全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月 275
麻疯树毒蛋白curcin2基因的两个原核表达载体的构建和表达
邓骛远 罗通 徐莺 张颖 陈放 罗言云*
四川大学生命科学学院，成都 610064
Construction and Expression of Two Prokaryotic Expression Vectors of Curcin2
Gene in Jatropha curcas Linn.
DENG Wu-Yuan, LUO Tong, XU Ying, ZHANG Ying, CHEN Fang, LUO Yan-Yun*
College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China
提要 从麻疯树基因组中扩增到毒蛋白 curcin2 基因成熟肽编码区，成功构建了原核表达载体 pET-C 和 pQE-C，并转化大
肠杆菌获得转化子 PCB 和 PCM。在不同温度、不同浓度 IPTG 和不同诱导时间下，PCB 都没有 curcin2 重组蛋白产生，而
PCM 能表达出 curcin2，主要以包涵体形式存在。诱导温度较低时，延长诱导时间有可溶性的 curcin2 产生。在文章的实
验中，PCM 表达 curcin2 的优化条件为：温度 16℃，IPTG 1 mmol·L-1，时间 16~24 h。
关键词 麻疯树；毒蛋白；原核表达；核唐体失活蛋白
收稿 2005-09-26 修定 2006-01-17
资助 国家 “ 十五 ” 重大科技攻关项目(2002BA901A15)。
*通讯作者(E-mail: luoyanyun3966@tom.com, Tel: 028-
85471066)。
核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating
protein，RIP)是一类作用于rRNA而抑制核糖体功
能的毒蛋白，广泛存在于高等植物中，现已从
350 余种植物中筛选到 110 多种 RIP (李建国
2005)。RIP通过对核糖体28S RNA的3端茎环结
构中一个高度保守的核苷酸区域的作用，破坏核
糖体大亚基 RNA 的结构而导致核糖体失活，结果
蛋白质合成受抑制。有研究表明，RIP 对细菌和
真菌有广谱抗性，因而 RIP 的转基因植物抗病毒
和抗真菌能力明显增强(王小娟 2004；郎海滨等
2004)。另一方面，核糖体失活蛋白能抑制肿瘤
病毒和艾滋病毒的生长。将单链毒素(一类RIP)与
特定癌细胞衍生的单克隆抗体连接，所制备的导
向药物(免疫毒素)能高效率地杀伤癌细胞，这是
抗癌药物研究中的一个重要方向(王玉露2003)。
麻疯树(Jatropha curcas Linn.)是大戟科的一种
油料植物，其抗病、耐旱和耐高温能力强，在
热带和亚热带地区大量分布，是一种具有较大开
发潜能的植物(林娟等 2004；Openshaw 2000)。
从麻疯树的种子中分离纯化到一种毒蛋白(命名为
curcin)，经鉴定是一种 RIP，具有抗真菌活性，
其基因已得到克隆，并在大肠杆菌(Escherichia
coli)中成功表达(Lin等2003)。魏琴等(2004)根据
curcin的基因设计引物，从逆境胁迫(高温低温、
干旱、真菌侵染等)的麻疯树幼苗中也克隆到一段
约 1 000 bp 的 cDNA 片段(GenBank 登录号：
AY435214)。生物信息学分析表明，该片段具有
完整的开放读码框(open reading frame，ORF)，
编码一个具 309 个氨基酸残基的前体蛋白，其成
熟肽为267个氨基酸残基，分子量约30.1 kDa，和
curcin有 92% 的氨基酸序列同源性；将此基因的
成熟肽编码区导入大肠杆菌并诱导表达，用麻疯
树curcin的抗血清与诱导蛋白进行Western杂交的
结果表明，在预期位置(约32 kDa的重组蛋白)出
现杂交阳性带。因此认为，该基因编码蛋白和
curcin都属于RIP，在麻疯树中由同一基因家族编
码，命名为麻疯树毒蛋白curcin2 (魏琴等2004；
Wei等2005)。魏琴等(2004)发现，curcin只在麻
疯树种子中特异表达，而curcin2则是在胁迫条件
下于麻疯树幼苗中诱导产生的，据此推测它和植
物的逆境适应性有关，并参与植物的防御反应，
这为麻疯树的抗病、耐旱、耐高温提供了一种可
能的解释。
为了进一步研究curcin2的结构和功能，探讨
麻疯树的抗病、耐旱、耐高温机制，并为开发
麻疯树毒蛋白用着抗菌抗癌药物奠定基础，本文
构建了curcin2基因的2种原核表达载体pET-32(c)/
curcin2 (简称pET-C)和pQE-30/curcin2 (简称pQE-
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C )，并用不同的诱导温度、诱导时间和浓度的
IPTG同时作用2种重组菌pET-32(c)/curcin2/BL21
(简称PCB)和pQE-30/curcin2/M15 (简称PCM)，比
较 curcin2 基因的这两种原核表达系统之间的差
异，并在此基础上，进一步研究了 curcin2 原核
表达产物在转化细胞中的存在形式。
材料与方法
1 材料和药品
麻疯树(Jatropha curcas Linn.)幼叶从四川攀枝
花市沿江镇采集后，立即冻于液氮中，并转入-70℃
冰箱中保存。大肠杆菌菌株 BL21、M15 及载体
pET-32(c)、pQE-30 由本实验室保存。载体pMD-
18T、限制性内切酶 BamHI、SacI 和 T4 DNA 连
接酶购于宝生物工程(大连)有限公司，E.Z.N.A.
