)是一类首先在小麦
(Triticum aestivum)种子中发现的分子量为5 kDa左
右的碱性蛋白，有 45~50 个氨基酸残基。其富含
半胱氨酸，具 3~4 个位置保守的二硫键，是一种
小分子多肽，在植物种子的胚乳、茎、根以及
黄化或受病原菌胁迫的植物叶子中均有发现(Florak
和Stiekema 1994)。植物THI多以大分子前体形式
存在，包括信号肽、成熟 T H I 和酸性多肽三部
分，依据植物的种类、发生部位、总静电荷、
氨基酸的数量和成熟蛋白质中二硫键的位置，
THI至少可以分为4类(Garcia-Olmedo等 1989)。
前 3 种类型偏碱性，带正电荷，具有抗病原微生
物的活性(Florack 等 1994)，第 4种类型如芸苔
(Brassica rapa)的THI仅发生在开花部位，不带电
荷，无抗菌活性(Jung等 2001)。不同类型的THI
对细菌、真菌、酵母、动物和植物细胞的毒性
作用已有较为详细的描述(Bo h l m a n n 和 Ap e l
1991)。与普通抗生素作用机制所不同的是，它
通过结合于真菌细胞特定细胞膜上的受体，增加
膜透性，抑制糖的吸收，引起钾离子、磷酸根
离子、蛋白和核酸的流出，从而起到抑菌作用，
因而病原菌很难形成抗性生理小种(Florack 和
Stiekema 1994；Pelegrini和Franco 2005)。目前，
已从小麦(Van Campenhout 等 1998)和拟南芥
收稿 2006-08-24 修定 　2006-12-26
资助 黑龙江省重点攻关项目(GB06B303)。
*通讯作者(E-mail：liuguanjun2003@126.com；Tel：
0451-82190607)。
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(Arabidopsis thaliana) (Epple等1995)等十余种植物
中克隆了 THI。此种基因转入植物体内可提高植
物的抗病力。Epple等(1997)首次报道，内源THI
(THI 2.1)受病原菌的入侵诱导，转基因株系可增
强拟南芥对病原真菌镰刀霉菌(Fusarium oxysporum)
的抗性。燕麦 THI 转入水稻增强其对细菌的抗性
(Iwai等2002)。
西伯利亚蓼为蓼科植物，多生于盐碱荒地。
关于西伯利亚蓼的报道主要集中在形态学的研究，
陆静梅和李建东(1994)以扫描电镜观察西伯利亚蓼
的解剖结构时，发现其有抗盐碱的结构特征。其
分子机制研究也有报道，吕艳芳等(2006)报道，
经 NaHCO3 溶液处理后西伯利亚蓼地下茎、茎和
叶对外界盐碱胁迫的反应存在多样性。据此，本
文根据从NaHCO3 胁迫下西伯利亚蓼地下茎正向抑
制消减文库(SSH)中获得的THI 基因的部分序列，
采用 RACE 技术克隆了 THI 基因全长 cDNA 序列，
并对其及编码蛋白进行了序列分析。
材料与方法
以苗高 15~20 cm 的西伯利亚蓼(Polygonum
sibiricum Laxm.)为试材，用3% NaHCO3 胁迫处
理 6 h，构建西伯利亚蓼地下茎 SSH 文库。随机
挑取克隆使用MegaBACE-1000 DNA 序列分析仪进
行测序(本实验室自主完成)，经 GenBank 数据库
进行BLASTX 比对分析获得 1个 225 bp 的 THI 基
因片段(图1)，推断此基因5和3端分别缺少约99
和 105 个碱基，为非全长 cDNA 序列基因。
按照 SDS/ 苯酚法提取西伯利亚蓼地下茎总
RNA。参照 SmartTM RACE cDNA 扩增试剂盒反
转录合成 c D N A 第一链，作为 R A C E 模板。
根据已知序列设计3端引物 THI-S，序列为
5 ATGGTGTCGCTGAATACTGCAAGTTGGG 3，
PCR 反应体系参照试剂盒(SmartTM RACE cDNA
Amplification Kit BD Biosciences)说明书。反应条件
为94 ℃中变性3 min，然后按94 ℃ 30 s、62 ℃
1 min、72 ℃ 2 min进行 35轮的循环反应，最后
在 72 ℃下延伸 8 min。
根据上述方法将已获得的3 RACE片段在其3
非翻译区设计引物THI-A 以获得基因全长，THI-A
引物序列为 5 ACAATCCAGGATCGCCGACAA-
CCTTC 3，PCR 反应体系同前。反应条件为94 ℃
变性3 min，然后按94℃ 30 s、66 ℃ 1 min、72
℃ 2 min 进行40轮的循环反应，最后于72 ℃下
延伸8 min。
PCR扩增产物的特异性片段用宝生物工程(大
连)有限公司胶回收试剂盒回收，宝生物工程(大
连)有限公司pMD18-T载体连接，大肠杆菌Top10
转化，经 Amp + 抗性及蓝白斑筛选，随机挑取阳
