全 文 ： 47一
广 西 植 物 Guihaia 20(1)：4 7—51 2000年 2月
文 章 编号 {lI{)0—3I42【20{10)()I一0047—05
农杆菌介导的枳壳转化系统建立研究初报 “
．一冲
韩美丽 ，李耿光 ，贺 红 ， 、／ 。y张兰英 ， 陆荣生a sf竹
t L巾国科学脘华南植I打研究所，广东广州 510650}2．中国农科脘华南生物技术重点实验室
海有 海口 ~1oooo}3．广西林业科学院 ．广西南宁 530001)
摘 要 ： 枳壳 为对象．进行 丁农杆菌介导的上胚轴转化系统建立研究 ，得到 了携带柑 桔衰退癀病
毒外壳蛋 阜基因的枳壳转化植株 研究表明：枳壳各类外植体中，上胚轴是较好 的转 化材料 }上胚轴
出芽部位主要在形态学上端。以卡那霉索为选择剂，外植 体水平面放置时 ，选择剂 的剂量是 50～70
n 】J。转化研究中发现 感染液中乙酰丁香酮 100l~mol／L的加人促进转化外植体 Gus表达阳性事的
提 高 。延 迟 1-t的 选择 培 养 ．有 助 于 Gus阳性 芽 的增 多 。所 得 Gu,s阳性 无 性 系 经 Southern blot杂 交
榆测 ，证明外褫基因已稳定整合到 了植物基因组中．所得 Gus阳性植株确为携带柑桔衰退病病毒外
壳 蛋 白基 因 的转 化 植株
关键词：埋墨；转化； ；在童 亘 簟
中 围分 类号 ：Q943．1 文 献 标识 码 ：A
琉枷南村． 枷确 都毛鼍 钿
Prel im inary study on establ ishment of transfor-
mation system in Poncirus trifoliata Raf．
HAN M ei LI Geng—guang ，HE Hong ，ZHANG Ying—dong。，
ZHANG Lan—ying ，LU Rong—sheng。
‘1-S,~th‘ i n h d j 洲 ，·Acadt~nySinica-Guangzhou 510050，ChinaI 2．B#I￡ IH g
l n|Agni ni‘ “ A -my i CMna Haikou 510000tChina }
3．F Y Academ~ nf G~ g．ti Nanaing 530001，China 1
Abstract：Tran sfornmdon and regeneration of Poc~ctru$trifoliata Raf．plants wele．studied by Agrobac-
~erium—mediated．Transgenlc plants with CTv_cp have been obtained．of the various explants，epi．
cotyls are suitable for transformation reseach．Shoot is formed on basal end of the epicotyh Segment．
As n selection agent，the concentration of kanmaycin is 50～ 70 mg／L．The frequeney of explants with
“Il positive was promoted when 100,umol／L acetosyingone was added in Agrobacterium suspension
liquid-It幅 u ful for Gus positive shoot producing when selectable cultivation is postponed tor 1 day．
牧稿 日期：1999一o3—01
作者简介：韩美丽‘l 063一)-女．101-J：．高短工程师，目前从事生物技术育种研究 。理工作单位及通信地址为 ：广西南宁市 邕
武路 舶 号．广 西幸I业 科 学研究 院 ，邬蝙 ：530001．
基金项 日：国家 自然科学基金(30870539)、广东省 自然科学基盘(980478)赘助项 日的一部分
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48 广 西 植 物 20卷
DNA flag：nent fr(inl plasmid oGA482GG ·which cut hy Nco I E used a probe．foreign gene
1s Dr1l1’ed going t1)I trijblla~“by Southern blot
Key words： ，J r州r1I1 eritbliaz“ Raf ；t r I sf【】r【]】at10“；epicotyls；Agrabarlertum