Plasmid Miniprep Kit I购自Omega Bio-Tek (美国)。
山羊抗兔IgG-AP购自华美公司，其余试剂均为分
析纯，P C R 引物由北京赛百盛生物工程公司合
成。
2 方法
2.1 curcin2基因片段的获得 按CTAB法从麻疯树
幼叶中提取总 D N A。根据 c u r c i n 2 基因序列
(GenBank 登录号：AY435214)设计扩增成熟肽编
码区的特异性引物：P1：5 GGATCC (BamHI)
ATGGCTGGTTCCACTTT 3；2：5 GAGCTC (SacI)
ATACATTGGAAAGATGAGGA 3。PCR 扩增反应
条件：94℃预变性 6 min；然后 30 个循环(94℃
40 s，53℃ 1 min，72℃ 1.5 min); 并于72℃下继续
延伸 5 min。将 PCR 产物胶回收得的目的片段连
接到 pMD-18T 上，获重组子 pMD-18T/curcin2，
转化大肠杆菌JM109测序(由上海生物工程公司完
成，以下同) 。
2.2 原核表达载体pET-C和 pQE-C的构建和鉴
定 用BamHI和SacI双酶切以上所得的重组子pMD-
18T/curcin2以获得curcin2目的片段；同时对表
达载体 pET-32(c)和 pQE-30 分别进行 BamHI 和
SacI 双酶切，获得其线性表达载体，用 T4 DNA
连接酶将所得的具粘性末端的curcin2片段分别与
pET-32(c)和 pQE-30 线性表达载体连接，构建重
组表达载体 pET-C 和 pQE-C。连接产物分别转化
大肠杆菌 B L 2 1、M 1 5，以获得重组菌 P C B 和
P C M。挑取阳性单菌落 P C B、P C M 分别接种于
含 Am p 的 L B 和含 Am p、K a n 的 L B 培养基中，
37℃下振荡培养并提取质粒。对所得两种质粒分
别进行 BamHI、SacI 双酶切和测序鉴定。同时，
将空载体pET-32(c)、pQE-30 也按同法分别转入
BL21、M15，获转化子 pET-32(c)/BL21 (简称
PB)、pQE-30/M15 (简称 PM)，用作本底空白对
照 。
2.3 重组质粒pET-C和pQE-C的诱导表达
2.3.1 不同温度下的诱导表达 挑取重组菌PCB和
PB 分别接种到 10 mL LB/Amp 培养液中，PCM 和
PM 分别接种到LB/Amp/Kan 培养液中，于37℃下
振荡培养过夜。各取500 mL过夜培养物又分别接
种于10 mL LB/Amp和 10 mL LB/Amp/Kan培养液
中，于 37℃下振荡培养，直至菌液的 OD600 值达
到 0.6~0.7 时。将各份平分为 4 份后按表 1 添加
IPTG，将各处理于设计的诱导温度下继续振荡培
养5 h (表 1)，取出菌液保存于 -20℃中。
表1 不同温度的诱导处理方式
编号 重组菌 IPTG/mmol·L-1 诱导温度/℃
W 1 * P B 1 20
W 2 * * P C B 0 20
W 3 P C B 1 30
W 4 P C B 1 20
W 5 P C B 1 16
W 6 * P M 1 20
W 7 * * P C M 0 20
W 8 P C M 1 30
W 9 P C M 1 20
W 1 0 P C M 1 16
* 本底空白对照，** 重组子不加 I P T G 诱导。下表同此。
2.3.2 不同时间下的诱导表达 按上述方法将2种
重组菌液培养至OD600 值达到 0.6~0.7。将每分菌
液平均分成4份，然后添加IPTG，于16℃下继续
振荡培养到设计的各个处理诱导时间(表2)，分次
依时取出菌液，保存于 - 2 0℃中。
2.3.3 不同IPTG浓度的诱导表达 按上述方法将重
组菌 PCB、PCM 的菌液于 37℃下培养至 OD600 值
为 0.6~0.7，分别将菌液分成 6 份，按表 3 加入
IPTG 后，于 16℃下继续振荡培养 24 h，将菌液
保存于 -20℃中。
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2.4 curcin2表达形式和溶解性的分析
2.4.1 SDS-PAGE检测 将上述不同处理诱导所得
