全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月 251
收稿 2003-04-14 修定 2003-12-01
* 通讯作者(E-mail:tanfeng@swnu.edu.cn, Tel:023-
68252698)。
药用植物细胞的大规模培养技术
胡凯 谈锋*
西南师范大学生命科学学院, 重庆 400715
The Technology for Scale-up Cell Culture of Medicinal Plants
HU Kai, TAN Feng*
School of Life Sciences, Southwest Normal University, Chongqing 400715
提要 对药用植物细胞和器官进行大规模培养生产各种次生代谢药物的技术进行了简要介绍。
关键词 药用植物；大规模细胞培养
植物细胞能积累多种次生代谢产物，包括生
物碱、有机酸、色素、糖苷类、挥发油、酶
类、植物激素、植物杀菌素等。当今世界市场
上已知 300 多种生物产品中，90% 以上的产品主
要成分能从高等植物中找到。但由于这些化合物
的结构复杂,目前只能由高等植物进行生物合成,难
以用其它方法制造，因而成本相当高。目前发现
60多种药用植物细胞培养物能产生特定的药用次
生代谢产物，超过30种细胞培养物中的含量接近
或超过亲本中的药物成分含量。
采用大量培养药用植物细胞和器官来生产各
种植物药可以避免常规栽培中不利气候条件、病
虫危害、地理环境和个体差异的限制。通过人为
调节细胞生长和代谢合成，实现工业化生产，可
提高效益、降低成本，而且采用现代生物技术可
以筛选出高表达量的细胞株和寻找到新的药用成
分。由此看来，药用植物细胞的大规模培养显然
是实现中药现代化的一条重要途径。
1 高表达细胞株的筛选
药用植物细胞培养用的细胞株的筛选过程一
般是先通过愈伤组织的诱导，再通过长时期的继
代培养，寻找出生长速度快、次生代谢产物积累
多的单细胞系，进而培养出遗传稳定性高的细胞
株系(图1)[1]。一般包括胚源性细胞株和其他外植
体诱导而来的细胞株。由于不同细胞来源细胞株
次生代谢产物的积累能力有很大的区别，所以在
细胞株的筛选过程中应注意选取次生代谢产物本身
含量高的外植体。
1.1 毛状根和冠瘿瘤的培养 图2是毛状根和冠瘿
瘤组织培养生产药用植物次生代谢产物的途径[1]。
毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程
和细胞工程相结合的一项技术。它是将发根农杆
菌的 Ri 质粒中含有的 T-DNA 整合到植物细胞的
T - D N A 上，诱导植物细胞产生毛状根。这种毛
状根具有激素自养的特性，生长迅速，遗传性状
稳定。目前，已有大约31个科 100余种植物建立
了毛状根培养系统，其中大多为药用植物，如黄
花烟草、曼陀罗、颠茄、莨菪、长春花、紫
草、红豆杉、人参、黄连等。Yang等[2] 和 Kevers
等[3]曾分别对人参和西洋参的毛状根培养系统进行
了研究。Aoki 等[4]筛选出莨菪碱含量差别很大的
颠茄的不同毛状根株系，发现用毛状根培养系统
生产次生代谢产物在产率和经济成本都比悬浮细胞
培养优越得多。王莉等[5]在培养何首乌毛状根中发
现培养30 d的毛状根增长11.03倍，其中大黄酸
的含量为2.49 mg.g-1(DW)，为原植物的2.85倍，
大黄素的含量为 79.6 mg.g-1(DW)，为愈伤组织
的 1 781 倍。冠瘿瘤同样具有激素自养、生长迅
速、遗传性状稳定的特点，它是根癌农杆菌感
染植物而形成的。Spencer 等[6]发现在柠檬留兰
