全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（8）：1437–1446 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–04–22；修回日期：2011–07–07
基金项目：国家自然科学基金项目（30871697，31071784）；北京市自然科学基金项目（6102017）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：litianzhong1535@163.com）
苹果花粉中与花柱S-RNase互作的 γ–硫堇筛选
及鉴定
孙会玲，孟 冬，白松龄，胡建芳，李天忠*
（中国农业大学农学与生物技术学院果树细胞与分子育种实验室，北京 100193）
摘 要：以‘国光’苹果（S1S2）花粉为材料，成功构建了酵母 pGADT7-cDNA 文库，转化效率约为
1.2 × 106 · μg-1，插入片段大小在 300 ~ 2 000 bp 之间。通过酵母双杂交方法，用苹果 S2-RNase 的 C2HVC3
区筛选文库获得一个长 505 bp 的 cDNA 片段，经分析发现该 cDNA 序列上有一个 261 bp 的开放阅读框
（ORF），该 ORF 编码一个具 N 端信号肽的多肽，该成熟多肽由 64 个氨基酸组成，富含带正电荷的赖氨
酸和精氨酸，其 C 端有 8 个半胱氨酸和一个 γ–硫堇功能域，结构预测显示其具有一个 α 螺旋，3 个 β 折
叠，4 个二硫键，由此，推断其为苹果 γ–硫堇，命名为 MdD1。RT-PCR 分析发现：MdD1 基因在‘国光’
苹果叶片、萼片、花瓣、子房、花药和花柱等组织中都有表达，但花药中表达量最高。酵母双杂交结果
表明 MdD1 除了与苹果 S2-RNase 的 C2HVC3 区互作外，还与 S1-RNase 的 C2HVC3 区，S1、S2-RNase 的
成熟多肽区存在互作。初步认为：苹果 γ–硫堇可能通过与 S-RNase 非特异性互作，作为花粉非 S 因子参
与自交不亲和反应。
关键词：苹果；S-RNase；自交不亲和；花粉 cDNA 文库；酵母双杂交；γ–硫堇
中图分类号：S 661.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）08-1437-10

Screen and Identification of Pollen γ-thionin Interacting with Style S-RNase
in Apple
SUN Hui-ling，MENG Dong，BAI Song-ling，HU Jian-fang，and LI Tian-zhong*
（Laboratory of Fruit Cell and Molecular Breeding，College of Agriculture and Biotechnology，China Agricultural
University，Beijing 100193，China）
Abstract：Yeast pGADT7-cDNA library was successfully constructed for apple‘Ralls Janet’pollen，
with a transformation efficiency up to 1.2 × 106 · μg-1 and being inserted by sequences of 300–2 000 bp
in size. Through yeast two-hybrid（Y2H）assay，one cDNA of 505 bp in size was screened from the library
by C2HVC3 domain of apple S2-RNase as bait. The cDNA was predicted to contain one complete ORF of
216 bp in size，coding an peptide with a signal peptide on its N terminal. The deduced mature peptide was
designated apple γ-thionin MdD1 for that it contained both 8 cysteines and γ-thionin motif on its C
terminal，was rich in Lys and Arg with positive charge. Structure prediction revealed one α-helix，three
β-sheets and four disulfide bones. RT-PCR showed that the gene MdD1 preferentially expressed in anther，


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though also expressed in other tissues such as leaf，sepal，petal，ovary and style of apple‘Ralls Janet’.
Y2H assay showed that MdD1 interacted with S-RNase nonspecifically，because it not only interacted
with apple S2-RNase-C2HVC3，but also with S1-RNase-C2HVC3，mature peptide of S1-RNase and
S2-RNase. All these results taken together suggest that apple γ-thionin MdD1 may be involved in SI as a
pollen non-S factor interacting with S-RNase nonspecifically.
Key words：apple；S-RNase；self-incompatibility；pollen cDNA library；yeast two-hybrid；γ-thionin

