全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 683
甘蓝型油菜 γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆和功能验证
钱文成，陈德富，王绘砖，王永芹，陈喜文 *
南开大学生命科学学院，天津 300071
提要：采用 RACE技术，从甘蓝型油菜中克隆出一含 1 044个碱基的开放阅读框架的 γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因
全长 cDNA。将其成熟蛋白编码区克隆进 pET21b (+)多克隆位点，在大肠杆菌 BL21 (DE3) CodonPlus中表达出一个分子
量为 36 kDa的融合蛋白。酶学分析显示，重组酶具有 γ-TMT活性。
关键词：生育酚；γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT) ；功能验证；甘蓝型油菜
Gene Cloning and Function Confirmation of γ-Tocopherol Methyltransferase
from Brassica napus L.
QIAN Wen-Cheng, CHEN De-Fu, WANG Hui-Zhuan, WANG Yong-Qin, CHEN Xi-Wen*
College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract: The full-length cDNA of γ-tocopherol methyltransferase (γ-TMT) which contained a 1 044 bp open
reading frame was cloned from Brassica napus by rapid amplification of cDNA end (RACE) method. The
mature encoding region was then cloned into multiple cloning sites of pET21b (+) and a 36 kDa recombinant
protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) CodonPlus. Enzymatic analysis indicated that the recom-
binant protein had γ-TMT activity.
Key words: tocopherol; γ-tocopherol methyltransferase; function confirmation; Brassica napus
收稿 2007-05-16 修定 2007-06-18
资助 天津市自然科学基金重点基金(07JCZDJC03800)。
* 通讯作者(E-mail：xiwenchen@nankai.edu.cn；Tel：
02 2-23 50 01 33 )。
维生素 E是 8种生育酚类化合物的总称，由
一个芳香杂环和类异戊二烯基侧链组成。它是一
种脂溶性抗氧化剂，是维持人体正常生理功能所
必需的(Fryer 1992)。临床医学证明，日吸收
100~400 IU的维生素 E，可提高人体免疫功能，
防止或延缓许多慢性病的发生，降低患心血管疾
病和某些癌症的危险。同时，维生素 E还可作为
治疗老年性痴呆病、高血压、冠心病、心肌梗
塞、动脉硬化、血栓等的辅助药物(Stampfer等
1993；Rimm等 1993；Buring和Hennekens 1997)。
在 8种维生素 E中，α-生育酚活性最高，β、γ、
δ-生育酚的活性分别是α-生育酚的 50%、10%和
3% (Traber和 Sies 1996)。
维生素 E仅由植物和某些光合细菌合成。但
在维生素 E含量最为丰富的油料作物如大豆、油
菜、花生中，α- 生育酚的含量较低，仅占总生
育酚的 7 % ~ 1 0 %，而 γ - 生育酚含量则高达
6 0 % ~ 7 0 %，以致生育酚总活性很低(黄筱声
2001；Grusak和DellaPenna 1999)。γ-生育酚甲
基转移酶(γ-tocopherol methyltransferase，γ-TMT)
是维生素E生物合成途径中的限速酶，催化 γ-生
育酚向 α-生育酚的转化。尽管多种藻类及植物