植物生理学与农业及生产应用Plant Physiology and Agriculture and Applications
植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月252
香的冠瘿瘤组织中可产生柠檬留兰香油的腺体。
雷和田等[7]用Ti质粒和Ri质粒对括楼进行双转化
后发现经过双转化的毛状根有生长更迅速而蛋白含
量不变的特点。澳大利亚的 Mahagamasekera 和
Doran[8]还发现将颠茄的毛状根与Duboisia hybrid
的冠瘿组织共培养时，能产生大量莨菪碱，但两
者在单独培养时都不产生莨菪碱。
1.2 反义技术 用药用植物细胞培养生产的药物多
数是次生代谢产物，其代谢途径常常是植物的分
支代谢之一。因此如何抑制与细胞生长和目的产
物积累无关的分支代谢途径是提高产率的一个重要
方法。采用现代分子生物学技术中的反义技术将
有可能实现这一点。以人工合成的反义 RNA 导入
到植物基因组内与要抑制的代谢途径的关键酶基因
RNA 结合成双链 RNA 来阻断基因的正常表达，进
而促进目的产物合成基因的表达。番茄中的乙烯
合成酶的反义 R N A 转入番茄后，乙烯合成减少
97%[9]。目前,采用毛状根培养生产药用代谢产物
图2 由植物器官培养生产次生代谢物的路线[1]
图1 由药用植物细胞生产次生代谢产物的路线[1]
植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月 253
的情况见表 1[10~23]。
2 培养方法的选择
2.1 两步培养法 培养基的组成是细胞生长和次级
代谢产物形成最直接、也是最重要的影响因素。
众多实验表明，用同一种培养基同时达到细胞的
最佳生长和最佳次生代谢产物的积累是不现实的。
因此，人们提出了两步培养法，第一步主要使用
适合细胞生长的培养基即生长培养基，第二步使
用适合次级代谢产物合成的培养基即生产培养基。
张浩等[24]在黄连细胞培养中采用两步培养法取得了
较好的效果。他们先用生长培养基培养 3 周，再
在生产培养基中培养3周后，细胞干重达到16.72
g.L-1，总生物碱量达到556 mg.L-1，比一步培养
法提高1.72倍。李弘剑等[25]在黄花蒿细胞培养过
程中也采用了两步培养法，分别在N6和改良N6培
养基中培养，结果青蒿素合成量达到190 mg.g-1。
2.2 两相培养技术 在药用植物细胞培养中，由于
大多数次生代谢产物是疏水性的，在培养液中的
溶解度很低，不能及时释放到培养液中，造成反
馈抑制和被一些酶类水解，因而次生代谢产物产
量很低，不能达到工业化生产的要求。细胞培养
时可采用两相培养技术即细胞培养——分离耦合技
术，于培养液中加入对细胞无毒性的吸附剂和萃
取剂后，再及时将次生代谢产物分离出培养系
统，这样可得到较高的产率。目前用得较多的吸
附剂主要是 XAD-4 和 XAD-7，萃取剂主要是十六
烷。梅兴国等[26]用两相系统培养红豆杉细胞，40
d细胞生物量达到17.85 g.L-1(DW)，这虽比常规
培养略低，但紫杉醇产量却有较大提高，达到
30.19 mg.L-1。
前体化合物饲喂和诱导子、抑制子的添加也
很重要。次生代谢产物的积累量少的一个重要原因
在于植物体内合成代谢处于植物代谢的众多分支之
中，因此前体化合物的供给不足和信号诱导的缺
乏会严重影响次生代谢产物的积累。李弘剑等[25]
在黄花蒿细胞培养中分别加入前体物质青蒿酸和植
物固醇生物合成抑制剂双氯苯咪唑或以氯化胆碱处
理，青蒿素产量分别提高3倍和8倍多。Kim等[27]
在人参培养物中添加一种真菌诱导子(Botrytis
cinera)，24 h后苯醌的产量达到(46.13±10.42) mg.