自交不亲和是被子植物中一种促进异交，防止自交的繁育策略。包括苹果在内的蔷薇科果树属
于配子体自交不亲和类型（GSI）。目前研究认为，该自交不亲和类型由单一位点 S 位点控制（de
Nettancourt，1997），包括花柱 S 决定子和花粉 S 决定子基因。花柱 S 决定子编码具有核酸酶活性的
糖蛋白 S-RNase（Anderson et al.，1986；McClure et al.，1990；Lee et al.，1994；Murfett et al.，1994），
花粉 S 决定子编码 N 端含有保守 F-box 结构域的 SFB/SLF（Lai et al.，2002；Ushijima et al.，2003；
Sijacic et al.，2004）。自交不亲和（SI）反应主要由这两种决定子蛋白间的相互作用决定。在矮牵牛
中的最新研究表明，每种 S 基因型中都具有多个花粉决定子 SLF，其编码的蛋白协同作用共同识别
花柱中的 S-RNase，由此控制自交不亲和反应的发生（Kubo et al.，2010）。但通过经典遗传学和分
子遗传学的研究发现，自交不亲和现象远比想象的要复杂得多，并非花粉和花柱 S 决定子间的简单
识别作用。Beecher 和 McClure（2001）通过烟草转基因发现，将 SA2-RNase 基因转入烟草 Nicotiana
tabacum（SC）后并不能改变其亲和性，即通过转化单一的 S-RNase 基因，不一定能够使自交亲和
品种恢复拒斥自花花粉的能力（McClure et al.，2000）。这说明自交不亲和反应是一种花粉和花柱细
胞间复杂的信号转导过程，除花柱和花粉 S 决定子外，应当还有很多其他的非 S 因子（non-S-RNase/
SLF factors）参与其中。
目前的研究大部分还集中于 S 决定子上，对非 S 因子的研究较少。已经发现的可能参与自交不
亲和反应的非 S 因子主要有：在茄科和烟草中发现的一种花柱特异表达的蛋白 HT-B（McClure et al.，
1999；Goldraij et al.，2006；Alejandro et al.，2009；Puerta et al.，2009），可能作为 E3 泛素连接酶
参与泛素化降解 S-RNase 的 SBP（S-RNase binding protein）（Sims & Ordanic，2001；Hua & Kao，
2008），参与形成 SCF 复合体的蛋白 SSK1（S-Locus F-Box interacting-skp1 like 1）（Huang et al.，2006；
Zhao et al.，2010）和 Cullin1（Li & Chetelat，2010）等。这些非 S 因子在花粉和花柱相互识别过程
中，可能起到识别和降解 S-RNase，细胞信号转导，调节花粉管生长等作用，最终由于 S 决定子与
非 S 因子的共同作用而产生自交不亲和现象。因此，为阐明自交不亲和现象的本质，应当找到那些
可能参与自交不亲和反应的非 S 因子。
为寻找苹果花粉中与花柱决定子 S-RNase 互作且可能参与自交不亲和的未知非 S 因子，本研究
中以苹果花柱 S2-RNase 的 C2HVC3 区作为诱饵，采用酵母双杂交的方法筛选‘国光’苹果花粉
pGADT7-cDNA 酵母文库，获得了一个小分子的带正电荷的 γ–硫堇 MdD1。通过 MdD1 基因组织
特性表达分析及多肽与 S-RNase酵母双杂交互作分析，初步认为其可能为苹果 SI反应中的非 S因子。
1 材料与方法
1.1 材料
于 2009 年和 2010 年的 5 月在辽宁省果树科学研究所资源保存圃采集‘国光’苹果（S1S2）蕾
期的花药、花柱、叶片、萼片、花瓣、子房。花药阴干后，–20 ℃保存备用，其余材料采集后立即
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冷冻，–80 ℃保存备用。
1.2 花粉酵母 cDNA 文库的构建
采用改良的 CTAB 法（Chang et al.，1993）提取‘国光’花粉总 RNA，用 DNaseⅠ去除 DNA，
无水乙醇纯化。采用微量紫外分光光度计检测 OD260、OD280 的值，计算总 RNA 浓度。以花粉 RNA
为模板，使用 BD MatchmakerTM Library Construction & Screening Kits（Clontech）中包含的 RT-PCR
试剂，合成 dsDNA。用 BD CHROMA SPINTM TE-400 Column 纯化 dsDNA，方法同 BD CHROMA
SPINTM Purification 手册（No. PT1300-1）。将 dscDNA、pGADT7-Rec、Herring Testes Carrier DNA
共转化到酵母菌 AH109 感受态细胞中，SD/-Leu 上培养 3 ~ 6 d，随机挑取平板上的克隆，用 pGADT7-
Rec 上的通用引物 AD-LD（上游 5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACC-3′，下游 5′-GTG
AACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′）鉴定重组到 pGADT7-Rec 载体上外源 cDNA 片段
大小。收集全部菌体到一定液体 SD/-Leu 中，每份分装成 1 mL，–80 ℃保存备用。将酵母文库菌
液按 1/100、1/1 000、1/10 000 稀释并涂布在 SD/-Leu 上，计算库容量。
1.3 花柱 S-RNase 诱饵载体构建
根据苹果花柱 S1-RNase（登录号：D50837）和 S2-RNase（登录号：U12199）序列，设计、合成
引物，上、下游引物两端分别插入酶切位点 EcoR I 和 Pst I（见下划线）和保护碱基。以花粉 cDNA
为模板，扩增 C2HVC3 区，分别用 S1-和 S2-RNase 的引物（上游 5′-GGAATTCCCAACTCCTTGTAAGG
ATCCTCCTGACAAG-3′；下游 5′-AAAACTGCAGACAAGAGCCATGTTTATCCCACTGTTTACG-3′；
上游 5′-CAGGAATTCCCTACTCCTTGTAAAGATCCTCCTGAC-3′，下游 5′-TATAAAACTGCAGA
CAGGCGCCGTGTTTGTTC-3′）。同时，扩增成熟多肽区（mat），分别用 S1-、S2-RNase 的引物（上
游 5′-GCGGAATTCTTCGATTATTATCAATTTACGCAGCA-3′，下游 5′-AAAACTGCAGATACTGA
ATATTGGTGGGGCAGAAA-3′；上游 5′-CCGGAATTCTACGATTATTTTCAATTTACGCA-3′，下游
5′-CGGGCTGCAGATACAGAATATGATTGGTG-3′）。PCR 产物电泳、回收、连接到 pMD18-T 载