菌液离心收集菌体，将沉淀分别重悬于裂解缓冲
液(50 mmol·L-1 NaH2PO4、300 mmol·L-1 NaCl、10
mmol·L-1咪唑，pH 8.0)中，以液氮反复冻融4次，
再超声波处理(冰上，功率225 W) 6次，每次10 s，
间隔20 s。裂解液于4℃下以13 000×g 离心10 min
后，取 10 mL 上清液加入等体积2×SDS 上样缓冲
液混匀，于 100℃水浴中保温 5 min 后备用；而
沉淀则加入1×SDS上样缓冲液混匀后置于100℃水
浴中5 min，再以13 000×g离心 10 min沉淀细胞
碎片，取上清液备用。将以上制得的细胞上清液
和沉淀上清液作 12% SDS-PAGE。
2.4.2 Western-blotting检测 按W5、S4号的条
件对重组子 PCB 进行诱导表达，按 W10、S9 号
的条件对重组子 PCM 进行诱导表达，所得菌液按
上述方法获得上清液和沉淀，分别作 SDS-PAGE
分离蛋白后，将凝胶上的蛋白电转移到硝酸纤维
素膜上(100 V 稳压转移 2 h)。以麻疯树毒蛋白
curcin抗血清作一抗，山羊抗兔IgG-AP为二抗进
行 Western 检测。
实验结果
1 目的片段的PCR扩增
以 P1、P2 为引物，麻疯树基因组 DNA 为模
板，PCR 扩增获得一约 950 bp 的 DNA 片段。测
序后和GenBank上的curcin2基因序列(GenBank登
录号：AY435214)比对，结果表明所得片段包括
一个完整的curcin2成熟肽编码区序列(加终止密码
子后133 bp、BamHI 和 SacI酶切位点等，共947
b p，图 1 )。
2 原核表达载体pET-C和 pQE-C的构建和鉴定
将经BamHI和SacI双酶切后所得的curcin2片
段分别与同样双酶切所得的pET-32(c)和 pQE-30
线形载体连接，获得的重组子分别转化大肠杆菌
B L 2 1 和 M 1 5 ，从转化子中提取的质粒分别经
BamHI、SacI 双酶切鉴定，都得到 curcin2 目的
片段(947 bp，图2)。测序结果进一步证实，curcin2
基因正确插入表达载体pET-32(c)和 pQE-30，获
得重组子 pET-C 和 pQE-C。
3 curcin2在两个原核表达系统中的诱导表达
3.1 curcin2的两个原核表达系统比较 所得的两个
重组菌 PCB 和 PCM 经 SDS-PAGE，凝胶成像如图
3~5。由图 3~5 可以看出，在不同温度、不同时
表2 不同时间的诱导处理方式
编号 重组菌 IPTG/mmol·L-1 诱导时间/h
S1* P B 1 16
S2** P C B 0 16
S3 P C B 1 16
S4 P C B 1 24
S5 P C B 1 48
S6* P M 1 16
S7** P C M 0 16
S8 P C M 1 16
S9 P C M 1 24
S10 P C M 1 48
表3 不同浓度IPTG的诱导处理方式
编号 重组菌 IPTG/mmol·L-1
I1* P B 0.1
I2** P C B 0
I3 P C B 0.01
I4 P C B 0.05
I5 P C B 0.1
I6 P C B 0.5
I7 P C B 1.0
I8* P M 0.1
I9** P C M 0
I10 P C M 0.01
I11 P C M 0.05
I12 P C M 0.1
I13 P C M 0.5
I14 P C M 1.0
图1 curcin2成熟肽编码区的PCR 扩增
1：P C R 产物；2：D L 2 0 0 0 D N A 分子量对照。
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间和不同浓度 IPTG 下诱导的重组菌 PCB 都没有
curc i n 2 目的带的产生，电泳图谱的条带和无
IPTG诱导的 PCB以及 PB空白对照的相同(图 3-a，
不同时间和不同浓度IPTG诱导的PCB电泳图谱未
列出) 。而在不同温度、不同时间和不同浓度
IPTG 下诱导的重组菌 PCM 都比无 IPTG 诱导的
PCM和 PM 空白对照多一条大约32 kDa 的条带(图