g-1(FW);添加一种酵母制备物12 h后，苯醌的产量
达到(65.10±4.96) mg.g-1(FW)。Zamir[28]和Fett-Neto
等[29]认为前体物质在促进红豆杉积累紫杉醇中具有
重要作用。周忠强等[30]在红豆杉细胞培养中加入
诱导子水杨酸和茉莉酸甲酯，前体物质乙酸钠、
苯丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、肉桂酸、苯甲酸
钠和丙酮酸钠，抑制子氯化胆碱和赤霉酸后，紫
杉醇产量提高 368.5%。
3 大规模培养药用植物细胞的生物反应器
植物细胞培养反应器初期大多采用微生物反
应器。由于植物细胞与微生物细胞形态结构不
同，对剪切力耐受性差和对氧需求低等原因，多
数微生物反应器并不适合植物细胞的生长。目前
用于药用植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、
非搅拌式和其他一些类型的生物反应器。机械搅
拌式生物反应器有较大的操作范围，混合程度
高，适应性广，适合大规模生产，但其剪切力
大，容易损伤细胞，直接影响细胞的生长代谢和
次生代谢产物的积累。Zhong 等[31]在中国红豆杉
细胞培养中发现，5 s混合时间所造成的剪切力比
10 min混合时间对细胞的伤害小。目前人们对搅
拌形式、叶轮结构和空气分布器进行了改进，力
求减少剪切力、满足供氧、混合的要求。曹阳
等[32]采用70 L的环形通气与螺旋桨叶搅拌相结合
的大型生物反应器培养长春花细胞，15 d后生物
表1 利用毛状根培养生产药用代谢产物[10]
植物种类 药用代谢产物 参考文献
鬼针属 多炔 Mckinely等[11]
金鸡纳树 喹啉生物碱 Hamill 等[12]
菊苣 香豆素 Bais等[13]
曼佗罗属 莨菪烷 Rhodes[14]
决明属 蒽醌 Ko等[15]
紫松果菊 生物碱类 Trypsteen等 [16]
甘草 甘草酸、甘草皂甙 Ko等[17]
人参 皂甙 Yoshikawa 和 Furuya[18]
丹参 二萜类 Hu 和 Alfermann[19]
艾属 挥发油 Kennedy等 [20]
紫草 紫草宁 Shimomura 等 [21]
茜草 蒽醌 Shin 和 Kim[22]
人参 人参皂甙 Kunshi等 [23]
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量达到205.6 g.L-1。黄艳等[33]用倾斜式平板搅拌通
气型生物反应器悬浮培养水母雪莲细胞生产黄酮类
物质，培养12 d，细胞干重达到13.8 g.L-1，黄
酮产量为416 mg.L-1，但同时也发现由于反应器剪
切力的影响，产率比摇瓶培养的还低。
用非搅拌式生物反应器培养植物细胞和器官
的主要有气升式反应器、转鼓式反应器和各种固
定流化床以及膜反应器(表2)[34]。Liu等[35]用一种
改进的气升式内旋生物反应器培养青蒿毛状根，
培养20 d 后，青蒿素产量达到了577.5 mg.L-1。
喷雾反应器在器官培养中也经常用到。刘春朝等[36]
利用新型的雾化生物反应器培养青蒿不定芽，通
过中心导流筒的各个出孔，使营养雾在几分钟内
可以充满整个培养室，从而明显提高了供氧和减
小了剪切力对细胞生长的影响，25 d后，青蒿素
产量为46.9 mg.L-1，是摇瓶培养的3.2倍。兰文
智等[37]用一种连续灌注简易流化床生物反应器培养
红豆杉细胞生产紫杉醇，取得了比传统搅拌和气
升式生物反应器更好的效果。膜式固定化细胞生
物反应器效率很好，易于放大和控制细胞的生