体，转化涂板，挑斑做 PCR，阳性菌落送去测序。测序正确的质粒，进行酶切，用 T4 连接酶将目
的片段连接至酵母表达载体 pGBKT7。诱饵质粒 pGBKT7：S1-mat、pGBKT7：S2-mat，用于之后的
互作鉴定，质粒 pGBKT7：S1-C2HVC3、pGBKT7：S2-C2HVC3 用以筛选文库。将测序正确的诱饵
质粒 pGBKT7：S1-C2HVC3、pGBKT7：S2-C2HVC3、空载 pGBKT7 用 LiAc/ss-DNA/PEG 法（Gietz
& Woods，2002）分别转化到酵母 Y187 中，涂在 SD/-Trp 平板，30 ℃培养 3 ~ 4 d，长出的克隆用
于下一步的筛选文库。
另外，将长出的克隆分别涂布到二缺（SD/-Trp-Leu）、三缺（SD/-Trp-Leu-His）、四缺
（SD/-Trp-Leu-His-Ade）酵母培养基上，检测是否存在自激活效应和自毒性。
1.4 花粉酵母 cDNA 文库筛选与互作子的再鉴定
将 pGBKT7：S1-C2HVC3、pGBKT7：S2-C2HVC3 诱饵质粒的菌 Y187 与含花粉 cDNA 文库的
菌 AH109 进行交配，详细方法参考 MatchmakerTM Library Construction & Screening Kits（PT3955-1，
Clontech）说明书。30 ℃、30 ~ 50 r · min-1 轻摇 20 ~ 24 h，SD/-Trp-Leu-His-Ade 皿筛选培养上。6 d
后，挑选白色的直径大于 2 mm 的菌落加 1 ~ 2 μL X-α-gal（4 mg · mL-1）显色分析。初步确定显蓝
色快（3 h 以内）和蓝色深的菌落为阳性克隆，将之于液体 SD/-Trp-Leu-His-Ade 震荡培养，提取质
粒，并用 pGADT7-Rec 上的通用引物鉴定捕获的 AD 质粒上重组的 cDNA 片段大小。
筛选文库获得的质粒经 E. coli DH5α 扩繁后，提出质粒，将之与诱饵质粒用 LiAc/ss-DNA/PEG
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法（Agatep et al.，1998）共转化酵母 AH109 以再次确认互作，pGBKT7-53 和 pGADT7-SV40 为阳
性对照，pGBKT7 和 pGADT7 为阴性对照，进行 X-α-gal 或 β-gal 显色。
1.5 基因的测序和分析
将诱饵质粒 pGBKT7：S1-C2HVC3、pGBKT7：S2-C2HVC3 捕获的 AD 质粒测序。用 DNAMAN
分析 AD 上的 cDNA 序列，并用 NCBI 的 ORF Finder 在线寻找其上的 ORF 再采用 NCBI 上的 Blast
在线工具寻找其同源基因，进而与苹果基因进行比对（http：//genomics. research. iasma. it/#），检测
基因序列的完整性。最后对获得的蛋白进行在线分析：预测蛋白质的理化性质（ProtParam tool）、
功能域（CD-Search）、信号肽（SignalP）和高级结构预测（ESPript 2.2）等。
1.6 基因的组织特异性分析
提取‘国光’苹果小花药（花蕾最大宽度的平均值约 0.5 cm）、中花药（花蕾最大宽度的平均值
约 1 cm）、花柱、叶片、萼片、花瓣、子房总 RNA（方法同 1.2），反转录成 cDNA，具体方法参照
MMLV 反转录酶说明书，用于组织特异性分析。
用引物（上游 5′-CAGACAAGGTAGCTAAGGAAAGGACATG-3′，下游 5′-TACGACGAAAGCC
CTGGCATTG-3′）进行 PCR 扩增，以检测 MdD1 在各个组织中的表达情况，β-Actin 作为苹果内参。
2 结果与分析
2.1 ‘国光’苹果花粉酵母 cDNA 文库的构建
花粉总 RNA 电泳显示，28S︰18S 两条带的亮度接近 2︰1（图 1，A），浓度为 0.74 μg · μL-1，符
合建库要求。
将花粉总RNA反转录后，以单链 cDNA为模板进行LD-PCR扩增 cDNA文库。合成的双链 cDNA
大小在 0.5 ~ 4.0 kb 之间（图 1，B）。
纯化的 dscDNA 与 pGADT7-Rec 共转化酵母 AH109。花粉 cDNA 文库的库容量约为 1.2 × 106 ·
μg-1（图 1，C）。
随机挑取平板上的单克隆，提取质粒后进行 PCR，可见插入片段在 300 ~ 2 000 bp 之间（图 1，
D）。
以上结果表明 cDNA 文库构建成功。
2.2 苹果花柱 S-RNase 酵母双杂交诱饵载体构建
以‘国光’苹果花柱 cDNA 为模板，分别扩增 S1-RNase、S2-RNase 的 C2HVC3 区和 mat 区，
目标片段 S1-C2HVC3 为 206 bp，S1-mat 为 618 bp，S2-C2HVC3 为 217 bp，S2-mat 为 621 bp，连接
至 pMD18-T 载体后测序，获得正确的克隆。
质粒扩繁后，经酶切连接到酵母表达载体 pGBKT7 上。酶切和测序结果表明：载体构建正确（图
2）。
将诱饵质粒 pGBKT7：S1-C2HVC3、pGBKT7：S2-C2HVC3 和空载质粒 pGBKT7 分别成功转化
到酵母 Y187 后，发现转化菌只在 SD/-Trp 上生长，不在二缺（SD/-Trp-Leu）、三缺（SD/-Trp-Leu-His）、
四缺（SD/-Trp-Leu-Ade-His）培养基上生长，说明无自激活效应。含诱饵质粒和空载质粒的酵母的
转化效率相近，且转化菌用 YPDA 培养一定时间后菌液的 OD600 值正常，说明诱饵质粒表达的蛋白
对酵母 Y187 无毒性。
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图 1 ‘国光’苹果花粉 cDNA 酵母文库的构建
A：花粉总 RNA；B：LD-PCR 合成的双链 cDNA（M 为 1 kb ladder；1 为双链 cDNA）；C：酵母文库的容量检测（通过 pGADT7-cDNA
的酵母菌稀释 10 000 所长出的克隆）；D：花粉文库质量鉴定图（M 为 DL2000 marker）。
Fig. 1 Construction of yeast pollen cDNA library for apple‘Ralls Janet’
A：Total RNA of pollen；B：Double strand cDNA amplified by LD-PCR（M for 1 kb ladder；1 for double strand cDNA）；
C：Estimation of the capacity of constructed library by yeast clones contained pGADT7-cDNA in 10 000 dilutions；
D：The qualification test for the library（M for DL2000 marker）.