遗传 转化技 术 是 80年代 兴起 的一 门新型 育种技术 ，自它同世 以来 ，就 以其严格 的定 向性 、
高教 性受 到育种 工作者 的欢迎 。枳壳是 柑桔 种 中的一个重要 品种 ，它既是 柑桔 的优 良砧 木 ，又
有 重要 的 医药价 值 ，可 治疗 多种 常见 内外科疾病 随着柑 桔种植业 及医药 行业 的发展．对枳壳
产量品质的要求也 日益提高，培育抗病优质的枳壳新品系已为当前的急迫任务。国内外已有多
起柑桔 属植 物转基 因成功 的报道 (Kobayashi S，et al，1 989；Moore GA，et al，1 992；I eandro
P，et al，1995)，但转入基因多为报告基因及选择基因，目的基因转入的公开报道尚很少。因此
我们 以机 壳为 对 象 ，柑桔 衰 退病病 毒 外壳蛋 白基 因为 目的基 因，农 杆 菌为 载 体进 行 了转化 研
究 ，已建 立 了有效 的上 胚轴转化 系统 。
1 材料 与方法
植物 材料 枳壳 (Ponch t,．ij iata Raf)种 子 ，经 常 规方 法 消 毒 ，播 种 于 MS固体 培 养基
中 ，25～ 30 C黑 暗下萌发 待用
再生 系统建立：以MT附加 BA5 mg、NAA0．5 mg／I 为分化培养基，研究外植体种类 、放
置方 式等 因素对 外植 体再 生 影响 ，并确定选择 剂 的浓度 。
农杆菌菌株与质粒：农杆菌菌株为 EHA101，含质粒载体 pGA482GG。质粒上插有 35 S启
动子驱动 的外源 目的基因 ：柑桔衰退病病毒外壳蛋 白基 因(CTV—ep)及 Gus、NTP—i基 因，
CTV cp基 因全长 669 bp，插 ^位点为 Neo I位 点 。该 质粒图谱 如图 l。
农 杆 菌 液 体 培养 基 为 YEP附
加 卡那 霉 素 (Km)50 vg／m[ ，拟 潮
霉 索 6O~zg／mI 。转化前 挑单菌 落接
种 于 5O mI，液体 培养基 中 ，28 C黑
暗 下 12(3 r／rain振 荡 培养 至对数 期
(()D 600= 0 8～ 1．0)，然 后 3 000
r／rain离 心 10 rain，除去 上清 液 ，用
再 悬浮 液悬浮 待用
3lr∞
转 化 方 法 ；将 安生 苗 上胚 轴切
0．5 em 长 ，在农杆 菌 悬 浮液 中浸 泡 携带柑 眦 叩
20 min，滤 纸 吸去 多余 的菌液 ，放 共 Fiz．1 Sehematic m entati0n 0fthe pGA482GG
培 养基 上 ，26～28 C黑 暗下 共培 养 transforraation plasmid·
3 d，转 至选 择 培 养 基 上 选 择 培 养 。 ’ R 右边再
．
L 左 边 异 一m 动子 。H。
- HindI
为 了提 高转 化 效 率 ，进 行 了 不 同浓 一№ 一CT tP一柑怙囊退病府毒外竞蛋白
度酚类化台物、延迟选择时间对 Gus阳性芽产生率的影响研究。农杆菌悬浮液 、共培养基、分
化 培 养基 的 基本 成分 均为 MT，分 化培养 基 附加先 锋霉 亲 (Cef)300 mg／I 及 相应 的卡 那 毒 亲
(Kin)。选择过 程均在 26~Z8 C下光下 进行 ，光照强 度 l 400 ix，光 照时 间每 天 12 h。
Gus基 因表达 测定 ；采用组织 化学染色 法 。
植 物 DNA 及 质粒 DNA提 取分别采用 SDS法“ 、碱裂解 法 。质粒 DNA经 Neo I酶切 消
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1期 韩美丽 等 ：农 杆菌介导 的帜壳转化 系统建立研 究初 报
化后 ，采用 DiG 标 记法制 成探 针 ({DIG DNA Labeling and Detection Kit~User’S Guide，1989)。
Southern blot分 析采用 DiG 成套试 剂盒试 剂及反 应条件 (《ⅡG DNA Labeling and Detee—
tion Kit~)User’s Guide，1 989)。植物 DNA经 Nco I酶切 消化后 ，4℃下 0．8 琼脂糖上 电棘 l2
h，经 变性 ，转 移 至 NC膜上 。烘干膜后 进行预杂 交、杂交及显色 。
2 结果 与讨论 Ta1】1
2．1外植体类型对不定芽诱导
效 果的影 响
从 表 1可 看 出 ，外 植 体 类
型对不 定芽诱 导效果有 较大 的
影 响 。从外 植体 出 芽百 分率来
看 ，所 有 外植 体 中上 胚 轴 出 芽
率最 高 ，带 根上胚 轴次之 ，子 叶
最差 。从 丛 生芽所 占比例来 看 ，