长，下游处理很方便，是目前应用较多的一种固
定生物反应器[38]。在用膜固定的方式培养长春花
细胞时，发现膜生物反应器非常适合这种细胞的
生长和生物碱的释放。Tyler等[39]采用的一种植物
细胞表面固定化培养系统，可减小剪切力的影响，
并能促进植物细胞凝聚，增加次生代谢产物合成和
表2 药用植物细胞培养生产次生代谢产物的培养效果和生物反应器的应用[34]
培养器官 生物反应器 培养效果 植物
细胞
芽
体细胞胚
毛状根
冠瘿组织
机械搅拌式反应器、气升式反
应器、固定床反应器、流化床
反应器、中空纤维反应器等
雾化反应器、喷淋反应器, 鼓泡
塔、径向留反应器
气升式反应器、螺旋式搅拌反
应器、自旋过滤反应器
雾化反应器、气升式反应器、
搅拌反应器、转鼓反应器、鼓
泡塔反应器
搅拌式反应器、中空纤维固定
反应器等
生长慢，次生代谢物含量较低，采用
固定化培养可促进生长和代谢，可以
大规模培养
生长慢，次生代谢物含量高，需光
照，浸没培养
生长慢，次生代谢物含量高
生长迅速，分支多，次生代谢物含量
高，不需外源激素，放大培养容易
生长迅速，次生代谢物含量高，不需
外源激素，悬浮培养为颗粒，易放大
培养
人参、长春花、红豆杉、毛地
黄、青蒿、鸟茄、水母雪莲、
黄连、紫草等
青蒿、长春花、毛地黄、唐菖
蒲等
红豆杉、青蒿、人参等
红豆杉、青蒿、长春花、人
参、丹参、辣根、何首乌、
菘蓝、颠茄等
丹参、洋地黄、金鸡纳、柠檬
留兰香等
图3 用柱式生物反应器培养固定化药用植物细胞生产药物[9]
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积累。目前用于药用植物细胞培养的生物反应器见
表2[34]。图3是利用生物反应器培养固定化细胞生
产药物的装置[9]。药用植物毛状根培养生产次生代
谢物常用生物反应器结构如图4[9]所示。
4 几种药用植物细胞和器官培养的实例
4.1 红豆杉细胞和毛状根培养生产紫杉醇 紫杉醇
是上世纪70年代首次从短叶红豆杉树皮中分离到
的具有抗癌活性的二萜烯类化合物。紫杉醇能与
微管蛋白结合，并促进其聚合，抑制癌细胞有
丝分裂，阻止癌细胞的无限增殖。目前用红豆
杉细胞培养生产紫杉醇是一个比较可行的方法。
通过筛选高表达的细胞株，大量培养时加入前体
物质[40]、诱导子[41~43]或抑制剂等可提高紫杉醇的
产量。梅兴国等[44]在培养红豆杉细胞时加入抑制
类胡萝卜素合成的 Clomazone，发现紫杉醇的产
量比不加 Clomazone 提高了 3倍。Zhang 等[45]在
不同接种量和不同培养时间的云南红豆杉细胞悬
浮培养液中加入诱导子(Ag +、茉莉酸甲酯等)，
发现接种量为200 g(FW).L-1的二十天龄细胞的产
量达到39.8 mg.L-1。罗杰等[46]发现补料批式培
养红豆杉细胞生产紫杉醇的效果比批式培养
好。随着分子生物学的发展和紫杉醇代谢酶类
研究的深入，紫杉醇生物合成途径开始被人们
所了解[47~49]，许多紫杉醇代谢途径中的酶都已
经克隆[50,51]。因此目前趋向于用现代分子遗传学
的方法来提高紫杉醇的产率。通常是用分离和克
隆出的关键酶的基因加上强启动子或者经过修饰
后，构建在质粒载体上，通过根癌农杆菌转化到
红豆杉基因组中，构建转基因模式红豆杉植株、
紫杉醇高产细胞系[51]或者诱导具有产紫杉醇能力的
图4 用于毛状根培养的生物反应器[9]
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冠瘿组织[52]。也可通过发根农杆菌转化红豆杉枝
叶或愈伤组织得到毛状根来生产紫杉醇。
