全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 1期，2005年 2月 95
培养基和培养条件与红豆杉细胞培养中褐化的关系
李冬杰1 张进献2 魏景芳1,* 李世杰3
1 河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018；2 河北省林业局，石家庄 050081；3 河北农业大学生命科学学
院，保定 071001
Relationship Between Culture Medium and Culture Condition and Avoiding
Browning in Cell Culture of Taxus
LI Dong-Jie1, ZHANG Jin-Xian2, WEI Jing-Fang1,*, LI Shi-Jie3
1College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018; 2Forestry
Bureau of Hebei, Shijiazhuang 050081; 3College of Life Science, Hebei Agricultural University, Baoding 071001
提要 就近几年来通过培养基和培养条件的选择来控制和防止红豆杉细胞培养中的褐化问题作了介绍。
关键词 培养基；培养条件；红豆杉；细胞培养；褐变防治
收稿 2004-02-10 修定 　 2004-11-08
×ÊÖú　 河北省科技厅招标重点项目(02245512D)。
* 通讯作者(E-mail:wjfang@126.com, Tel: 0311-
8632642)。
红豆杉属(Taxus)植物细胞培养生产抗癌新药
紫杉醇(taxol)已是公认的解决紫杉醇药源问题的最
佳途径之一[1]。但由于红豆杉属植物本身特殊的
生物学特性，在培养过程中组织和细胞常发生褐
化，其轻者影响组织、细胞生长和繁殖，重者
导致组织、细胞死亡，已成为制约这一技术推广
的最大障碍[2~4]。所以，有效地防止和解决培养
中的褐化问题是当今研究的热点。红豆杉属植物
发生褐变的原因较复杂，防治褐变的措施也较
多，其中通过选择适宜的培养基和培养条件控制
和防止褐变是最经济有效的方法之一，本文就此
作些介绍。
1 培养基的选择
适宜的培养基可有效地防止红豆杉的褐变。
培养基的选择包括培养基的基本类型、组成、pH
值及状态。
1.1 基本培养基类型 分3个方面：(1)目前用于红
豆杉愈伤组织诱导的培养基有：M S、B 5、S H 、
R W、6 , 7 - V、W P M、T A、S S S、W h i t e。其
中，以B5 和 6,7-V 培养基效果最好。常用的多为
B5和改良的B5培养基[5]。但赵芳等[6]在南方红豆杉
(T. chinensis var. mairei)、罗建平等[7]在云南红豆
杉(T. yunnanensis)、李景原等[8]在红豆杉(T.
chinensis)愈伤组织诱导中发现，使用MS优于B5。
另有报道，在TA培养基诱导的愈伤组织状态明显
优于 B5，表现为生长疏松、褐化程度轻[9]。SSS
和 RW是经改良的低氮培养基，对东北红豆杉(T.
cuspidata)和中国红豆杉幼茎的愈伤组织诱导率可
达95%以上[10]。WPM对东北矮紫杉(T. cuspidate)
的诱导效果好[11]。 (2)用于愈伤组织继代的培养基
多采用 B5、 SH、SSS、 RW 和 SHN[5]。这几种
培养基均可以保持愈伤组织的良好生长，其中以
B5最好，其他培养基培养一段时间愈伤组织褐化死
亡[7,12,13]。但也有研究表明 MS 作为继代培养基也
较好[6,8]。而东北矮紫杉则以WPM更适宜[11]。 (3)
一般用于愈伤组织诱导及继代的基本培养基也适合
细胞悬浮培养[12]。多数报道是用基本或改良的B5
培养基，李景原等[8]则认为 B5 和 MS 均可。而改
良的 MS 和 TA 能维持细胞正常生长[5]。
1.2 培养基的组成
1.2.1 无机盐 培养基中无机盐浓度过高，可致使
酚类物质的大量产生，导致细胞褐变；降低盐浓
度可以减少酚类外溢，从而减轻褐变[1]。一般认
为培养基中氮源的还原态和氧化态的相对含量对细
胞生长影响较大。Fett-Neto等[14]认为细胞的生长
主要以 NO -3 作为氮源，高浓度的 NH 4+ 会抑制生
长。所以，增加 NO -3 、减少 NH4+ 明显促进愈伤
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组织生长[9,15]。周吉源和杨礼香[16]认为，两者的
比例关系为 25∶2 时，更有利于细胞生长及褐化
的减轻。梅兴国等[1]认为从对褐变的影响角度来