中 γ-TMT基因已得到克隆(Cho等 2005；Tavva
等 2007)，但作为油料作物的甘蓝型油菜中的 γ-
TMT基因克隆尚未见报道。本文从甘蓝型油菜
中克隆出 γ-TMT全长 cDNA，并将其成熟蛋白编
码区克隆进 pET21b (+)进行表达，表达的重组酶
能有效地将 γ-生育酚转变为 α-生育酚。现报道
如下。
材料与方法
甘蓝型油菜(Brassica napus L.)的品系‘垦
C1’(陕西省农垦科研中心李殿荣先生馈赠)，播
种于 25 ℃、15 h光照 /9 h黑暗(光强约为 420
µmol·m-2·s-1)的人工气候室中，20 d后取其叶片用
于总RNA的提取。大肠杆菌菌株DH5α-FT、BL21
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月684
(DE3)、BL21 (DE3) CodonPlus和表达载体pET21b
(+)由我室保存。克隆载体 pMD18-T、Ex-Taq
D N A 聚合酶、D N A 连接酶、限制性内切酶、
IPTG、PCR引物等试剂均购自宝生物工程(大连)
有限公司。α-生育酚和 γ-生育酚购自于 Sigma公
司。腺苷甲硫氨酸(SAM)购自纽英伦生物技术(北
京)有限公司。色谱级甲醇及异丙醇购自天津大学
科威公司。
甘蓝型油菜叶片总 RN A 提取、pol y (A) +
mRNA分离、全长cDNA合成等参照Chen等(2003)
文中的方法。根据GenBank注册的 γ-TMT序列，
设计一对兼并引物TMT-1 [5 ATGAAAGCRACTCT-
MGCASCAC 3 (R=A或G，M=A或 C，S=C或
G)]和TMT-2 [5 TTAGAGWGGCTTCTGGCAAGY
3 (W=A或 T，Y=C或 T)]，扩增甘蓝型油菜 γ-
TMT中间序列。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回
收后克隆到 pMD18-T上，再转化进 DH5α-FT，
采用菌落 PCR和酶切等方法筛选阳性转化子后，
由北京三博远志生物有限责任公司测序。
根据所得 γ-TMT中间序列，设计 3-RACE引
物 R3 (5 TATGCCTGACAAGGCCAAG 3)和 5-
RACE引物R5 (5 AACTTGGCCTTGTCAGGCATA
3)。以 R3和Oligo (dT)-Gan [5 CGCAGAGTC(T)30
3]为引物扩增出 γ-TMT的 3端。为了扩增出 γ-
TMT的 5端，先用 Smart-5-end (5 GGTAT-
CAACGCAGAGTACGCGGG 3)和TMT-2为引物进
行第一轮扩增，再以 Smart-5-end与 R5为引物进
行巢式扩增。3端和 5端序列获得后，与中间序
列拼接成甘蓝型油菜 γ-TMT全长 cDNA，命名为
BnTMT，随后送GenBank注册，作 BLAST比对
分析。
根据所得的 γ-TMT全长序列，设计引物 E1
(5 CGGATCCAAGCGTAGCTGTGACGGCT 3，下
划线为 BamHI酶切位点)和 E2 (5 CAAGCTT-
GAGAGGTTTCTGGCAAGTGATG 3，下划线为
HindIII酶切位点)，以全长 cDNA为模板扩增 γ-
TMT成熟蛋白编码区。扩增产物纯化后先重组到
pMD18-T上，再提取阳性转化子中的重组质粒进
行 BamHI和HindIII酶切。回收酶切的 γ-TMT成
熟蛋白编码区片段，与经同样限制性内切酶消化
的 pE T2 1 b ( + )载体进行连接。连接子转化入
DH5α-FT，测序鉴定的阳性重组子再转化入BL21
(DE3)或 BL21 (DE3) CodonPlus。阳性表达株于
37 ℃下振荡培养至 A600=0.6后，加入终浓度为 1
mmol·L-1的 IPTG，于 22 ℃条件下诱导 BnTMT表
达。过夜表达的菌液经离心后收集菌体沉淀，再
悬浮于 100 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.4)中，于
- 80 ℃/4 ℃下作冻融处理和超声波破碎，再以
17 400×g转速下于 4 ℃离心 15 min，上清液即为
酶粗提液。粗提液以 12.5% SDS-PAGE检测，并
用 Bradford (1976)法测定其蛋白含量。
参照Shintani和DellaPenna (1998)的方法测定
γ-TMT活性。250 µL反应体系中含 50 mmol·L-1