3-b、4、5)，根据 pQE-30 多克隆位点的结构推
断PCM 所表达的应是一个约 32 kDa 的重组蛋白，
这和预期的结果相吻合。
3.2 PCM诱导表达条件的优化
3.2.1 表达温度的优化 由图3-b可以看出，在30、
3.2.3 IPTG浓度的优化 由图5可以看出，在16℃
诱导 1 d 的条件下，只要有 IPTG 存在，重组菌
图2 重组子BamHI和SacI双酶切的电泳图谱
图 a- 1：B a m H I、S a c I 双酶切 pE T - C 产物；图 a - 2：
DL2000 DNA 分子量对照。图 b-1：DL2000 DNA 分子量对
照；图 b-2：B am H I、S a c I 双酶切 p Q E - C 产物。
20和16℃下诱导5 h (IPTG 1 mmol·L-1)，重组子
PCM 都表达出 curcin2，全部存在于沉淀中，而
上清液中几乎没有检测到 curcin2，只是温度为
16℃时，上清液有很微弱的目的带。说明表达的
curcin2以包涵体形式而几乎无可溶性蛋白形式存
在。从 3 个诱导温度来看，20、16℃下的目的
带比30℃下的带强，说明相对较低的温度有利于
目的蛋白的诱导表达。
3.2.2 表达时间的优化 由图4可见，在16℃ (IPTG
1 mmol·L-1)下，诱导 8、16、24 和 48 h，重组
子PCM 都产生 curcin2 重组蛋白，以16 和 24 h
的表达量较大。仔细观察发现，上清液也出现较
微弱的目的带，而且也以诱导 16 和 24 h 的相对
较强，说明随着诱导时间的增长和诱导温度的降
低，重组子产生的目的蛋白除主要以包涵体形式
存在外，还有少量的可溶性蛋白形式。
图4 PCM 在不同时间下诱导表达的 SDS-PAGE 图谱
1：标准蛋白分子量；2：诱导8 h 的细胞沉淀；3：诱导8 h
的细胞上清液；4：诱导 16 h 的细胞沉淀；5：诱导 16 h 的
细胞上清液；6：诱导24 h 的细胞沉淀；7：诱导24 h 的细胞
上清液；8：诱导 48 h 的细胞沉淀；9：诱导 48 h 的细胞上
清液；1 0 ：P M 本底空白对照；1 1 ：无 I P T G 的 P C M 。
图3 重组菌在不同温度下诱导表达的SDS-PAGE图谱
a ：P C B 的诱导表达；b ：P C M 的诱导表达。1 ：标准蛋白的分子量；2 ：3 0 ℃下诱导的细胞沉淀；3 ：3 0 ℃下诱导的
细胞上清液；4：2 0℃下诱导的细胞沉淀；5：2 0℃下诱导的细胞上清液；6：1 6℃下诱导的细胞沉淀；7：1 6℃下诱导的细
胞上清液；8：空载体菌本底空白对照；9：无 IPTG 诱导的重组菌。箭头指示 32 kDa 的 curcin2 重组蛋白位置(下图同此)。
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PCM 都能产生 curcin2 蛋白，而且都有部分可溶
性蛋白。但随着 IPTG 浓度的增加，表达量加大。
在本实验设计的 IPTG 浓度范围内，当 IPTG 达到
最大浓度(1 mmol·L-1)时，诱导表达的curcin2重组
蛋白量最大。
3.3 Western-blotting检测 重组菌PCB (W5和
S4)的诱导表达产物经Western-blotting 检测后，
都没有特异性条带出现，进一步证明重组子pET-
C 没有表达(图未列出)。而重组菌 PCM (W10 和
S9)的表达产物都能与curcin抗血清反应，在约32
kDa处出现特异性条带(图6)。但当诱导时间为5 h
时(16℃、1 mmol·L-1 IPTG)，可溶性蛋白中没有
curcin2的特异性条带(图6-a); 诱导时间延长到24 h
时(16℃、1 mmol·L-1 IPTG)，能看到curcin2 可
溶性蛋白的特异性条带(图 6-b)，这和 SDS-PAGE
的结果一致。
讨 论
以麻疯树基因组为模板，通过设计的基因特
异性引物的PCR扩增获得curcin2基因的成熟肽编
码区，成功构建了原核表达载体 pET-C 和 pQE-
C，并转化大肠杆菌获得转化子 PCB 和 PCM。在
实验设计的温度、时间和 IPTG 浓度下，重组菌
PCB都未表达出curcin2的融合蛋白，说明 pET-