图 2 苹果花柱 S-RNase 酵母双杂交载体构建
M：DL2000 marker。1 ~ 4 分别为 pMD18-T：S1-C2HVC3，pMD18-T：S2-C2HVC3，pGBKT7：S1-mat 和 pGBKT7：S2-mat 的双酶切图。
Fig. 2 Plasmids construction of apple style S-RNase for Y2H assay
M：DL2000 marker. 1–4 for the double digest products of pMD18-T：S1-C2HVC3，pMD18-T：S2-C2HVC3，pGBKT7：S1-mat
and pGBKT7：S2-mat，respectively.

2.3 与 S2-RNase-C2HVC3 互作的 B42 的获得
以 pGBKT7：S1-C2HVC3 和 pGBKT7：S2-C2HVC3 为诱饵，筛选花粉酵母 cDNA 文库。将所
得阳性克隆分离出 pGADT7（AD）质粒，用 AD-LD 引物进行 PCR，鉴定插入的 cDNA 的大小。其
中，pGBKT7：S2-C2HVC3 筛选获得一编号为 B42，PCR 产物约 538 bp 的 AD 质粒（图 3，A 箭头
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所示）。将之从酵母菌中分离，经 E. coli DH5α 扩繁，与诱饵质粒 pGBKT7：S2-C2HVC3 共转酵母
AH109，涂于 SD/-Trp-Leu 上，第 3 天发现长出白色克隆。再挑斑涂布于 SD/-Trp-Leu-His-Ade，亦
能生长，且 β-gal 分析显蓝色（图 3，B），确认互作存在。
测序后，将该序列与苹果基因组比对，发现它存在于‘金冠’苹果基因组第 13 号染色体 MDC
001747.422 上。ORF Finder 预测到一开放阅读框，暂定名为：B42-ORF。经 BLASTp 发现它与日本
梨（Pyrus pyrifolia）防御蛋白家族成员之一（BAB64929.1）相似性达到 78%（E = 1e-31），推断与
S2-RNase- C2HVC3 互作的蛋白可能为防御蛋白。
图 3 苹果花粉 pGADT7-cDNA 酵母文库筛选（A）与阳性克隆 B42 的鉴定（B）
A：捕获质粒中插入的 cDNA 大小，箭头所示为质粒 AD-B42 的 PCR 带；B：双质粒共转 AH109 后进行 β-gal 染色结果（a 为阳性对照；
b 为阴性对照；c 为 AH109 含 pGADT7：B42 与 pGBKT7：S2-C2HVC3；d 为 AH109 含 pGADT7：B42 与 pGBKT7）。
Fig. 3 Screen of apple pollen pGADT7-cDNA library and identification of the positive clones B42
A：The PCR products of cDNA inserts of prey plasmid. The arrow indicated the PCR product of plasmid B42；
B：The β-gal assay of AH109 co-transformed with double plasmids（a for positive control；
b for negative control；c for AH109 co-transformed with pGADT7：B42 and pGBKT7：S2-C2HVC3；
d for AH109 co-transformed with pGADT7：B42 and pGBKT7）.