Tris-HCl (pH 8.2)、1 mmol·L-1 DTT、0.24 mmol·L-1
山梨醇、1.94 mmol·L-1 γ-生育酚、1.28 mmol·L-1
SAM和 198 µL酶粗提液，于 25 ℃下温育 1.5 h后
用氯仿 /甲醇(2:1，V/V)终止反应。反应液于 4 ℃
下以 27 300×g离心 10 min，收集氯仿层，充氮
气干燥，溶于 40 µL无水乙醇中。生育酚含量分
析参照 Sattler等(2003)文中的方法，HPLC系统为
Agilent 1 100高效液相色谱系统(美国安捷伦科技有
限公司)，层析条件为：反相 C18分析柱(进口填
料为NYQG-C18，粒径为 5 µm，长 250 mm×直
径 4.6 mm)，流动相为甲醇 /异丙醇(95:5，V/V），
流速固定在 1.2 mL·min-1，检测激发波长为 290
nm，发射波长为 325 nm。γ-TMT活力单位(U)定
义为每小时生成 1 nmol α-生育酚所对应的酶量。
酶活性取 3次平均值。
实验结果
1 甘蓝型油菜γ-TMT基因的克隆和序列分析
根据GenBank注册的高等植物 γ-TMT保守区
序列，设计一对兼并引物，从甘蓝型油菜总
cDNA中扩增出一长为 1 044 bp的片段。序列分
析表明，该片段与GenBank注册的 γ-TMT有很高
的同源性，初步认定其为甘蓝型油菜 γ-TMT基因
片段。再用 RACE技术，获得该基因片段的两侧
序列。经序列拼接，获得甘蓝型油菜 γ-TMT基
因全长 cDNA序列，命名为 BnTMT，GenBank注
册号为DQ508019。图 1显示，BnTMT全长 1 254
bp，(G+C) %=49.14%，5端起始密码子 ATG前
有一长为 41 bp的非编码区，3端终止密码子TAA
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 685
后有一长为 169 bp的非编码区，开放阅读框架长
1 044 bp。根据 BnTMT编码序列，推导该多肽长
为 347个氨基酸，分子量为 38.2 kDa，pI=6.76，
在N端有一由 47个氨基酸组成的叶绿体导肽。在
多肽的第129~137和第219~228位置上各有一保守
的SAM结合结构域。整个序列与报道的其他物种
γ-TMT有较高的同源性，据此认定该 cDNA是完
整的，其编码的蛋白质是依赖SAM提供甲基的 γ-
T M T。
图 2是 BnTMT与其他 19种 γ-TMT氨基酸序
列比对结果，反映了 γ-TMT在进化中的相对保守
性——从藻类到高等植物，均依赖 SAM提供的
甲基催化 γ-生育酚生成 α-生育酚。图 2还显示，
尽管单子叶植物与双子叶植物来源的 γ-TMT分成
两大类，但都与藻类 γ-TMT相差甚远，反映 γ-
TMT的进化与其物种进化高度一致。从同源数值
来看，BnTMT与其他γ-TMT的同源性介于42.8%~
99.1%之间，差异主要集中于N端，尤其是导肽
切割位点前。BnTMT与十字花科的芥菜、结球
甘蓝和拟南芥的 γ-TMT亲缘关系最近，其中与芥
菜 γ-TMT仅差 0.9%；与藻类 γ-TMT亲缘关系最
远，差异高达 5 7 . 2%。
图 1 BnTMT全长DNA序列及其推导的氨基酸编码序列
Fig.1 Full-length DNA sequence of BnTMT and its deduced amino acid sequence
　　推导氨基酸序列在核苷酸序列下方，箭头所示位置为推测的叶绿体导肽切割位点，方框为 S AM 结合结构区域，星号所示核
苷酸为终止密码子，下划线核苷酸为聚腺苷酸化信号。
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月686
2 甘蓝型油菜γ-TMT成熟蛋白编码区在大肠杆菌
中的表达
BnTMT的N端具有叶绿体导肽，前体BnTMT
在导肽的牵引下进入叶绿体。对于大肠杆菌表达
系统而言，导肽的存在可能影响重组酶功能，因
此在构建表达载体时应将其去除。为此，本文在
BnTMT全长序列基础上又设计了一对引物 E1和
E2，以扩增 BnTMT成熟蛋白编码区。阳性转化
子序列分析显示，去除导肽序列的 903 bp编码序
列已成功地被克隆进 pET21b (+ )的 BamHI 与
HindIII位点之间，其转录受 T7启动子控制。转
录的mRNA在理论上可表达出328个氨基酸残基组
