全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 289
碳酸钙胁迫下枳壳愈伤组织的某些生理生化指标变化
吉前华*
肇庆学院生物系，广东肇庆 526061
提要 测定碳酸钙(CaCO3)胁迫下枳壳愈伤组织的某些生理生化指标的结果表明：除全 Fe 含量外，CaCO3 浓度与过氧化
物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、活性 Fe 含量、可溶性蛋白质含量、愈伤组织增重
均呈显著或极显著负相关，与培养液 pH 值呈显著正相关；随着培养的进程，POD 活性、活性 Fe 和可溶性蛋白质含量、
愈伤组织增重呈降低趋势，SOD 和 CAT 活性先升后降，含高浓度 CaCO3 的培养液 pH 值仅在 20 日左右略有降低。
关键词 枳壳； 愈伤组织； 碳酸钙(CaCO3)胁迫； 生理生化指标
Changes in Several Physiological and Biochemical Indexes in Callus Tissue of
Poncirus trifoliata Under Calcium Carbonate Stress
JI Qian-Hua*
Department of Biology, Zhaoqing College, Zhaoqing, Guangdong 526061, China
Abstract The results of the physiological and biochemical indexes in callus tissue of Poncirus trifoliata tested
under calcium carbonate(CaCO3) stress indicated that except total iron content, the negative correlations among
CaCO3 concentration and peroxidase(POD) activity, superoxide dismutase(SOD) activity, catalase(CAT) activity,
active iron content, soluble protein content and callus growth were recorded. There ware a positive correlation
between CaCO3 concentration and medium pH. With the culture time extension, POD activity, active iron
content, soluble protein content and callus growth showed a declining trend, SOD and CAT activities first
increased then decreased. The pH value in liquid medium with high concentration of CaCO3 showed slight
decline within about 20 days.
Key words Poncirus trifoliatea; callus tissue; CaCO3 stress; physiological and biochemical index
收稿 2004-11-24 修定 　 2005-04-11
资助　 肇庆学院科研项目(02210)。
*E-mail: qhgee@zqu.edu.cn, Tel: 0758-2716418
地球上石灰性土壤广泛分布在南纬10~40°和
北纬10~40°之间的地区。石灰诱导失绿症是石灰
性土壤上作物最主要的营养失调综合症[1]，也是
我国柑桔生产中的严重问题，尤以四川最为突
出。四川土壤中碳酸钙(CaCO3)含量高，一般为
5%~10%，pH 7.5~8.5[2]，严重影响植株的生长
和产量，造成植株减产 30%~ 4 0 %，甚至根本无
收成，特别是综合性状良好的柑桔当家砧木——
枳壳砧柑桔园表现尤为严重。因此，筛选和培育
抗性材料已成为目前和今后解决缺铁失绿问题的根
本出路，同时，通过逆境反应及可能机制选择用
于早期、快速、准确、简便、有效的诊断缺铁
黄化及筛选柑桔铁高效基因型指标是非常重要
的[3]。本文检测了 CaCO3 胁迫条件下枳壳愈伤组
织的某些生理生化指标的变化。
材料与方法
六年生的枳壳(Poncirus trifoliata)实生树取自
四川农业大学柑桔园，用其嫩梢离体培养获得绿
色瘤状愈伤组织。
材料培养 25 d 后，进行液体滤纸桥静置培
养。基本培养基为MT培养基(3%蔗糖，pH 5.8)，
分别添加 0、0.1%、0.4%、0.7%、1% 的 CaCO3
进行胁迫培养。接种前称愈伤组织鲜重，测定培
养液的 pH 值，取培养 5、10、15、20、25 d
的愈伤组织和培养液进行测定。重复 3 次。培养
条件为光照16 h·d-1，光照度36 mmol·m-2·s-1左右，
温度 24℃，相对湿度 60% ~ 8 0 %。
全铁含量测定参照文献 4 的高氯酸、浓硝酸
消化法，活性铁含量测定参照杨玉爱[5]的HCl浸提
法。用日本岛津AA-646型原子吸收分光光度计测
定。工作条件：波长 2 483 Å，灯电流 10 mA，
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空气流量7.0 L·min-1，进样量6.0 mL·min-1，乙
炔流量1.5 L·min-1。
可溶性蛋白质含量测定参照文献 6 的考马斯
亮蓝G-250法。过氧化物酶(peroxidase, POD)活性
的测定参照文献 7 的愈创木酚法。过氧化氢酶
(catalase, CAT)活性的测定参照文献8的过氧化氢
法。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)
活性的测定参照文献 7 的氮蓝四唑法。用日本岛
津UV-265 型紫外 - 可见光分光光度计测定。
愈伤组织增重=收获愈伤组织鲜重-接种愈伤
组织鲜重。培养液pH用 PHS-10A数字酸度/离子
计测定。
实验数据采用SPSS for Windows软件包进行
回归分析、曲线拟合和相关分析。
结果与讨论
1 愈伤组织的增殖
非胁迫条件下培养的愈伤组织增殖呈S形(图