2.4 防御蛋白候选 B42 基因结构预测与分析
S2-RNase：C2HVC3 捕获得到的 B42-ORF 利用 SignalP 分析发现其 N 端有一包含 23 个氨基酸
的信号肽（图 4）。经 ProtParam 在线预测其成熟多肽为：有 64 个氨基酸，分子量为 7 018.1 D，PI
为 9.57，具有较多的阳性氨基酸（Arg + Lys = 15 个），性质稳定，且具有 8 个半胱氨酸（分布在成
熟多肽的第 20、31、37、41、51、58、60、64 位）。
功能域分析发现：其含有 γ–硫堇（或称硫素，gamma-thionin，IPR008176，E = 4.77e-09）。前
面序列比对发现该多肽与日本梨上的防御蛋白相似，Pelegrini 等（2008）认为 γ–硫堇（gamma-thionin）
即为植物防御蛋白（plant defensin）。与花中特异性表达的烟草防御蛋白 NaD1（PDB ID：1MR4）
和矮牵牛 PhD1（PDB ID：1N4N）进行氨基酸序列比对结果显示：三者 C 端的 8 个半胱氨酸保守。






图 4 MdD1 的氨基酸序列
Fig. 4 Amino acid sequence of MdD1

MEHSMRLVSAAFVLVLLFAATEMGPMGVEARSKSDKVAKERTCEAASGKFKGLCFSSTNCKNTCKVEKFTGGQCQGFRRRCMCNKKC
信号肽 Signal peptide 成熟多肽 Mat peptide
γ–硫堇 Gamma-thionin
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结构预测（图 5）显示：该蛋白含有 1 个 α 螺旋、3 个 β 折叠、4 个二硫键（disulfide bond）。
由此推断：B42 具有 γ–硫堇的典型特征，故认定 B42 为苹果 γ–硫堇，命名为 MdD1。


NaD1 -RECKTESNTFPGICITKPPCRKACISEKFTDGHCSKILRRCLCTKPC
PhD1 -ATCKAECPTWDSVCINKKPCVACCKKAKFSDGHCSKILRRCLCTKEC
MdDI ERTCEAASGKFKGLCFSSTNCKNTCKVEKFTGGQC-QFRRRCMCNKKC


二硫键 Disulfide bond
图 5 MdD1 与 NaD1、PhD1 部分多肽序列比对及 MdD1 的二级结构预测
Fig. 5 Partial peptide sequences alignment of MdD1，NaD1 and PhD1 and possible secondary structure of MdD1

2.5 酵母双杂交验证 MdD1 与苹果花柱 S-RNase 的互作关系
为了证明 MdD1 是否与苹果花柱 S2-RNase 成熟多肽区、S1-RNase 存在互作，以 pGBKT7：S2-mat、
pGBKT7：S1-C2HVC3、pGBKT7：S1-mat 为诱饵质粒，分别与‘国光’苹果花粉酵母文库中分离得
到的质粒 pGADT7：B42 分别共转染至酵母 AH109 中，涂布在二缺（SD/-Trp-Leu）培养基上，30 ℃
培养，第 3 天发现都长出了白色的菌落，说明质粒均被成功转化进去。
第 4 天挑选菌斑划线接种到三缺（SD/-Trp-Leu-His）和四缺（SD/-Trp-Leu -His-Ade）培养基上。
结果显示：为阴性对照的酵母（图 6，1 ~ 6）不能在四缺培养基上生长，逐渐变红及至死亡；而阳
性对照的酵母和共转了 MdD1 与 S-RNase 的 C2HVC3 和成熟多肽的酵母都能在四缺培养基上生长，
菌斑呈白色（图 6，7 ~ 11），且经 X-α-gal 显色后，呈蓝色。结果表明，AD-B42 质粒也与 pGBKT7：
S2-mat、pGBKT7-S1-C2HVC3、pGBKT7：S1-mat 质粒存在互作，证明 MdD1 与 S-RNase 的互作无
单元型特异性。







