全 文 ：收稿日期:1998-05-10;吴红京 , 女 , 48岁 , 工程师
图 1 凤凰木种子毒蛋白粗提液在
阳离子交换柱上的分离
Fig.1 The separation of crude extract
from seeds of Delonix regia on cation
exchange column
第 18卷第 2期 分析测试学报 Vol.18 No.2
1999年 3月 FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis) Mar.1999
凤凰木种子毒蛋白的高效
凝胶过滤色谱分析
吴红京 王文忠 唐根源
(中国科学院福建物质结构研究所 福州 350002)
摘 要 介绍用 HPGFC(高效凝胶过滤色谱)对凤凰木种子中提取的 3种毒蛋白分别进行色谱分析。 并对分离
的蛋白峰进行紫外光谱扫描来确认蛋白的纯度。 根椐标准相对分子质量曲线 , 分别得到它们的相对分子质量并
与 SDS-PAGF(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)所得结果进行比较 , 用柱后衍生法测定了 3个蛋白各自
的氨基酸组成。
关键词 凝胶过滤色谱 , 光电二极管阵列检测器 , 毒蛋白 , 凤凰木 , 种子
凤凰木种子(Delonix regia)属豆科类 , 是一种生长在热带和亚热带地区的一种中型树木 。 它的种子有毒 ,
食后会引起腹痛 、腹泻和头疼 。 继对植物毒蛋白的一些研究[ 1 , 2 ]后 , 从凤凰木种子中分离出 3种经生化实验
证实的毒蛋白组分 R1 , R2 , R3。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
LC-4A高效液相色谱仪 , SPD-M1A光电二极管阵列检测器 , RF-530荧光检测器和 C-R2AX数据处理
机(以上均为日本岛津产品);YSB-2型平流泵(上海科仪厂);牛蛋白 、卵蛋白 、天花粉蛋白 、溶菌酶 4种标
准蛋白(上海生化所);凤凰木种子(厦门亚热带植物研究所);其它所用试剂均为分析纯 。
1.2 种子预处理
用砂布将坚硬的种子擦净 , 去掉外面的壳 , 然后将种子浸泡在水中一昼夜 , 使之膨胀 , 剥去种子皮 , 干燥
后于 4 ℃贮存 , 备用 。
1.3 毒蛋白粗提液的制备
50 g 去皮的种子经粉碎机碾磨成粉后 , 浸泡在 500mL 20 mmol/L含有 9 g/L NaCl的磷酸盐缓冲液 (PBS ,
pH 7.2)中 , 匀浆 , 静置过夜 , 装入布袋 , 用挤压法压出水溶液 。粗提液用蒸馏水透析 8 h×3 , 离心得上清液 ,
用 900 g/L硫酸铵饱和 , 平衡 12 h , 沉淀的蛋白在高速离心机上以 12 000 r/min离心 10 min后 , 用少量水溶解
并透析 , 一些不溶物以 40 000 r/min离心除去(整个过程均在 4 ℃进行)。
1.4 毒蛋白粗提液的分离
DEAE-Sephadex A-25柱(2.6 cm×30 cm)用 10mmol/L Tris(三羧
甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液(pH 7.2)平衡后 , 将粗提液过柱 , 用 300
mL 同样的缓冲液和 300 mL内含 0.8 mol/L NaCl的缓冲液进行等梯度
洗脱 , 流速 1 mL/min。 流出液经多次收集后 , 过 DEAE-52柱(1.6
cm×25 cm), 再次用缓冲液和内含 0.24 mol/L NaCl的缓冲液等梯度洗
脱 , 在 λ=280 nm处 , 得 3个峰(图 1)。 收集 3个峰的流出液 , 经浓
缩 , 透析 , 冷冻 , 干燥得到 3个蛋白的冻干粉 R1 , R2 , R3。
1.5 凤凰木种子中毒蛋白的纯度鉴定
3个蛋白在 SDS-PAGE电泳带和 IEF聚焦电泳带上均表明是纯
品 。 用高效凝胶过滤色谱法分析分别得 3个单一纯峰(图 2)。 用光
表 1 蛋白相对分子质量
Table 1 The relative molecular mass of the proteins
＊Nd:not detected
图 2 凤凰木种子毒蛋白在高效蛋白柱上的分离
Fig.2 The separation of toxic proteins from seeds of
Delonix regia on HPGFC
column:Protein-Pak 60 + Protein-Pak 125 (7.8
mm ID×30 cm , 10μm, Waters);eluent:0.2 mmol/
L phosphate buffer , pH 6.5;flow rate:0.8 mL/min;
λ=280 nm;a.R1;b.R2;c.R3.
