全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 827
钙参与铜诱导的小麦根中NADPH氧化酶活性的升高
郝福顺 1,*，孙立荣 1,2，崔香环 1
1河南大学农业生物技术研究所，生命科学学院，河南开封 475004；2辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连 116029
提要：研究钙离子(Ca2+)在重金属铜诱导的小麦根质膜 NADPH氧化酶活性变化中作用的结果表明，Ca2+以剂量依赖的
方式提高NADPH氧化酶活性，且这种增加效应可完全为Ca2+螯合剂乙二醇 -双 -(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)所抑制。用
Ca2+通道阻断剂氯化镧和异搏定以及EGTA预处理小麦根可抑制铜诱导的NADPH氧化酶活性升高，这类抑制效应也是
剂量依赖的。这些结果说明Ca2+参与铜诱导小麦根NADPH氧化酶活性和活性氧产生的调节过程。
关键词：小麦；钙；铜；NADPH氧化酶
Calcium Was Involved in Copper-induced Increment of NADPH Oxidase Ac-
tivity of Roots in Wheat (Triticum durum D.) Seedlings
HAO Fu-Shun1,*, SUN Li-Rong1,2, CUI Xiang-Huan1
1Institute of Agricultural Biotechnology, College of Life Science, Henan University, Kaifeng, Henan 475004, China; 2College of Life
Science, Liaoning Normal University, Dalian, Liaoning 116029, China
Abstract: Function of Ca2+ in the copper-induced change of plasma membrane NADPH oxidase activity in
roots of wheat (Triticum durum) seedlings was investigated. The result showed that the activity of NADPH
oxidase was significantly increased in a dose-dependent manner induced by Ca2+. Furthermore, the enhanced
effect was completely inhibited by EGTA, a kind of chelator of Ca2+. In addition, pretreatment of the wheat
roots with Ca2+ channel blockers LaCl3, verapamil and EGTA resulted in remarkable inhibition in the increase of
activity of NADPH oxidase in a dose-dependent pattern. The three inhibitors also suppressed the copper-
stimulated enhancement in the contents of superoxide radical, hydrogen peroxide and malondialdehyde (MDA).
These results suggested that Ca2+ was involved in the copper-induced regulation of NADPH oxidase activity and
the production of reactive oxygen species in roots of wheat seedlings.
Key words: wheat (Triticum durum); calcium; copper; NADPH oxidase
收稿 2007-06-05 修定 　2007-08-23
资助 河南大学博士启动基金(B20 05 06 0)。
* E-mail：haofsh@henu.edu.cn；Tel：0378-3 880007
重金属铜既是影响植物生长发育的环境因
子，又是植物必需的营养元素，但高浓度的铜对
植物有毒害作用(Halliwell和Gutteridge 1984；刘
文彰和孙典兰 1985；祝沛平等 1999；郑曦和肖
炜 2003)。已有的研究表明，铜的毒害作用与铜
导致植物产生过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2－· )
等活性氧(reactive oxygen species，ROS)密切相关
(Halliwell和Gutteridge 1984；Navari-Izzo等1998)。