32(c)载体不适合curcin2的表达。而重组菌PCM
在实验的所有条件下都能表达出约32 kDa的重组
蛋白，表达量和诱导温度、时间和 IPTG 浓度密
切相关。本文实验表明，在温度为 16℃，IPTG
浓度为1 mmol·L-1 (设计浓度范围内)，诱导16~24
h 的条件下，重组菌产生的curcin2重组蛋白量最
图5 PCM 在不同浓度IPTG下诱导表达的SDS-PAGE图谱
a：IPTG (0.01~0.05 mmol·L-1)。1：蛋白标准分子量；2：0.01 mmol·L-1 IPTG 诱导下的细胞沉淀；3：0.01 mmol·L-1
IPTG 诱导下的细胞上清液；4：0.05 mmol·L-1 IPTG 诱导下的细胞沉淀；5：0.05 mmol·L-1 IPTG 诱导下的细胞上清液；6：
PM 本底空白对照；7：无 IPTG 诱导的 PCM。b：IPTG (0.1~1 mmol ·L -1)。1：蛋白标准分子量；2：0.1 mmol ·L -1 IPTG 诱
导下的细胞沉淀；3：0.1 mmol·L-1 IPTG 诱导下的细胞上清液；4：0.5 mmol·L-1 IPTG 诱导下的细胞沉淀；5：0.5 mmol·L-1 IPTG
诱导下的细胞上清液；6：1 mmol ·L-1 IPTG 诱导下的细胞沉淀；7：1 mmol ·L-1 IPTG 诱导下的细胞上清液；8：PM 本底空白
对 照 。
图6 PCM表达蛋白的Western-blotting分析
a：诱导条件为16℃，1 mmol·L-1 IPTG，5 h。1：标准蛋白分子量；2：沉淀；3：上清液。b：诱导条件为16℃，1 mmol·L-1 IPTG，
2 4 h 。1 ：标准蛋白分子量；2 ：上清液；3 ：沉淀。
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大 。
在大肠杆菌中表达的外源蛋白有非融合型和
融合型蛋白两种形式，pQE-30 表达载体属 T5 启
动子转录 - 转译系统，是一种非融合型蛋白的表
达载体，其特点是在编码的外源蛋白的 N 端有 6
个组氨酸残基，采用Ni-NTA树脂可很方便地将外
源蛋白从细菌蛋白中分离出来。这个系统可以高
水平地表达一些在其他表达系统不能有效表达的基
因，特别是毒蛋白基因(Lin 等 2003)。pET 载体
系列的启动子是 T7 DNA 聚合酶启动子，它主要
表达可溶性的融合蛋白，除了编码外源蛋白 N 端
的 6 个组氨酸外，还能编码 Trx 蛋白和外源蛋白
一起表达。curcin2在pET-32(c)不能表达的原因
可能有多种，或是由于形成的可溶性的curcin2融
合蛋白易为大肠杆菌BL21胞质中的蛋白酶降解而
不稳定；或是由于表达的融合蛋白分子较大而不
利于在此系统中表达等(陈全等2003)。
重组子pQE-C 产生的重组蛋白主要以包涵体
形式存在的，在诱导时间为 5 h的不同温度下几
乎都没有curcin2可溶性蛋白产生。用DNA tools5.1
软件分析时发现，curcin2中的疏水性氨基酸(占
43.2%)高于亲水性氨基酸(占 33.5%)，电中性氨
基酸(76.7%)大大高于带电荷氨基酸(23.3%)，形
成转角的氨基酸含量较高(Pr o、As n、Gl y 达
14.2%)，这些都有利于其表达蛋白形成包涵体(刘
进元等 2002)。但随着诱导时间的延长，重组菌
即产生为SDS-PAGE和Western-blot检测到的痕量
可溶性重组蛋白。诱导条件达到优化条件时(温度
为16℃，IPTG浓度为1 mmol·L-1，诱导16~24 h)，
不仅curcin2在重组菌中表达量最大，同时产生的
可溶的 curcin2 最多。据报道，外源蛋白在高温
下生长的细菌中容易形成包涵体，而在低温下则
容易以溶解形式合成(刘进元等2002)。同时，相
对较长的诱导时间也有利于表达的目标蛋白形成可
溶性形式。包涵体复性是非常麻烦的工作，pQE-
30 原核表达系统能在适宜的诱导条件下表达出可
溶性的curcin2，这为进一步研究curcin2的活性
功能及其药物开发奠定了基础。
参考文献
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