也 以上胚轴 最 高 ，下 胚轴 、子 叶
较 低 。
从 出 芽所 用 的时 间 来看 ，
带 根上 胚轴 最 短 ，仅 10～ 15 d
既 可产 生大 量 的 不定 芽 ；上 胚
轴 与嫩 茎 20 d时不 定 芽 开 始
大量 出现 ；而子 叶 ，下胚轴则 需
要 30 d以上 才陆续 出芽 。
综上 ，从 农 杆 菌 介 导 的 转
化 角 度看 ，以上 胚 轴为 转 化 材
衰 1 外檀件类型对不定芽诱导效果的髟■
Effect of different explants on adventitious bud
formationin ．Trifob~zta Raf．
外 植 体类 型
Explal11
出芽外植体 芽丛大干 3的外t
91~t体毂 (个 ) 百分 比( ) 悻百 分 比( )
No．of explant~ Pe~ent 0f exp n percent or e 目
th bud wkh budd岫
裹 2 外檀件拉 量方式对授 隽上睡轴 出芽的髟■
Table 2 Effect of explants orientation On R oot formation
of epicotyl of P．trifaliata Raf．
料较好，因其除出芽率高、丛生芽所占比例高外 ，材料来源也较其它外植体充足 ，且上胚轴出芽
均在切 口处 ，易于转化材料的筛选 。
2．2外植体在培养基中的放置方式对不定芽形成的影响
从表 2可看出，接种后 20 d，形态学上端插人培养基者，出芽率为 0，形态学下■括人培募
基者出芽率为 38．0 ，平放出芽率达 48．0 。随着分化时间的延长 ，至接种后 40 d，平藏与形
态学下端插入培养基的 2个处理 ，出芽率均达到 100 ，而形态学上靖插入培养基的处理出芽
率仅为 8．0 另外 ，平放外植体 出芽部位几乎均在形态学上靖这部分 ，另一靖基奉不出芽 ，或
出芽很晚。由此可以认为外植体放置方式对出芽的影响主要在形态学上端是否人墙井薹中，如
形态学上端插入培养基中，则另一端出芽率很低。因而转化研究中应注意 ，无论采用何 放置
方式 ，都 需形 态学上端 暴露于培 养基表 面 ，以便 于转化芽 的选择 。
2．3不 同浓度卡那霉素对上胚轴出芽的影嫡
从表 3可看出：外植体在培养基中放置方式不同，对卡那霉素(Kanamycin，Km)的承受髓
力也不同。以形态学下端垂直插入培养基方式培养时，外植体对 Km 的承受水平明显高子水平
放置时的承受水平。竖放时 ，Km 180mg／l 时，芽分化率才完全受到抑制。水平放置时 Km 50
mg／l 时，出芽即被完全抑制。外植体放置方式对 Km 的承受力囊捌 可糖在于：平 时，嚣嘲从
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＼
50 广 西 植 物 2O卷
培 养基 到外 植体 的运输 距 离短 ，因而细胞 中 Km 的 有效 浓度高 ；竖 放 时 ，Km 从培 养基 翻外 撞
件 的运输距 离长 ，故 Km 的有 效浓度低 。
2．4酚 类 添加剂 的浓度对 外植体 Gus瞬
时表 达阳性 率的影 响
前 人 的许 多研 究 表 明 ，酚类 化 台物
的 添 加对 农杆 菌 向植 物 细胞 的附着 、转
移 有 较大 的促 进 作用 ，因而 有 助 于转化
效 率 的 提 高 (Kaneyoshi at a1．1994，
Nobyoshi S at a1．1 990) 在本 研究 中也
表现 了这一 点 。结 果见表 4
从表 4可 看 出 ，农杆 菌 感染 液 中 一
定浓 度 的 乙酰 丁香 酮 (As)的添 加 有 助
于 Gus瞬 时 表 达 阳性 外植 体 百 分 率 的
提 高 。不加 As时 、Gus瞬时 表达 阳性的
因而在 选择 培养时应 注意外植 体的放 置方 式 。
表 3
T
卡都霉■浓度对枫壳上 旺轴芽骺戚的髟一
3 Effect of kanamycin on shoot formation of
epicoty[in P．1rifoliata Raf．
各址 理外 植 悻戢 均为 45 N0．0f explant*per treattmmt 45
外植 体 百分 比仅 48．0 ，而 加 As后 ，(；us阳性 外植 体 的 比例 明显 上 升，至 Asl00~mol／l 时 ．
Gus阳性 外植 体 百 分率 最 高达 84．0 ；As浓度 超 过 100 vmol／I ，促 进 作用 逐 渐下 降 ；Asl~1)
~mol／I 时，开始有抑制作用。可以认为一定浓度 As的加人促进了植物细胞 内与农杆菌天鼻!l来
和力有关的基因的高效表达，因而 Gus阳性外植体的比例有所提高 但由于酚类化台物对植