1)。含 0.1% 和 0.4% CaCO3 的培养液中愈伤组织
增长较前者缓慢，而 0.7% 和 1% CaCO3 胁迫条件
下培养的在第 10~15 天已经达到最大增殖量，但
不及同期非胁迫条件下培养的，之后呈明显的下
降趋势，第 25 天，1.0% CaCO3 胁迫条件下培养
的愈伤组织(相对于接种量而言)呈现微弱的负增
长，这可能与部分愈伤组织死亡有关。第 25 天，
愈伤组织的增殖量与CaCO3 浓度和培养液pH值呈
极显著负相关(r=-0.963**、-0.978**)，与 POD、
SOD、CAT 活性和活性铁含量呈显著或极显著的
正相关(r=0.988**、0.984**、0.985**、0.892*)。
2 愈伤组织中的全铁和活性铁含量变化
图 2 显示：
(1) 非胁迫条件下培养的愈伤组织中全铁含量
基本稳定[58~70 mg·g-1(FW)]。胁迫条件下培养
5 d的全铁含量高于非胁迫条件下培养的，并且随
着 CaCO3 浓度的增加而增加；随着培养天数的增
加，0.1% 和 0.4% CaCO3 胁迫条件下培养的呈下
降趋势，0.7% 和 1% CaCO3 胁迫条件下培养的在
5~20 d 呈下降趋势，第 25 天迅速回升，出现异
常富集[126.08 mg·g-1(FW)]。相关分析表明，第
25天，全铁含量与各因素间相关性均未达到显著
水 平 。
(2) 非胁迫条件下培养的愈伤组织中活性铁含
量随培养天数的增加而略有增加；胁迫条件下培
养5 d的愈伤组织中活性铁含量随CaCO3浓度的增
加而增加，均高于非胁迫条件下培养的，以后均
呈下降趋势，随着 CaCO3 浓度的增加而加快，且
含量均低于非胁迫条件下培养的。相关分析表
图1 CaCO3胁迫下愈伤组织的增殖量
Fig.1 Increment of callus under CaCO3 stress
图2 CaCO3胁迫下愈伤组织中全铁和活性铁含量的变化
Fig.2 Changes in total iron and active iron
contents in callus under CaCO3 stress
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 291
明，活性铁含量与 C a C O 3 浓度呈显著负相关
(r=-0.941*)，与 POD、SOD、CAT 活性，可溶
性蛋白质含量和愈伤组织增殖量呈显著正相关
(r=0.887*、 0.931*、 0.875*、 0.939*、 0.892*)。
本文结果表明，在愈伤组织中的活性铁含量受
CaCO 3 浓度的影响显著。
3 培养液pH值的变化
图3表明，不含CaCO3 的培养液pH值一直保
持最适水平(pH 5.8); 含0.1% CaCO3的培养液pH
值随着培养天数的增加而略微下降；含 0 . 4 %、
0.7%和 1% CaCO3 的培养液pH值在第 5~15天期间
无明显变化，而第15~20天则略微下降，第20天
后又有回升。枳壳在植株水平上表现为抗缺铁失
绿能力差[9~11]，其愈伤组织在含不同浓度CaCO3的
培养液中，改变培养液 pH 值的能力也较差，含
高浓度 CaCO3 的培养液中尤其是如此，这可能与
枳壳在细胞水平上耐盐能力差有关。
4 愈伤组织中可溶性蛋白质含量的变化
非胁迫条件下培养的愈伤组织中可溶性蛋白
质含量在第 5、15 天出现 2 个高峰；CaCO3 胁迫
条件下培养的均比非胁迫条件下培养的含量低，
并且随着 CaCO3 浓度的增加而明显下降，各种浓
度 CaCO3 胁迫条件下培养的可溶性蛋白质含量变
化均只出现 1 个峰值，分别出现在第 5、10、15
天(图 4)。CaCO3 浓度显著影响愈伤组织中可溶性
蛋白质的含量(r=-0.917*)。
5 愈伤组织的抗氧化酶活性变化
由图 5 可见：POD 活性随着培养进程呈上升
趋势，非胁迫条件下培养的POD 活性在第10、25
天分别出现 2 个高峰，胁迫条件下培养的 POD 活
性低些，且随着 CaCO3 浓度增加而下降，培养到
第 25 天时，POD 活性与 CaCO3 浓度和培养液 pH
值呈显著负相关(r=-0.951*、-0.937*)，表明胁迫
条件下酶活性受抑；CAT 活性在非胁迫条件下培
养的呈上升趋势，胁迫条件下培养 5 d 较非胁迫
条件下培养的有所升高，以后呈下降趋势，随着
CaCO3 浓度的增加而加快；SOD 活性在各种培养
条件下均呈下降趋势，不同 CaCO3 浓度之间 SOD
活性变化趋势与CAT相同。培养25 d的愈伤组织
中，CAT 和 SOD 活性与 CaCO3 浓度呈显著负相关
(r=-0.954*、-0.945*)，与培养液pH值呈显著或
极显著的负相关(r=-0.965**、-0.932*)，表明两种
酶在胁迫条件下培养初期活性升高，随着培养天
数和 CaCO 3 浓度的增加，从总体上说是受抑的。
相关性分析显示 SOD 与 CAT(r=0.955*)、SOD 与
POD(r=0.967**)、POD与 CAT(r=0.988**) 3种酶之
间也呈显著或极显著的正相关。各种逆境因素对
保护酶系统活性有不同程度的抑制，而且不同基
因型之间有差异，枳壳比其他柑桔属植物更易受
到伤害[12~16]。本文中不同浓度 CaCO3 在不同程度
上抑制枳壳中 POD、CAT 和 SOD 的活性的结果，
显示 CaCO3 胁迫下保护酶系统活性下降可能与枳
壳愈伤组织不耐盐有关。另外，C A T 和 P O D 均
属于含铁酶， 细胞内活性铁含量降低也可能会使
CAT 和 POD 活性下降，因而两者在 CaCO3 胁迫下
均呈下降趋势。
图3 CaCO3 胁迫下培养液pH值的变化
Fig.3 Changes in pH in medium under CaCO3 stress
图4 CaCO3胁迫下愈伤组织中可溶性蛋白质含量变化
Fig.4 Changes in soluble protein content in
callus under CaCO3 stress
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月292
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图 5 CaCO3 胁迫下愈伤组织中 POD、
CAT 和 SOD 活性的变化
Fig.5 Changes in the activities of POD, CAT and
SOD in callus under CaCO3 stress