全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 651
转反义 Trx s基因小麦灌浆期间籽粒和成熟后种子萌发期间的过氧化物酶
和过氧化氢酶活性变化
郭红祥, 尹钧 *
河南农业大学生命科学学院, 国家小麦工程技术研究中心, 郑州 450002
提要: 检测转反义 Trx s基因小麦灌浆期间籽粒和萌发期种子中过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性及其同工酶变
化的结果表明, 在籽粒成熟过程中, 转基因小麦籽粒中POD和CAT活性均低于非转基因小麦; 在小麦种子萌发过程中, 转
基因小麦种子中的 POD和CAT活性也均低于非转基因小麦。
关键词: 小麦; 反义Trx s基因; 过氧化物酶; 过氧化氢酶
Changes in Peroxidase and Catalase Activities during Filling Stage of Grains
and Seed Germination of Transgenic Antisense Trx s Wheat (Triticum aestivum L.)
GUO Hong-Xiang, YIN Jun*
National Engineering Research Center for Wheat, College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,
China
Abstract: To clarify the biological mechanism of transgenic wheat seeds with antisense Trx s gene, the activities
of peroxidase (POD) and catalase (CAT) in filling grains and germinating seeds of wheat were determined. The
activities of POD and CAT in transgenic wheat seeds were lower than those in non-trasgenic wheat during
maturation. And the activities of POD and CAT in transgenic wheat seeds during germination were also lower
than those in non-transgenic wheat.
Key words: wheat (Triticum aestivum); antisense Trx s; POD; CAT
收稿 2008-03-17 修定 2008-06-18
资助 国家自然科学基金(30370877)和国家粮食丰产科技工程
河南课题(20 06BAD 02A0 7)。
* 通讯作者(E -m a i l : x mz xy j@ 1 2 6 . co m; T el : 0 3 7 1 -
6 3 5 5 8 2 0 3 )。
硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是生物体内调节
氧化还原力平衡的一种多功能蛋白, 通过可逆的二
硫键与巯基的变化来调节靶蛋白或酶的生物活性,
已经证明转反义Trx s基因能使小麦成熟期提前和
明显延缓小麦种子发芽进程(周苏玫等 2006a, b;
Guo等 2007; 郭红祥等 2007; 郭红祥和尹钧 2007)。
在逆境情况下, 生物体内广泛存在活性氧爆发现象,
以致自由基增多, 细胞膜产生过氧化, 最终导致细
胞膜的破坏和损伤。在生物体内, 过氧化物酶和过
氧化氢酶等酶组成的清除活性氧自由基的防御体
系, 可以保持生物体内活性氧自由基的平衡, 现已
证明, 这些酶与生物体的成熟衰老密切相关(吴彩娥
等 2002; 林植芳等 199 8)。另外, 过氧化氢酶
(catalase, CAT)和过氧化物酶(peroxidase, POD)还
与种子萌发有关(陈刚等2002; 杜兰芳等2007)。本
文从 CAT和 POD的活性以及同工酶变化入手, 探
讨反义Trx s基因小麦籽粒发育成熟和种子萌发过