铜既能通过Fenton反应产生ROS (Schützendübel和
Polle 2002)，又可通过增加质膜NADPH氧化酶的
活性产生 ROS (Quartacci等 2001)。另有研究证
实，质膜NADPH氧化酶通过产生 ROS在植物应
答生物胁迫和干旱、冷、AB A、紫外照射以及
重金属过量或缺乏等非生物胁迫反应中起作用(郝
福顺和陈珈 2005)。而且，在生物胁迫或ABA及
重金属镍作用下，NADPH氧化酶的活性受第二信
使钙的调节(Sagi和 Fluhr 2001；Jiang和 Zhang
2003；Hao等 2006)。但植物受过量铜离子胁迫
时，NADPH氧化酶的活性是否受 Ca2+调节，还
未见报道。为此，我们以小麦根为材料，研究
铜离子胁迫下质膜NADPH氧化酶活性与Ca2+的关
系，证实 Ca2+参与铜诱导的NADPH氧化酶活性
升高过程。
材料与方法
小麦(Triticum durum D.)品种‘京冬 8号’
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月828
种子来自中国农业科学院品种资源研究所。用2%
次氯酸钠消毒小麦种子 15 min后，以去离子水冲
洗干净，于 30 ℃下催芽约 24 h，种子播于置于
较大容器的带孔塑料浅盘中，容器中加入 1/10
Hoagland培养液，培养液通气并每天更换。发芽
后麦苗的培养条件为：光照 /黑暗时间 16 h/8 h，
温度 25 ℃，光强 400 µmol·m-2·s-1。
处理有：(1)用 CuSO4 (1 mmol·L-1)处理发芽
后生长 7 d的小麦根 24 h；(2)分别用 LaCl3 (2.5、
5.0、10.0 mmol·L-1)、异搏定(verapamil，0.5、
1.0、1.5 mmol·L-1)或乙二醇 -双 -(2-氨基乙基)四
乙酸(EGTA) (2.5、5.0、10.0 mmol·L-1)预处理生
长 7 d的小麦根 1 h后，用 CuSO4 (1 mmol·L-1)处
理根 24 h，以在未经预处理的 1/10Hoagland溶液
培养 24 h的根作对照，处理后剪下根，立即用于
其后的研究。
按Hao等(2006)文中的方法用两相法分离质膜
并以标志酶活性检测质膜的纯度；根据超氧阴离
子还原 1-羟苯氨3,4-四唑双 4-甲基 6-硝基苯磺酸
钠(XTT)程度确定质膜囊泡的 NADPH氧化酶活
性。
所有操作均在 4 ℃下进行。蛋白质含量测定
按 Bradford (1976)的方法。
按 Jiang和Zhang (2001)文中的方法测定超氧
阴离子含量。
根据形成的钛 -过氧化复合物在波长 415 nm
处的光吸收值确定过氧化氢含量( B r e n n a n 和
Frenkel 1977)。
按Du和Bramlage (1992)文中的方法测定根中
丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。
以上实验至少重复 3次，在 0.05概率水平上
用 Student’s t检验计算差异显著性。
结果与讨论
1 质膜的分离和纯度鉴定
我们以小麦根为材料成功分离到了质膜囊
泡，并通过测定几种不同膜的标志酶(如对钒酸盐
敏感的质膜ATP酶、线粒体膜细胞色素 c氧化酶
以及对硝酸根离子敏感的液泡膜ATP酶)活性鉴定
质膜纯度的结果表明，从提取的膜微囊(micro-
somal pellet，MIC)到质膜囊泡(plasma membrane
fractions，U3)，对钒酸盐敏感的质膜 ATP酶活
性增加 8倍之多(表 1)，说明最终得到的膜囊泡U3
富含质膜，其他细胞内膜的成分很少，据此认
为，可用来测定质膜 NADPH氧化酶活性。
表 1 小麦根膜MIC和U3中的标志酶活性
Table 1 Specific activities of marker enzymes in the
microsomal pellet (MIC) and plasma membrane
fractions (U3) from roots of wheat seedlings
MIC中酶活性 / U3中酶活性 / U3/
　 标志酶 nmol·mg-1 nmol·mg-1 MIC
(蛋白)·min-1 (蛋白)·min-1
对钒酸盐敏感的 ATP酶 57.2±2.5 461.4±28.0 8.07
细胞色素 c氧化酶 198.3±15.8 23.2±2.8 0.12
对硝酸根离子敏感的 ATP酶 15.2±1.4 3.1±0.5 0.20
表中数据为 3 次重复的平均数 ± 标准误。
图 1 铜对NADPH氧化酶活性的影响
Fig.1 Effects of copper on NADPH oxidase activity
2 铜对质膜NADPH氧化酶活性的影响
测定1 mmol·L-1铜对质膜NADPH氧化酶活性
影响的结果表明，经铜处理 2 4 h 的小麦根中
NADPH氧化酶活性显著提高，比未经铜处理的增
高 2.6倍(图1)，说明高浓度铜可提高质膜NADPH
氧化酶活性。
3 钙对质膜NADPH氧化酶活性的影响