图 6 MdD1 与苹果花柱 S-RNase 的酵母互作
1. pGBKT7 + pGADT7；2. pGBKT7：S1-C2HVC3 + pGADT7；3. pGBKT7：S1-mat + pGADT7；4. pGBKT7：S2-C2HVC3 + pGADT7；5. pGBKT7：
S2-mat + pGADT7；6. pGBKT7 + pGADT7：B42；7. pGBKT7：S1-C2HVC3 + pGADT7：B42；8. pGBKT7：S1-mat + pGADT7：B42；
9. pGBKT7：S2-C2HVC3 + pGADT7：B42；10. pGBKT7：S2-mat + pGADT7：B42；11：阳性对照
（左为正常的在 SD/-Trp-Leu-Ade-His 培养基上生长的菌，右为显色后呈蓝色的菌）；
12 ~ 15：图 7 ~ 10 酵母菌的 X-α-gal 显色。
Fig. 6 The interaction between MdD1 and S-RNase in yeast
1. pGBKT7 + pGADT7；2. pGBKT7：S1-C2HVC3 + pGADT7；3. pGBKT7：S1-mat + pGADT7；4. pGBKT7：S2-C2HVC3 + pGADT7；5. pGBKT7：
S2-mat + pGADT7；6. pGBKT7 + pGADT7：B42；7. pGBKT7：S1-C2HVC3 + pGADT7：B42；8. pGBKT7：S1-mat + pGADT7：B42；9. pGBKT7：
S2-C2HVC3 + pGADT7：B42；10. pGBKT7：S2-mat + pGADT7：B42；11. Positive control（Left：Normal yeast on SD/-Trp-Leu-Ade-His；
Right：Blue yeast after X-α-gal assay）；12–15. X-α-gal assay for picture 7–10.

β 1 β 2 β 3α 1
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2.6 MdD1 的苹果组织特异性表达分析
以‘国光’苹果叶片、萼片、花瓣、子房、小花药、中花药、花柱的 cDNA 为模板，PCR 扩增
MdD1 基因，结果显示：它在各个组织中都有表达（图 7），但在花药中表达量最高。这表明该基因
可能为组成型表达。
研究发现，在成熟的花粉粒中，储备了大量的 mRNA，花粉的萌发初期才会被大量翻译，参与
花粉管萌发和伸长（Mascarenhas，1988）。这暗示了 MdD1 与花粉的成熟、萌发可能具有密切地联
系。


图 7 MdD1 在‘国光’各个组织中的特异性表达分析
L：叶片；SE：萼片；P：花瓣；O：子房；SA：小花药；MA：中花药；ST：花柱。
Fig. 7 Expression pattern in several tissues of the MdD1
L：Leaf；SE：Sepal；P：Petal；O：Ovary；SA：Small anther；MA：Middle anther；ST：Style.

3 讨论
本研究中利用花柱 S2-RNase 上包含可能参与特异性识别的 HV 区和核酸酶活性必需的 C2、C3
区——即 C2HVC3 区为诱饵，筛选‘国光’苹果（S1S2）花粉 cDNA 文库，获得小分子的带正电荷
的 γ–硫堇 MdD1。根据其序列和高级结构特征推断它属于 AMPs 家族下的硫堇亚家族。这是在苹
果花上首次得到的硫堇基因。苹果上得到的第一个硫堇是在种子里分离得到，且与苹果的抗火疫病
相关（Romeiro et al.，1981；Goodman，1983）。目前，γ–硫堇在烟草（Gu et al.，1992）、矮牵牛
（Karunanandaa et al.，1994）、甜高粱（Bloch & Richardson，1991）、豇豆（Melo et al.，2002）等
都有报道，多分布在胚乳、茎、根、黄化或染病的叶片及花中。植物上的大多数硫堇具有抗菌活性，
此外，有些硫堇还能抑制昆虫的淀粉酶或某些蛋白酶的活性而参与植物防御（Melo et al.，2002；
Pelegrini & Franco，2005；Pelegrini et al.，2008）。
本研究中所得的多肽 MdD1，含 64 个氨基酸，分子量为 7 018.1 D，比以往获得的含 45 ~ 47 个
氨基酸、分子量为 5 000 D 的硫堇（Florack & Stiekema，1994）略微大。另外，有人认为 γ–硫堇
（gamma-thionin）即是植物防御素，为 45 ~ 54 个氨基酸（Pelegrini et al.，2008）。由此，多肽 MdD1、
防御素、γ–硫堇三者相似的结构暗示了共同的起源及相似的功能，但分子量和序列的差异又预示着
多肽 MdD1 的功能与它们又不完全相同。
该多肽尽管在各个组织中都有表达，但在花药中表达量尤其高。则说明它可能与花粉的成熟、
萌发，花粉管的伸长或花粉花柱互作具有密切联系。尽管有富含半胱氨酸的多肽作为细胞信号分子
参与自交不亲和中特异性识别的报道（Suzuki et al.，1999；Takayama et al.，2000；Wheeler et al.，
2009），但由于酵母系统中 MdD1 与 S-RNase 二者互作的非特异性，故排除二者的互作介导花粉花
柱的特异性识别，且推断 MdD1 可能是作为非 S 因子参与自交不亲和。
S-RNase 的活性是拒斥花粉反应所必需的（Huang et al.，1994）。有文献指出：花粉中可能存在
核酸酶抑制子（RI）能对 S-RNase 的活性产生抑制（Golz et al.，2001；Luu et al.，2001）。推测 MdD1
8 期 孙会玲等：苹果花粉中与花柱 S-RNase 互作的 γ–硫堇筛选及鉴定 1445