程中的 CAT和 POD的活性变化, 从而为阐明转反
义Trx s基因后小麦成熟期提前和明显延缓种子发
芽进程的生理机制提供参考。
材料与方法
以我们实验室得到的转反义 Trx s基因 ‘豫麦
18’ (Triticum aestivum L.)和非转基因小麦‘豫麦18’
为试验材料。分别于小麦开花后 10、15、20、
25、30、35 d取样, 测定酶活性。小麦成熟后,
收获的种子经消毒和浸泡处理后进行发芽试验, 分
别于浸泡处理后 0、1、2、3 和 4 d取样测定。
测定POD酶活性时, 取不同时期小麦籽粒, 液
氮研磨后称重, 按1:5 (W/V)加入提取液, 匀浆提取。
在5 000×g离心5 min, 上清液即为酶提取液。POD
酶活性的测定用 Rao等(1996)文中的方法。
测定CAT酶活性时, 取不同时期小麦籽粒, 于
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液氮中研磨后称重, 按 1:15 (W /V)加入预冷的
pH 7.0磷酸缓冲液, 4 ℃匀浆提取。以 5 000×g离
心 15 min, 上清液即为酶提取液。CAT酶活性测
定用Aebi (1984)文中的方法。
POD与 CAT同工酶电泳时, 取不同时期小麦
籽粒, 于液氮中研磨后称重, 按 1:3 (W/V)加入提取
液, 匀浆后提取 10 h。以 5 000×g离心 20 min, 上
清液即为酶提取液。分离胶为 7%, 浓缩胶为 4%
进行恒压下电泳(浓缩胶 80 V, 分离胶 100 V)。
POD和 CAT同工酶活性染色参见陈毓荃(2002)书
中方法, 酶蛋白染色参见 Bradford (1976)方法。
结果与讨论
1 转反义Trx s基因小麦籽粒灌浆和种子萌发期间
的POD活性变化
从图1~3中可以看出: (1)在小麦籽粒成熟过程
中, POD活性呈现先升后降的变化趋势, 花后 15 d
时 POD活性达到高峰值。非转基因小麦 POD酶
活性高于转基因小麦, 在花后 10~25 d 时达到极显
著水平(P<0.01)。POD是一种保护酶, 因此转基因
小麦籽粒POD活性低于非转基因小麦可能是转基
因小麦成熟期提前的原因之一。在小麦种子萌发
过程中, POD活性同样呈现先升后降的趋势, 非转
基因小麦种子在萌发 1 d时达到高峰值, 转基因小
麦在萌发 2 d后接近于高峰值。POD活性在萌发
进程中表现出上升趋势, 表明其作用不仅仅是参与
活性氧代谢, 还可能参与萌发时的其它物质代谢。
非转基因小麦种子POD活性明显高于转基因小麦,
在萌发 1~4 d均达到极显著水平(P<0.01), 这与非
转基因小麦种子萌发代谢强于转基因小麦相一致。
实验结果表明, 反义 Trx s基因导入降低了小麦籽
粒成熟和种子萌发过程中 POD的活性(图 1)。
图 1 小麦籽粒灌浆期和种子萌发中 POD活性的变化
Fig.1 Changes in POD activity of wheat seeds during filling and germination
图 2 小麦籽粒成熟过程中 POD同工酶电泳图谱
Fig.2 Electrophoregram of POD isoenzyme in wheat seeds during maturation
a: 考马斯亮蓝染色; b: POD 活性染色。1~5 分别为转基因小麦种子萌发 1、0 d以及花后 35、25、15 d籽粒的 POD; 6~10
分别为非转基因小麦花后 1 5、2 5、3 5 d 籽粒以及种子萌发 0、1 d 的 PO D。罗马数字表示同工酶条带, 下图同此。
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(2)在籽粒成熟过程中, POD同工酶活性逐渐
减小, 非转基因小麦籽粒的POD活性高于转基因小
麦, 籽粒成熟后 POD同工酶带消失。图 2的左右
两图对比可知, 转基因和非转基因小麦的酶蛋白含
量基本一致, 而酶活性却差异较大, 表明转基因和
非转基因小麦籽粒酶活性的差异不是由酶蛋白含量
的差异引起的, 而与酶的激活与抑制有关。
(3)在种子萌发过程中, 种子中出现 10种POD
同工酶(图 3)。转基因小麦种子在萌发 2 d后出现,