有报道指出，Ca2+能调节NADPH氧化酶活性
(Sagi和 Fluhr 2001；Jiang和 Zhang 2003)。据此，
我们以从未经铜处理小麦根中得到的质膜囊泡为材
料，反应体系中加入Ca2+，体外检测Ca2+对NADPH
氧化酶活性影响的结果表明，Ca2+以剂量依赖的
方式显著增加NADPH氧化酶活性，而且，这种
增加效应可为 Ca2+的螯合剂 EGTA完全抑制(图
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 829
2)，Ca2+浓度超过1.0 mmol·L-1时，加与不加EGTA
之间的NADPH氧化酶活性差异达到极显著水平，
说明 Ca2+能提高NADPH氧化酶活性。
4 钙通道阻断剂和Ca2+螯合剂对质膜NADPH氧
化酶活性的影响
如图3所示，以钙通道阻断剂LaCl3和异搏定
以及 Ca2+螯合剂 EGTA预处理小麦根后，铜诱导
的质膜 NADPH氧化酶活性增加均受抑，除 2.5
mmol·L-1 LaCl3和 0.5 mmol·L-1异搏定外，经其他
浓度试剂预处理小麦根后的NADPH氧化酶活性与
图 4 Ca2+抑制剂对小麦根中O2－· 、H2O2
和MDA含量的影响
Fig.4 Effects of inhibitors of Ca2+ on O2－· , H2O2 and MDA
contents in roots of wheat seedlings
1和 2分别为小麦根用营养液(对照)和 1 mmol·L-1 CuSO4处
理小麦根 2 4 h 后测定的值。3 ~ 5 分别为用 1 0 . 0 m m o l · L - 1
LaCl3、1.0 mmol·L-1异搏定和 10.0 mmol·L-1 EGTA预处理小
麦根 1 h，再用 1 mmol·L-1 CuSO4处理 24 h后测定的值。所
有值均为 3 次独立实验的平均值 ± 标准误。
图 2 不同浓度Ca2+对未经铜处理小麦根质膜囊泡中
NADPH氧化酶活性的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of Ca2+ on NADPH
oxidase activity of plasma membrane vesicle from roots of
wheat seedlings untreated with Cu
不同浓度 CaCl2或 CaCl2+10.0 mmol·L-1 EGTA在反应开始
5 min之前加入反应体系中。所有值均为 3 次独立实验的平均
值 ± 标准误。
图 3 不同浓度Ca2+抑制剂对小麦根质膜中
NADPH氧化酶活性的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of Ca2+ inhibitors
on plasma membrane NADPH oxidase activity
in roots of wheat seedlings
1和 2分别代表小麦根用营养液(对照)和 1 mmol·L-1 CuSO4
处理小麦根 2 4 h 后测定的值。3 ~ 1 1 分别为 2 . 5、5 .0、1 0 .0
mmol ·L -1 La Cl 3，0 .5、1 .0、1.5 mmol ·L -1异搏定以及 2.5、
5.0、10.0 mmol·L-1 EGTA预处理小麦根 1 h，再用 1 mmol·L-1
CuSO4处理 24 h后测定的值。3：Cu+LaCl3 2.5；4：Cu+LaCl3
5 .0；5：Cu + L a Cl 3 1 0 .0；6：Cu + 异搏定 0 . 5；7：Cu + 异
搏定 1 . 0；8：C u + 异搏定 1 . 5；9：C u + E G T A 2 . 5；1 0：
Cu+EGTA 5.0；11：Cu+EGTA 10.0。所有值均为 3 次独立
实验的平均值 ± 标准误。
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仅以铜处理的相比，差异均达到显著水平。而
且，这 3种 Ca2+抑制剂的抑制效应都是以剂量依
赖的方式起作用的，说明 Ca2+似乎参与铜诱导的
NADPH氧化酶活性增加过程。这与植物在生物胁
迫或ABA等影响下，NADPH氧化酶活性受 Ca2+
调节的抗逆(Sagi和 Fluhr 2001；Jiang和 Zhang
2003；Hao等 2006)似乎是一致的。
5 钙通道阻断剂和 Ca2+螯合剂对铜诱导的O2－· 、
H2O2和MDA含量的影响
图 4显示，经 3种抑制剂预处理的小麦根中，
铜所诱导的O2－· 、H2O2和MDA含量的升高均显著
受抑，说明铜可增强NADPH氧化酶活性从而提高
植物体内 ROS水平和加剧膜脂过氧化，Ca2+参与
这一过程的调节。
铜离子可能通过Ca2+直接增加NADPH氧化酶
活性，也可能是通过对钙依赖的蛋白激酶由磷酸
化介导而间接激活NADPH氧化酶(郝福顺和陈珈
2005)，其间机制尚不清楚，值得深入研究。
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