性克隆进行 PCR 鉴定，由上海生工生物工程技术
服务有限公司完成测序。
用BioEdit软件的Contig Assembly Program进
行电子拼接，采用 NCBI 中的 BLASTX 程序进行
同源性比较，开放阅读框(open reading frame，
ORF)程序查找序列的ORF，软件Clustalw 1.8.1进
行多序列比较和分子进化树的绘制。SignalP 3.0
预测蛋白的信号肽及可能的切割位点。BioEdit软
件的Kyte-Doolittle Scale Mean Hydrophobicity Pro-
file 程序算法进行疏水性分析。软件ProtParam
(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)计算蛋白
的分子量、净电荷和理论等电点。BLASTP 预测
保守区。应用Profile Search、Scan Prosite和Motif
Scan程序(http://au.expasy.org/prosite)进行轮廓、
结构域和基序分析。
实验结果
1 西伯利亚蓼THI基因的3端和5端扩增
根据 SSH 文库中获得的 225 bp THI 片段序
列，设计引物THI-S (图 1)，采用 3 RACE 的方
法扩增THI的 3端。经扩增，得到1条约400 bp
的 DNA 片段(图 2)，测序后比对证实为THI 的 3
端序列。
根据3 RACE 扩增片段的测序结果，在其非
翻译区设计引物THI-A (图 1)，采用 5 RACE 的
方法扩增完整的THI全长。经扩增得到1条约800
bp的 DNA片段(图 3)，与所推测的片段大小一致，
测序后比对证实为 THI 的全长序列。
2 西伯利亚蓼THI基因的序列拼接和分析
经电子拼接获得带有Poly A 的全长 cDNA 序
列为 789 bp，应用 NCBI 的 ORF 程序显示5非翻
译区为90 bp，3 非翻译区为276 bp；开放读码
框为420 bp，编码 140 个氨基酸(图 1)。
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经疏水性、SignalP 3.0、ProtParam和Scan
Profile程序分析发现，编码蛋白的等电点(IEP)
为 6.5，分子量(MW)为 14.6 kDa。N端第 1~24位
氨基酸区段疏水性很强，第24位Ala和第25位Lys
图1 西伯利亚蓼THI基因全长cDNA序列和推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of THI cDNA from P. sibiricum
下划线部分为 24 个氨基酸的信号肽；底纹部分为 46 个氨基酸的成熟 THI 蛋白；其它部分氨基酸为酸性多肽部分。方框表
示起始密码子；End 表示终止子；箭头之间核苷酸部分为从 SSH 库中获得长度为 225 bp 的 THI 基因部分序列；加粗部分 329~356
bp 和 680~705 bp 分别为引物 THI-S 和 THI-A。
图2 THI的3 RACE扩增产物
Fig.2 3 RACE product of THI cDNA
M：D L 2 0 0 0 分子量；1：3 R A C E 扩增产物。
图3 THI的5 RACE扩增产物
Fig.3 5 RACE product of THI cDNA
M ：D L 2 0 0 0 分子量；1：5 R A C E 扩增产物。
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为信号肽切割位点，IEP 为 4.5，MW 为 2.6 kDa，
这一段具典型信号肽特征，为信号肽部分。第
25~70 位氨基酸区段为成熟 THI 部分，亲水性较
强，具 6 个半胱氨酸，占成熟 THI 氨基酸数量的
13%，带正电荷，呈碱性，IEP 为 9.15，MW 为
4.9 kDa。C端第71~140位氨基酸区段为酸性多肽
部分，含2 段范围较广疏水性较强的氨基酸部分，
IEP 为 4.2，MW 为 7.1 kDa。这些特征与大多数
植物THI 前体一致，推断THI 在西伯利亚蓼地下
茎中以此三部分构成的前体形式存在(图 1)。
Motif Scan程序分析显示，成熟THI部分的
第 3、4、16、26、32 和 40 位的 6 个半胱氨酸
(C)残基是植物THI极为保守的3个二硫键的形成
位点，第 10 和 13 位氨基酸分别为植物 THI 保守
的精氨酸(R)和芳香族氨基酸[这里为酪氨酸(Y)]，
第 8~10 和 15~17 位氨基酸分别为2个蛋白激酶C
磷酸化位点(protein kinase C phosphorylation site)