4.2 人参细胞和毛状根的培养 人参为五加科植物，
具有大补元气、固脱生津、安神益智的功能，是
一种名贵的滋补强壮药物。它主要含有强生理活
性的生物碱、皂甙、萜类和甾体类物质。前苏
联БУТеНко等早在上个世纪50年代末、罗
士韦等在 1964 年就开始了人参愈伤组织的培养。
随后，各国的研究者都相继成功获得了人参的愈
伤组织。目前主要研究方向是通过人参细胞悬浮
培养和人参毛状根的培养生产各种次生代谢产物。
Kim 等[27]用人参细胞悬浮培养生产苯醌类物质。
Lu等[53]在人参细胞悬浮培养中加入诱导子后皂甙
的含量达到细胞干重的 2.07%，是未加诱导子的
28倍。于荣敏等[54]探讨了不同理化因子对西洋参
冠瘿组织培养合成人参皂甙的影响，发现在White
培养基中，pH 为 5.6、肌醇为0.05 g.L-1、接种
量为6 g(FW).瓶-1的人参皂甙1的积累量最多。现
在日本和德国都已获得了人参细胞工业化生产的专
利，开始了人参细胞大规模培养生产。由于人参
细胞的次生代谢产物含量、生长速度和培养条件
都无法与人参毛状根培养系统相比，所以目前研
究的热点都集中在毛状根培养系统。日本学者
Yoshimastsu和Yomaguchi[55]用发根农杆菌转化人
参叶柄,已获得了能在离体条件下生长迅速的毛状
根。Yang和Chai[56]用发根农杆菌 15834转化人参
已得到一种高产的毛状根系统。赵寿经等[57]培养
以发根农杆菌 A4 转化的毛状根，14 d 后，鲜重
增加7.97倍，人参皂甙含量为10.38 mg.g-1(FW)，
超过六年生的人参根[6.45 mg.g-1(FW)]。同时,他们
利用PCR方法,从人参毛状根中扩增并克隆了影响
人参皂甙合成的基因rolC[58]。这表明今后有可能
在基因水平上对毛状根积累皂甙进行调控，从而
筛选出高表达的毛状根株系。
4.3 长春花培养生产生物碱 长春花是夹竹桃科长
春花属植物。20世纪50年代人们发现其细胞和组
织培养物中含有 100 多种次生代谢产物，其中大
多为生物碱。它们的天然含量较低，但具有很强
的生物活性，是目前应用最广的天然抗癌药物之
一。Parul等[59]研究各种天然长春花属植物中的生
物碱含量，发现其含量相当低而且种间和器官间
差异显著。因而利用组织培养和细胞工程技术筛
选高产细胞系和用毛状根的培养生产各种长春花生
物碱成了目前研究的热点。在细胞培养中加入前
体物质如马钱子甙，诱导子如茉莉酮酸、甲壳
质、果胶酶等均能提高长春花次生代谢产物的积
累量。Zhao等[60]在培养长春花细胞的系统中加入
KCl、甘露糖、前体物质(琥珀酸色氨和色氨酸)
和一些生物代谢调节物后，观察到处理后细胞产
生的长春花碱和西萝芙木碱是未经处理的4倍多。
目前对长春花生物碱的基本代谢模式已比较清楚，
但是其中关键限速酶还在研究之中[61]。 Canel等[62]
和Geerlings等[63]研究色氨酸合成酶和色氨酸脱羧
酶在长春花细胞合成吲哚类和喹啉类生物碱中的
作用，发现采用基因工程方式超量表达这两种酶
后，生物碱产量超过了 200 mg.L-1，表明这两种
酶对长春花生物碱合成速度的重要性。近年来,由
于毛状根培养技术在植物次生代谢产物生产中的
广泛应用,长春花的毛状根培养系统也经常有所报
道[64~66]。
4.4 紫草细胞培养生产紫草宁和色素 紫草宁及其
衍生物为萘醌类化合物，具抗肿瘤、抗炎和抗菌
活性，还有抗肝脏氧化损伤和抗受孕作用。紫草
又是日化用品原料,日本已成功地以其中的色素研
制开发出天然色素口红,因其不含人工色素,上市之