可能像某些硫堇一样，具备蛋白酶抑制剂活性而抑制 S-RNase 的活性。由于参与特异性识别的高变
区处在活性区（或说 RI 结合区）C2 和 C3 区中间，而负责特异性识别的花粉因子能识别自我 S-RNase，
从而阻碍 MdD1 对自我 S-RNase 活性的抑制，进而自我 S-RNase 能发挥细胞毒性作用，降解花粉管
RNA（McClure et al.，1990）。这与抑制剂模型（Luu et al.，2001）理论一致。以上假设需要通过检
测 MdD1 与 S-RNase 的互作是否发生在花粉管及互作后 S-RNase 的活性是否下降等验证。
综上所述：MdD1 可能是作为非 S 因子参与自交不亲和，对于是否充当核酸酶抑制子还有待于
进一步的研究。

References
Agatep R，Kirkpatrick R D，Parchaliuk D L，Woods R A，Gietz R D. 1998. Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium
acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol（LiAc/ss-DNA/PEG）protocol. Technical Tips Online（http：//tto. trends. com）.
Alejandro R P，Ushijima K，Koba T，Sassa H. 2009. Identification and functional analysis of pistil self-incompatibility factor HT-B of Petunia.
Journal of Experimental Botany，60 (4)：1309–1318.
Anderson M A，Cornish E C，Mau S L，Williams E G，Hoggart R，Atkinson A，Bonig I，Grego B，Simpson R，Roche P，Haley J D，Penschow
J，Niall H D，Tregear G W，Coghlan J P，Crawford R J，Clarke A E. 1986. Cloning of cDNA for a stylar glycoprotein associated with expression
of self-incompatibility in Nicotiana alata. Nature，321：38–44.
Beecher B，McClure B A. 2001. Effects of RNases on rejection of pollen from Nicotiana tabacum and N. plumbaginifolia. Sex Plant Reprod，14：
69–76.
Bloch C J，Richardson M. 1991. A new family of small（5 kDa）protein inhibitors of insect alpha-amylases from seeds orsorghum（Sorghum bicolor
L. Moench）have sequence homologies with wheat gamma-purothionins. FEBS Letter，279 (1)：101–104.
Chang S J，Puryear J，Cairney J. 1993. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter，11：
113–116.
de Nettancourt. 1997. Incompatibility in angiosperms. Sexual Plant Report，10：185–199.
Florack D E A，Stiekema W J. 1994. Thionines：Properties，possible biological roles and mechanisms of action. Plant Molecular Biology，26：
25–37.
Gietz R D，Woods R A. 2002. A transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in
Enzymology，350：87–96.
Goldraij A，Kondo K，Lee C B，Hancock C N，Sivaguru M，Vazquez-Santana S，Kim S，Phillips T E，Cruz-Garcia F，McClure B. 2006.
Compartmentalization of S-RNase and HT-B degradation in self-incompatible Nicotiana. Nature，439：805–810.
Golz J F，Oh H Y，Su V，Kusaba M，Newbigin E. 2001. Genetic analysis of Nicotiana pollen-part mutants is consistent with the presence of an
S-ribonuclease inhibitor at the S locus. Proceedings of the National Academy of Sciences，98 (26)：15372–15376.
Goodman R N. 1983. Occurrence and possible role of thionin-like proteins in apple，tomato，melon and rice seed. European Journal of Plant
Pathology，89 (6)：306–307.
Gu Q，Kawata E E，Morse M J，Wu H M，Cheung A Y. 1992. A flower-specific cDNA encoding a novel thionin in tobacco. Molecular and General
Genetics，234：89–96.
Hua Z，Kao T H. 2008. Identification of major lysine residues of S3-RNase of Petunia inflata involved in ubiquitin–26S proteasome-mediated
degradation in vitro. The Plant Journal，54 (6)：1094–1104.
Huang J，Zhao L，Yang Q，Xue Y. 2006. AhSSK1，a novel SKP1-like protein that interacts with the S-locus F-box protein SLF. Plant Journal，46：
780–793.
Huang S，Lee H S，Karunanandaa B，Kao T. 1994. Ribonuclease activity of Petunia inflata S proteins is essential for rejection of self-pollen. Plant
Cell，6 (7)：1021–1028.
Karunanandaa B，Singh A，Kao T H. 1994. Characterization of a predominantly pistil-expressed gene encoding a γ-thionin-like protein of Petunia
inflate. Plant Molecular Biology，(26)：459–464.
1446 园 艺 学 报 38 卷
Kubo K，Entani T，Takara A. 2010. Collaborative non-self recognition system in S-RNase-based self-incompatibility. Science，330 (6005)：796–
799.
Lai Z，Ma W，Han B，Liang L，Zhang Y，Hong G，Xue Y. 2002. An F-box gene linked to the self-incompatibility (S) locus of Antirrhinum is
expressed specifically in pollen and tapetum. Plant Molecular Biology，(50)：29–42.