图 3 3种毒蛋白的紫外光谱图
Fig.3 UV spectra of the three toxic proteins
a.R1;b.R2;c.R3
表 2 R1 , R2 , R3氨基酸组成
Table 2 Amino acid composition of R1 , R2 and R3
Method
Mr(protein)
R1 R2 R3
HPGFC 28 860 26 100 23 500
SDS-PAEA 28 700 25 700 22 980
30 分析测试学报 第 18卷
Amino acid
Content(mole ratio)
r(R1) r(R2) r(R3)
Ala(丙氨酸) 12.73 11.40 3.94
Cys(半胱氨酸) 0.00 0.00 0.00
Asp(天门冬氨酸) 18.07 15.49 16.36
Glu(谷氨酸) 39.00 29.85 24.07
Phe(苯丙氨酸) 9.50 10.35 9.47
Gly(甘氨酸) 38.40 34.78 44.80
His(组氨酸) 7.05 10.28 9.19
Ile(异亮氨酸) 15.95 15.32 15.55
Lys(赖氨酸) 8.57 14.12 11.12
Lue(亮氨酸) 15.75 14.30 14.80
Met(蛋氨酸) 4.80 3.21 3.64
Pro(脯氨酸) 0.00 0.92 11.22
Arg(精氨酸) 26.10 15.87 15.62
Ser(丝氨酸) 36.22 32.29 10.99
Thr(苏氨酸) 6.05 5.93 6.95
Val(缬氨酸) 19.84 17.27 17.75
Trp(色氨酸) Nd＊ Nd Nd
Tyr(酪氨酸) 7.28 8.67 14.80
Mr 28 813 25 800 24 090
2 结果与讨论
2.1 凤凰木种子毒蛋白相对分子质量测定
在对 3个蛋白进行色谱分析的同时 , 绘制 4
种标准蛋白:牛蛋白 (67 000)、卵蛋白 (43 000)、
天花粉蛋白 (27 000)、溶菌酶 (14 000)的标准曲
线 。 根据 3个蛋白的相对迁移时间 , 从标准曲线
上得到 3个蛋白 R1 , R2 , R3的相对分子质量(Mr)
与从 SDS-PAGF得到的结果基本吻合(表 1)。
从表 1中可见 3个蛋白的相对分子质量十分
接近 。从等电点测试中得知 3个蛋白的等电点均
在 5.2附近 , 它们之间的差异在 0.05 pH单位之
内 , 因此要区分开是困难的 , 这与它们在离子交
换柱上的行为是一致的 。
2.2 氨基酸组成测定
蛋白经酸解后 , 用 LC-4A 高效液相色谱仪 、
荧光检测器 、钠型氨基酸分离柱 、邻苯二甲醛柱后
衍生荧光法测定 3个蛋白的氨基酸组成(表 2)。
从表 2中看出它们的组成极为相似 , 表明它们可
能是同系物并紧靠在一起 。 表 2中氨基酸组成只
是一部分 , 因蛋白经酸解后 , 色氨酸被破坏不能
测定 , 另外在酸解过程中 , 谷氨酰胺(Gln)和天门冬酰胺(Asn)分别转化成谷氨酸(Glu)和天门冬氨酸(Asp)进
行合并计算 , 结果以质量分数转换成摩尔比表示 。 R1 , R2 , R3的相对分子质量与 HPGFC测定基本一致 , 根
电二极管阵列检测器对图 2中 3个峰的特定时间分别进行紫外光谱扫描 , 并画出光谱图(图 3), 3个蛋白的光
谱在 λ=280 nm处有最大吸收 , 显示出明显的蛋白特征光谱 。
第 2期 吴红京等:凤凰木种子毒蛋白的高效凝胶过滤色谱分析 31
据氨基酸组成 , 可以预测这些蛋白的第二结构 。
2.3 讨 论
(1)用 HPGFC分析 , 采用面积归一法分别测定 3个蛋白的纯度(w)为:R1 100%, R2 97.5%, R3 91%,
这样的纯度对大多数其他试验是足够了 。
(2)了得到纯的蛋白 , 粗提液必须重复过柱 , 多次洗脱收集 , 充分透析去掉杂蛋白 。
(3)由于 3个蛋白的相对分子质量非常接近 , 因此用两根串联的蛋白柱对它们进行分析 , 可提高分辨率 。
参 考 文 献
1 唐根源, 陈明晃 , 吴红京.高效凝胶过滤色谱法(光电二极管阵列检测器)分离、测定巴豆毒蛋白.色谱 , 1994 , 12(4):
244
2 吴红京 , 郝 冰 , 唐根源等.高效凝胶过滤色谱法测定豆薯种子蛋白.色谱 , 1997, 15(2):153
Analysis of Protein in Delonix Regia Seeds
by High Performance Gel Filtration Chromatography
Wu Hongjing , Wang Wenzhong , Tang Genyuan
(Fujian Institute of Research on the Structure of Matter , Chinese Academy of Sciences , Fuzhou 350002)
Abstract three novel toxic proteins R1 , R2 , and R3 have been isolated from the seeds of Delonix regia
by extraction with 20 mmol·L-1 phosphate buffered saline(PBS , 9 g ·L-1 NaCl)at pH 7.2 , and were
then purified on a DEAE-52 cellulose column by elution with a gradient consisting of salt _ free 10
mmol·L-1 Tris-HCl buffer , at pH 7.2 versus 0.24 mol·L-1 NaCl Tris-HCl buffer.These proteins
were further separated on Protein -Pak 60 and Protein -Par 125(7.8 mm ID×30 cm , 10 μm )
columns.The mobile phase was 0.2 mol·L-1 phosphate buffer(pH6.5).The flow rate was kept con-
stant at 0.8 mL·min-1 by a YSB-2 type high pressure pump.The effluent was monitored at a wave-
length of 280 nmon a photodiode array moni tor.These three proteins have been proved to be homogeneous
by SDS-PAGE , IEF and HPGFC.The molecular masses of the three proteins were found to be around
28 700 u , 25 700 u and 22 980 u by SDS-PAGE and 28 860 u , 26 100 u , 23 500 u by HPGFC ,
respectively.The isoelectric points of R1 , R2 and R3 are about 5.2.The differences between their iso-
electric points are less than 0.05 pH unit , therefore it is difficult to distinguish them.This is in accor-
dance with thei r chromatographic behaviors on ion_exchange columns.The amino acid compositions of
these proteins were determined by OPA post_column derivatizaion fluorescence method.
Keywords Gel filtration chromatoyraphy , Photodiode array monitor , Toxic protein , Delonix regia ,
Seeds