初就深受消费者欢迎。日本学者Tabata等最先成
功诱导了硬紫草愈伤组织,并生产出紫草宁及其衍
生物[67]。随后，人们为提高紫草宁产量又进行了
了大量的研究。目前的研究主要集中于怎样提高
培养系统的产率，采用的方法主要有吸附培养[68]
和两相培养等。 薛莲等[69]用液体石蜡为有机溶剂,
对紫草细胞进行双液相培养，观察到在有机相与
水相的比例为1∶5时,细胞的紫草宁产率为0.305
g.g-1(DW)细胞,终产率为0.665 g.g-1 (DW)接种细
胞,分别为悬浮培养产率的4.24倍与3.82倍。薛
莲等[70]还采用吸附固定化结合液体石蜡原位萃取
培养紫草细胞，产率达到悬浮培养的 12. 7 倍。
Touno 等[71]研究茎诱导的细胞悬浮培养生产紫草
宁，发现 K T 对提高细胞生长速率有重要作用，
B5 液体培养基培养 5周后紫草宁的产量达到细胞
植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月 257
干重的 2.3%。调控其次生代谢过程中的关键限速
酶将有可能发展成一种人为调节紫草素产量的模式
培养系统。Yamamura等[72]和 Yamamoto等[73]分别
研究桂皮酸羟化酶和牦牛酸氢醌羟化酶的结果显
示：这两种酶在紫草细胞内的表达量与紫草素的
合成速度明显相关，并已将其基因克隆，说明通
过外源基因调节紫草素的合成是可能的。除了紫
草细胞培养之外，有人还对冠瘿细胞和毛状根培
养系统进行了研究。祁建军等[74]用根癌农杆菌转
化紫草，结果在得到的细胞系中紫草素含量达到
1.18%。Yazaki等[75]利用农杆菌15834将外源的强
启动子花椰菜花叶病毒35S启动子转入到紫草基因
DNA 中，并在毛状根的各个部位都检测到了 35S
启动子的表达，提高了合成紫草宁的相关酶类的
表达，并利用毛状根来生产紫草宁获得成功。由
于紫草细胞和毛状根培养时表现出光依赖性地抑制
紫草宁的生物合成。因此Yazaki等[76]还将一种暗
诱导蛋白LeDI-2转入紫草中，研究发展了一种在
紫草细胞和毛状根培养中提高紫草宁含量的光调控
方法。
5 药用植物细胞培养面临的问题
植物细胞和器官培养生产药用次生代谢物的
工业化早就引人注意。固定化细胞和毛状根已能
够大规模培养。但不同的细胞或组织所需的生物
反应器不同，没有一种现有的生物反应器是通用
的。重要的是要有一种既能提供足够的生物量又
能积累次生代谢产物的经济、可行的生物反应
器。从目前的水平来看，任何一种化合物如果每
千克价值低于1 000美元，用细胞培养进行生产则
是很困难的。除非生物反应器生产的化合物具有
价格高，市场需求大时，才有可能实现。这项
技术的主要障碍有：(1)工业化生产所要求的药用
植物细胞和器官培养以及它们次生代谢产物的合成
的基本知识还非常缺乏。植物细胞的活力以及在
反应器中受各种理化因子的影响最近才开始有所研
究，远远落后于人们对微生物和动物细胞培养的
认识。(2 )次生代谢物的合成需要一段很长的过
程，其中还包括多种酶类之间的协同和相互抑
制，这种生物合成比在微生物和哺乳动物细胞中
合成重组蛋白或只有一两个基因决定的蛋白质的过
程要复杂得多。这也是为什么植物细胞和组织培养
的商业化还没有取得成功的一个重要原因。(3)药用
植物细胞和器官培养的经济成本相当昂贵。这项技
术必须要有高成本的生物反应器以及能维持适宜生
长条件的各种辅助控制仪器和严密的操作控制程序
方可实现，而这些都需要很高的成本。
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