看，PO 43 -> N H 4+> N O -3 。
1.2.2 激素(生长调节物质)类型、水平与组合 培养
基中激素(生长调节物质)的种类、浓度及其组合
对褐变起着重要的作用。赵芳等[6]认为激素种类
不同，褐化程度不同。甘烦远等[17 ]认为，提高
生长调节物质浓度(2,4-D提高到1.0~2.5 mg·L-1)，
能有效促进细胞生长、缓解褐化。
在生长素类生长调节物质中，有关2,4-D 和
NAA 对褐变的影响研究较多。有研究表明：含有
2,4-D(1.0 mg·L-1)或NAA(0.5 mg·L-1)的激素组合，
对愈伤组织的生长、质量是必需的[8,12]。但对
2,4-D 和 NAA 的作用大小上有不同的观点：一是
认为 2,4-D 优于NAA。如南方红豆杉愈伤组织培养
中，2,4-D 比 NAA 更有利于愈伤组织的形成，在
含2,4-D的培养基中生长的愈伤组织块大、新鲜。
而在NAA 培养基上的则块小而硬、呈褐色[18]。二
是认为NAA 优于 2,4-D，持这种观点的人多一些。
如同样是南方红豆杉愈伤组织诱导和继代，张宗
勤等[9]则认为，由于 2,4-D 本身有致癌活性，红
豆杉作为药源， NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1
是替代 2,4-D 的适宜组合。仇燕等[19]也证实：75
个生长调节物质处理的筛选实验中，以NAA 与 6-
BA 的组合优于 2,4-D 与 6-BA 的组合，其中 NAA
1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1的处理可获得最大增长
率。同样，在东北红豆杉中，NAA 组合比 2,4-
D 组合更有利于愈伤组织的诱导，而且适当提高
NAA浓度(2.5 mg·L-1)则有利于愈伤组织和细胞继
代培养，但2,4-D 影响不大[13,20]。还有，中国红
豆杉细胞培养时的生长调节物质优化研究中也有类
似的结果：NAA、6- BA 是影响细胞生长的关键
因素，2,4-D 对生长影响不显著，2,4-D、NAA、
6-BA 以 0.23∶1∶0.62 比例最优[21]。
在细胞分裂素类中，一般认为6-BA或激动素
有刺激多酚氧化酶(PPO)活性提高、加重褐变的
作用，这在甘蔗组培中表现最明显[22]。但在红豆
杉组培中并非如此，有实验证明：附加激动素KT
的组合并未表现褐变。如在南方红豆杉芽愈伤组
织诱导和增殖、驯化中添加0.5~1.0 mg·L-1 KT对
生长更佳[23]。还有，矮紫杉芽的诱导与一定浓度
范围内KT 呈正相关[11]。而 6-BA 的作用则表现出
两重性：一方面，6-BA 不适合矮紫杉芽的诱导，
明显引起外植体的褐化；另一方面，在南方红豆
杉培养中附加0.1~0.5 mg·L-1 的 6-BA，对愈伤组
织生长量的增加、保持质地，尤其是抑制褐化效
果明显[9]。
一般认为，添加 G A 3 对细胞生长有促进作
用。如在南方红豆杉愈伤组织继代中就有抑制
PPO 活性、减轻褐化的作用[4]。而赵芳等[6]的实
验则认为，南方红豆杉愈伤组织继代时，添加
GA 3 比使用 IAA 和 NAA 褐化严重。
ABA 在南方红豆杉愈伤组织继代和中国红豆
杉细胞培养中都有抑制 PPO 活性、减轻褐化的作
用[4,24]。
1.2.3 糖的种类和浓度 用于红豆杉属植物愈伤组
织诱导、继代及细胞培养的碳源一般选用蔗糖，
也可用果糖、麦芽糖和葡萄糖[12]。有研究证明：
果糖和葡萄糖能明显抑制 PPO 的活性，减轻愈伤
组织和培养基褐化程度，促进愈伤组织生长[4]。
而糖类的浓度一般认为以30 g·L-1较佳。但陈永勤
等[15]认为在诱导和培养云南红豆杉愈伤组织时，
用20 g·L-1蔗糖更有利于细胞生长。张秀清等[25]在
南方红豆杉细胞培养中，也认为20 g·L-1蔗糖对细
胞生长有利。
1.3 pH值 培养基pH值影响细胞质膜的渗透性，
进而影响细胞对内源物质的运输及多种酶活性和底
物的利用率，对细胞褐变有较大的影响。梅兴国
等[1]的研究结果表明，降低 pH 值可以减轻褐变。
盛长忠等[26]发现：南方红豆杉愈伤组织的生长，
随着 pH 的提高，愈伤组织生长越差，pH 5.5 对
于愈伤组织生长最有利。但较高的pH值对东北红
豆杉愈伤组织生长有利，pH 7.0时愈伤组织生长
状态最好，组织块呈白色，培养基红褐轻；p H
6.5 时愈伤组织颜色较暗，生长较差，并且培养
基中红褐严重[20]。另外，有人还发现在东北矮紫
杉细胞悬浮培养中，pH 变化能引起悬浮系颜色
变化[11]。
1.4 培养基的状态 一般认为液体培养容易使有毒
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物质扩散。但红豆杉愈伤组织诱导和继代时一般
采用固体培养，用液体培养对愈伤组织的诱导也