物细胞也有一定的杀伤力，故 As加人浓度不可过高，时间也不可过长，以免造成外植体死亡。
2．5延迟选择时间对 Gas阳
性芽产生百分辜的影响
转化细 胞选择 过程中 ，选
择 剂 的加 人时 间及加 人 的起
始 浓 度对 转化 效率 的 高 低 有
很大 的影响 加入 时间过早 ，
浓度过 高 ，转化 细胞 尚未恢 复
表 4 乙tT譬一 (As)对卦檀体 G B一时囊达阳性隼 的■一
Tabte 4 Effect of concentration of As∞ frequeney of explants with
Gus transient expre,~cdon positive in P．trifoliala Raf．
生长 ，且 抗性基 因也未充分 表 各址理外植伴觳为50十 N㈣ 唧 h啡 pe 咖memis SO
达，因此外植体易于死亡，从而造成总的转化率下降；加人时间过晚，或裱霞过低，未转化的细
胞有可能未经选择剂的破坏而存括下来，造成假抗性芽大量的发生，给调定工作带来一定 困
难 。
从表 5中可看出，适当的延迟选择有助于转化效率 的提高。在 Kin70 mg／I 盼浓度下，蹙
迟0 d与 1 d选择的转化效率最高，产生抗性芽的外植体的百分率1分别为 15．0 、22；6 ，产
生 Gus阳性芽的外植体的百分率分 1达到 13．3 、20．3 ．延迟 3 d以后，具抗性芽的井植
体所占百分率上升，而具 Gus阳性芽的外植体的百分率下降，假抗性芽增多。因而最佳的建迥
时间应 为 l d。
另 外要 注 意的是 ：共 培 养 3 d所调查 的不同 品种 的 Gus阳性，F植 体 所 占比例 ，仅是 Gus基
因瞬时表达的情况，外源基因与植物基因组的结台是极不稳定的，在选择过程中常存在外薄基
因丢失现象 ，这种现象的存在 ，使实验结果出现一些矛盾现象，即共培养后 Gus瞬时表达率膏
而经 长期选 择后得 到的转化植 物却很少 ，甚 至没有 。这种现象在 表 5中也得到 证宴 这种理 象
韵产生可能与外源基因稳定整台与瞬时表达所需的植物生理状态不河有关 ，需在髓方嚣港一
=-1=■■_
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l期 韩 美丽等 ：农扦 菌介导 的枳壳转化 系统建立 研究初 报 5l
步研究 以提高转化效率，并且在转化研究不能仅 抗性产生率为选择标准 ，必需经过 Gas检
测及分 子硷测 ，以排除 假抗 性 及假 5It性 芽
2．6转 化体 的分子 鉴定
在 (；-us测 定 阳 性 基 础
上 ， 枳 壳 的 GU,S阳性 无 性
系为对象 ，进 行 了分予检测 ，
以确 定外 源基 因是 否稳定整
合 到 了植物 基 因组 中
从 Southern blot杂 交
结 果 可 看 出 ：所 测 定 的 6个
枳 壳 G-us阳 性 无 性 系 与 质
粒 均在预 期 的 669bp位点处
表 5 延迟选择时间对 Gu,s阳性芽产生 率的影响
Table 5 Effect of delayed selection On formation of shoot
with Gus positive after cocultivation
出现同一条杂交带，对照则无 ，因而可 证明，柑桔衰退病病毒外壳蛋 白基因已稳定整合到 了
植物 基 因组 中 ，所 获得 的枳壳植株 确 为转 基因植物 。
小 结
柑 桔衰 退是柑 桔 生产 中危害较 为严重 的一种 病毒 病 ，常规 防治方 法 主要 有 药物 防治 及抗
病品 种选育 ，利 用遗传转 化技术进 行抗衰退 病品种培 育则是一种 新 的尝试 。与其它果树 品种相
比，柑桔属难转化作物，前人柑桔的研究方面转人基因多为报告基因，且所得转化宰均较低 。奉
实验从枳壳外植体再生系统建立研究出发 ，对转化研究中选择剂的使用荆量、酚类化台物对外
植体 Gu．s阳性瞬时表达率的影响、延迟选择时间对 Gus阳性芽百分率的景影响进行了较详细
的研究 ，并对 所得 (；us阳性无 性 系进 行 了分 子检测 ，最终得 到 了携 带柑桔 衰退病 病毒 外 壳 蛋
白基 因 的转化植株 ，转化率 高达 20 。 目前 国 内外 尚未有 衰退病 病 毒外 壳蛋 白基 因转 入 枳壳
的公开报道，因而本研究的出现正好填补了这方面的空白，并为柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因
向其它 品种的转 移研究 工作的开 展打下 了基 础 ，因而具有一 定的理论 与实际 意义 。
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