Lee H S，Huang S，Kao T H. 1994. S proteins control rejection of incompatible pollen in Petunia inflata. Nature，367：560–563.
Li Wentao，Chetelat R T. 2010. A pollen factor linking inter- and intraspecific pollen rejection in tomato. Science，330 (6012)：1827–1830.
Luu D T，Qin X，Laublin G，Yang Q，Morse D，Cappadocia M. 2001. Rejection of S-Heteroallelic pollen by a dual-specific S-RNase in Solanum
chacoense predicts a multimeric SI pollen component. Genetics，159 (1)：329–335.
Mascarenhas J P. 1988. Anther and pollen expressed genes//Verma P S D，Goldberg R B. In temporal and spatial regulation of plant genes. New
York：Springer Verlag：97–115.
McClure B A，Gray J E，Anderson M A，Clarke A E. 1990. Self-incompatibility in Nicotiana alata involves degradation of pollen rRNA. Nature，
347：757–760.
McClure B A，Mou B，Canevascini S，Bernatzky R. 1999. A small asparagines-rich protein required for S-allele-specific pollen rejection in Nicotiana.
Proceedings of the National Academy of Sciences，96：13548–13553.
McClure B A，Cruz-Barcia F，Beecher B S，Sulaman W. 2000. Factors effecting inter- and intra-specific pollen rejection in Nicotiana. Journal of
Experimental Botany，85：113–123.
Melo F R，Rigden D J，Franco O L，Mello L V，Ary M B，Grossi de S M F，Bloch C J. 2002. Inhibition of trypsin by cowpea thionin：
Characterization，molecular modeling，and docking. Proteins，48：311–319.
Murfett J，Atherton T L，Mou B，Gassert C S，McClure B A. 1994. S-RNase expressed in transgenic Nicotiana causes S-allele-specific pollen
rejection. Nature，367：563–566.
Pelegrini P B，Lay F T，Murad A M，Anderson M A，Franco O L. 2008. Novel insights on the mechanism of action of α-amylase inhibitors from the
plant defensin family. Proteins：Structure，Function & Bioinformatics，73 (3)：719–729.
Pelegrini P B，Franco O L. 2005. Plant-thionins：Novel insights on the mechanism action of a multi-functional class of defense protein. The
International Journal of Biochemistry & Cell Biology，37：2239–2253.
Puerta A R，Ushijima K，Koba T，Sassa H. 2009. Identification and functional analysis of pistil self-incompatibility factor HT-B of Petunia. Journal
of Experimental Botany，60 (4)：1309–1318.
Romeiro R，Karr A L，Goodman R N. 1981. Isolation of a factor from apple that agglutinates Erwinia amylovora. Plant Physiology，68 (3)：
772–777.
Sijacic P，Wang X，Skirpan A L，Wang Y，Dowd P E，McCubbin A G，Huang S，Kao T H. 2004. Identification of the pollen determinant of
S-RNase-mediated self-incompatibility. Nature，429：302–305.
Sims T L，Ordanic M. 2001. Identification of a S-ribonuclease-binding protein in Petunia hybrida. Plant Molecular Biology，47 (6)：771–783.
Suzuki G，Kai N，Hirose T，Fukui K，Nishio T，Takayama S，Isogai A，Watanabe M，Hinata K. 1999. Genomic organization of the S locus：
Identification and characterization of genes in SLG/SRK region of S9 haplotype of Brassica campestris（syn. rapa）. Genetics，3：391–400.
Takayama S，Shiba H，Iwano M，Shimosato H，Che F S，Kai N，Watanabe M，Suzuki G，Hinata K，Isogai A. 2000. The pollen determinant of
self-incompatibility in Brassica campestris. Proceedings of the National Acaemy of Sciences，97 (4)：1920–1925.
Ushijima K，Sassa H，Dandekar A M，Gradziel R M，Tao R，Hirano H. 2003. Structural and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus
of almond：Identification of a pollen-expressed F-box gene with haplotype-specific polymorphism. Plant Cell，15：771–781.
Wheeler M J，de Graaf B H，Hadjiosif N，Perry R M，Poulter N S，Osman K，Vatovec S，Harper A，Franklin F C，Franklin-Tong V E. 2009.
Identification of the pollen self-incompatibility determinant in Papaver rhoeas. Nature，459：992–995.
Zhao L，Huang J，Zhao Z H，Li Q，Sims T L，Xue Y B. 2010. The Skp1-like protein SSK1 is required for cross-pollen compatibility in S-RNase-based
self-incompatibility. Plant Journal，62 (1)：52–63.