有人报道过[27]。在红豆杉细胞培养中，几种培养
方式褐变程度从小到大的顺序为：纸桥培养<液
体培养<半固体培养<固体培养。其原因是液体培
养中，细胞溢出的有毒物质可以很快扩散；而纸
桥培养除了这一作用外，滤纸条还有吸附有毒物
质的作用，所以褐变最轻[1]。另外，使用Gellal
Gum 代替琼脂作为凝固剂，也可以达到抑制愈伤
组织发生褐变和促进细胞生长的目的。
2 培养条件的确定
2.1 光照 光照会提高PPO的活性，促进多酚类物
质的氧化，因此黑暗中培养外植体可防止褐变的
发生[22]。几乎所有的研究都表明：红豆杉愈伤组
织诱导、继代和细胞培养一般都在黑暗条件下进
行效果比较好[12,18]。但也有研究表明：南方红豆
杉在MS培养基上的愈伤组织诱导率和生长量是光
培养优于暗培养[6]。东北红豆杉中也有类似的现
象：光照 12 h ·d -1 条件下，愈伤组织诱导率达
100 %，愈伤组织呈强烈的生长势头；而暗培养
的愈伤组织则变褐、变黑，褐化加重[13,20]。
2.2 温度 温度过高可提高PPO活性，加速褐化[22]。
所以，红豆杉的组织和细胞培养的温度不能过
高，一般为 20~2 5℃。
3 继代时间
易褐变的植物材料进行连续转接，一般可以
减轻褐变。但有研究表明，对红豆杉来说，连
续继代并不能解决褐变问题[6,9,18]。也有些实验证
明，选择合适的继代时间，不仅可以减轻褐化，
还可以促进愈伤组织继续生长。
3.1 愈伤组织继代时间 愈伤组织早期生长时间对
培养有显著影响，2 周内的愈伤组织在继代时细
胞并不增殖，而且发生褐化以至死亡。在诱导培
养基上培养 4 周 ~4 个月形成的愈伤组织中，以
1~3 个月开始形成的愈伤组织的继代培养存活率
最高[28]。罗建平等[7]发现，云南红豆杉愈伤组织
诱导 30 d 后褐化，40 d 继代，到第三代开始趋
于稳定。在南方红豆杉愈伤组织继代中，赵芳等[6]
认为，愈伤组织继代 5 次后，生长速度随继代次
数的增加，先呈上升趋势，后逐渐下降；盛长
忠等[18]报道，诱导愈伤组织生长35 d后继代，几
天内即迅速褐化，生长极其缓慢，1 年后愈伤组
织长出白色细胞团，生长速度变快，有的竟达 2
年之久。我们的实验也表明：继代半年后，褐
变的愈伤组织上长出白色的细胞团并未转好。在
东北红豆杉愈伤组织诱导初期，频繁继代反而生
长延迟、组织褐化；以 30 d 为继代周期，愈伤
组织生长旺盛；继代周期过长(如 50 d)，愈伤
组织会萎缩褐化加重[13]。
3.2 细胞继代时间 仇燕等[29]的研究结果表明：细
胞在生长对数期间继代比静止期继代的细胞增长率
提高1.6倍。但不同种类的红豆杉进入对数生长期
的时间不同。东北红豆杉细胞悬浮培养时的继代
时间一般为30 d 左右，细胞可维持对数生长期，
延迟进入稳定期、死亡期[13]。云南红豆杉第15 天
进入对数生长期，30 d进入稳定生长期，40 d变
黑死亡[7]。东北矮紫杉的对数生长期为10~30 d，
收获期为20~30 d[11]。中国红豆杉对数生长期为
8~20 d，稳定期为20~30 d [30]。
4 接种密度
我们在实验中发现愈伤组织继代时的体积大
小对褐化也有一定的影响，一般以0.7~0.8 cm3较
适宜，过大或过小都易发生褐变。另外，培养
细胞的密度效应也较明显，接种量以0.6~0.9 g·瓶-1
(50 mL)为最佳密度，大于1.0 g·瓶-1(50 mL)时培
养物易褐化，密度增加时褐化更严重[11,13]。
5 问题与展望
在植物组培中褐变是常遇到的问题，目前已
在很多植物组培中发现有褐变现象，尤以木本植
物组培中的褐变最为严重。褐变产物不仅使外植
体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑
制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重
时甚至导致死亡[22]。红豆杉属木本裸子植物，由
于其特殊的生物学特性，发生褐变的几率较高，
而且即使培养出优良的愈伤组织进行继代或细胞悬
浮培养时，不久即继发褐变，细胞随即停止生
长，甚至死亡，所以解决褐化问题已是用细胞培
养法生产紫杉醇的瓶颈问题。本文主要从培养
基、培养条件、继代时间及接种密度 4 个方面，
分析了其在控制和防止褐变中的作用。还有其他
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的防止褐变措施，如选择合适的外植体、添加抗
氧化剂和吸附剂等也值得重视。但无论采用那种
措施，值得注意的是紫杉醇是一种药源，所以在
生产过程中一定要避免使用有毒副作用的药剂。
另外，还要考虑经济实用，这样才能真正达到用
细胞培养法生产紫杉醇的目的。
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