TAR 和 SCR，以上为显著的植物 THI 标签(plant
thionins signature) C-C-X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C序
列特征(图 4)。C端酸性多肽部分第19~24位氨基
酸区段为许多植物 T H I 保守的酰基化序列
GCVSSV 位点(图 5)。
图5 西伯利亚蓼和其它12种植物的THI蛋白前体序列比较
Fig.5 Comparison on the amino acid sequences of THI precursor between P. sibiricum and other 12 plants
▲ 为双子叶植物硫堇形成3个二硫键位置保守的六个半胱氨酸残基； ····· 为大多数植物硫堇前体保守的酰基化序列位点；△
为大多数单子叶植物硫堇具有的另外 2 个位置保守的半胱氨酸残基。
图4 西伯利亚蓼和其他植物成熟
THI保守的氨基酸序列比较
Fig.4 Comparison on the conserved amino acid sequences of
the mature THI between P. sibiricum and other plants
底纹部分为植物 THI 标签；a：植物成熟 THI 保守的氨基
酸序列；b ：西伯利亚蓼成熟 T H I 氨基酸序列。
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图6 植物THI蛋白的系统进化树
Fig.6 Evolutionary tree of plant THI
3 西伯利亚蓼与其它植物的THI蛋白的同源性比较
经BLASTX分析，发现此种基因与GenBank中
其它植物海甘蓝(Crambe abyssinica)、芸苔(Brassica
rapa ssp. pekinensis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、
丹参(Salvia miltiorrhiza)、白果槲寄生(Viscum
album)、日本水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum
vulgare)、海滨大麦草(Hordeum marinum)、燕麦
(Avena sativa)、栽培二稜大麦(Hordeum vulgare
ssp. vulgare)、郁金香(Tulipa gesneriana)和小麦
(Triticum aestivum)的THI基因具较高的同源性，
同源性在 54%~7 2 % 之间。
软件Clustalw 1.8.1对此种基因相近的12个物
种的THI蛋白序列进行多序列比对(图5)，绘制进
化树(图 6)。分析表明，THI 蛋白的部分序列较
为保守，西伯利亚蓼与丹参、海甘蓝突变体等双
子叶植物 THI 蛋白在进化关系上较近，而与其他
如日本水稻、小麦等单子叶植物 THI 蛋白进化关
系较远。
讨　　论
RACE技术是一种快速扩增cDNA 5和3末端
的简单而有效的方法(Schaefer 1995)。结合SSH文
库进行RACE，一般的步骤是根据一段已知序列的
非末端cDNA片段同时设计3 RACE和 5 RACE特
异性引物分别扩增cDNA的 3和 5末端，将3和
5 末端扩增产物进行电子拼接全长，再在非翻译
区设计特异性引物扩增到真正的全长cDNA，才能
获得插入目的片段的克隆载体。本文只通过 3
RACE 扩增后，根据获得的 3 cDNA 序列，直接
在3非翻译区设计特异性引物经5 RACE扩增出完
整的 THI cDNA 序列，不但可减少克隆全长基因
的时间和提高效率，而且可降低实验费用，这对
从 SSH 文库中克隆基因来说有一定的参考价值。
大多数单子叶植物成熟THI部分有8个位置一
致的半肽氨酸残基，形成4个二硫键(Schrader-
Fischert和Apel 1993)。生物信息方法分析表明，
西伯利亚蓼THI在相同位置上有6个半胱氨酸，形
成3个二硫键，这与双子叶植物THI的特征一致，
显示其在亲缘关系上与其它双子叶植物的 THI 较
为接近。
根据Garcia-Olmedo等(1989)对植物THI的分
类，西伯利亚蓼 THI 应与白果槲寄生等 THI 同属
于第 3 种类型，推定此种 THI 具抗病原微生物活
性。另外，西伯利亚蓼 THI 片段是从碱胁迫下西
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伯利亚蓼地下茎的 SSH 文库中获得的，在碱胁迫
下西伯利亚蓼地下茎的 THI 是否同时参与抗碱和
抵抗真菌的作用还有待进一步研究。
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