而非转基因小麦在萌发 1 d时即出现, 转基因种子
PO D 活性低于非转基因种子。同工酶 I II、V、
VIII仅在非转基因小麦中出现, 而其酶蛋白在转基
因和非转基因小麦中均有(图3), 表明在转基因小麦
中, 这三种同工酶受到了抑制。
图 4 小麦籽粒灌浆期和种子萌发中CAT活性的变化
Fig.4 Changes in CAT activity in wheat seeds during filling and germination
图 3 小麦种子萌发过程中 POD同工酶电泳图谱
Fig.3 Electrophoregram of POD isoenzyme in wheat seeds during germination
a: 考马斯亮蓝染色; b: POD 活性染色。1 ~5 分别为转基因小麦种子萌发 0、1、2、3、4 d 的 POD ; 6~ 10 分别为非转基因
小麦种子萌发 0、1、2、3、4 d 的 P O D。
2 转反义Trx s基因小麦籽粒灌浆和种子萌发期间
过氧化氢酶活性的变化
图 4~6显示: (1)在小麦籽粒成熟过程中, 籽粒
CAT的活性逐渐降低; 在小麦种子萌发过程中, CAT
的活性逐渐增高, 在萌发2 d后, 酶活性增加的幅度
较大。无论在籽粒成熟过程, 还是在种子萌发过程
中, 转基因小麦 CAT的活性始终低于非转基因小
麦。在萌发 3~4 d CAT活性差异达到显著水平; 在
籽粒成熟期间, 花后 15 d时差异显著, 其它时间差
异不显著(图 4)。CAT是最早发现的与种子活力有
关的氧化酶类之一, 其活性可间接反映种子活力的
大小(陈刚等2002), 因此反义Trx s导入引起的CAT
活性降低是转基因小麦种子萌发缓慢的一个原因。
CAT还参与活性氧代谢过程, 可以使H2O2生成水和
氧分子(Van Breusegen等 2001), 因此 CAT活性降
低可能是转基因小麦籽粒成熟期提前的一个原因。
(2)随着小麦种子的萌发, CAT的活性逐渐增
加, 主要出现2条同工酶带, 非转基因小麦种子CAT
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的活性高于转基因小麦(图 5-a)。从图 5-b中可以
看出, 随着小麦种子的萌发, 非转基因和转基因小
麦种子 CAT同工酶蛋白量均在逐渐减小。由此可
知, 种子萌发过程中CAT的活性的增加是由于CAT
自身被激活引起的, 而与其酶蛋白含量无关。非转
基因小麦种子中CAT受激活的程度大于转基因小
麦(图 5 )。
(3)在籽粒成熟过程中 CAT活性逐渐降低; 花
后 15 d的籽粒中存在 3种同工酶, 到 25 d以后则
只有 2种同工酶, 这 2种同工酶与小麦种子萌发过
程中出现的同工酶相同。在成熟的籽粒中, 非转基
因小麦籽粒 CAT活性高于转基因小麦。从图 6-b
中可以看出, 在小麦花后 15~25 d期间, CAT同工
酶蛋白量有较大的变化, 其中有一个同工酶带消失,
其它的酶蛋白含量在逐渐减少。花后25 d以后, 酶
蛋白含量没有明显的变化(图 6)。
参考文献
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图 5 小麦种子萌发过程中CAT同工酶电泳图谱
Fig.5 Electrophoregram of CAT isoenzyme of wheat seeds during germination
a: CAT 活性染色; b : 考马斯亮蓝染色。1 ~5 分别为非转基因小麦种子萌发 0、1、2、3、4 d 的 CAT ; 6~ 10 分别为转基因
小麦种子萌发 4、3、2、1、0 d 的 C A T。
图 6 小麦籽粒成熟过程中CAT同工酶电泳图谱
Fig.6 Electrophoregram of CAT isoenzyme of wheat seeds during maturation
a: CAT活性染色; b: 考马斯亮蓝染色。1~5 分别为非转基因小麦种子萌发 4、0 d以及花后 35、25、15 d籽粒的 CAT; 6~10
分别为转基因小麦花后 1 5、2 5、3 5 d 籽粒以及种子萌发 0、4 d 的 C AT。
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