成的分子量为 36.3 kDa的融合蛋白。
遗传密码分析显示，BnTMT上有较多大肠杆
菌稀有密码子，因此本文比较了其在 BL21 (DE3)
和 BL21 (DE3) CodonPlus中的表达效果，其中
BL21 (DE3) CodonPlus携有编码稀有密码子 tRNA
基因。SDS-PAGE检测发现，在 BL21 (DE3)的上
清液和沉淀中即使优化表达条件(温度、IPTG浓
度、IPTG 诱导时的菌体初始浓度及诱导时间)，
也不能发现分子量为36 kDa的特异条带；在BL21
(DE3) CodonPlus上清液中虽然没有明显的特异条
带，但在其沉淀中可清楚地看见一条 36 kDa大小
的特异条带(图 3)，显示 BnTMT在 BL21 (DE3)
图 2 不同物种 γ-TMT的MegAlign图
Fig.2 MegAlign profile of γ-TMTs from different species
　　MegAlign用 DNAStar-Lasergene (Ver 6.1)中的 Clustal W方法。聚类分析用的 20 种 γ-TMT分别来源于马铃薯(DQ456877)、
番茄(D Q4 5 6 8 76 )、陆地棉(DQ 4 56 8 8 0)、大豆(AY9 6 0 1 26 )、百脉根(D Q0 1 3 3 60 )、紫苏(AF2 13 4 8 1)、向日葵(D Q2 2 9 8 31 )、
甘蓝型油菜(D Q50 801 9，本文所得序列)、芥菜(D Q8 649 78 )、结球甘蓝(AF381 248 )、拟南芥(AF1 042 20 )、高粱(AF5 278 09 )、
玉米(D Q 4 5 6 8 7 9 )、小麦(D Q 1 3 9 2 6 6 )、绿藻(CR9 5 4 2 1 6 )、莱茵衣藻(AJ 8 8 4 9 4 8 )、节球藻(N Z_ A AVW0 1 0 0 0 0 0 1 )、念珠藻
(NC_003272)、集胞藻(NC_000911)和无类囊体蓝藻(NC_005125)。
图 3 BnTMT在BL21 (DE3) CodonPlus中的表达
Fig.3 The expression of BnTMT in BL21 (DE3) CodonPlus
　　M：蛋白分子量标准物(k D a )；A：pET 2 1 b (+ )菌液上清
液；B：pET21 b (+) -Bn TMT菌液上清液；C：pET21 b (+ )菌
液沉淀；D：p E T 2 1 b ( + ) - B n T M T 菌液沉淀。箭头所示为
B n T M T 融合蛋白。
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 687
CodonPlus中主要以包涵体形式表达。
3 甘蓝型油菜γ-TMT重组酶的活性分析
尽管对BnTMT在BL21 (DE3) CodonPlus中的
表达条件进行了多方面优化，但从 SDS-PAGE图
谱来看，包涵体问题仍未得到有效解决，为此我
们以大肠杆菌破碎液的上清液(即酶粗提液)进行
BnTMT酶活性分析。在粗提液中加入 γ-生育酚和
SAM，25 ℃下温育 1.5 h后，用HPLC法测定生
育酚的变化，结果在反应产物中出现了新的对称
峰(图 4)，其峰形和保留时间(11 min)与 α-生育酚
标准品一致，同时，其底物 γ-生育酚的峰面积也
相应减少。说明酶粗提液中存在活性 γ-TMT，此
酶以 SAM为甲基供体将 γ-生育酚转变为 α-生育
酚。按照峰形面积，计算出酶比活力约为24.7 U·mg-1
(蛋白)，比 Shintani和DellaPenna (1998)报道的另
一大肠杆菌菌株中表达的拟南芥和集胞藻
(Synechocystis sp. PCC 6803) γ-TMT比活性高。
显示 BnTMT在 BL21 (DE3) CodonPlus中有较高的
γ-TMT活性。而在含 pET21b (+)-BnTMT的 BL21
(DE3)上清液中则未见到明显的峰形变化。
图 4 BL21 (DE3) CodonPlus表达的BnTMT的 γ-TMT活性
Fig.4 γ-TMT activity of BnTMT produced in BL21 (DE3) CodonPlus
a：pET 2 1 b (+)菌上清液；b：pET2 1 b (+) -Bn TMT 菌上清液。
讨　　论
本文从甘蓝型油菜中克隆出 γ-TMT基因全长
cDNA序列，将其成熟蛋白编码区克隆入表达载
体，可在大肠杆菌 BL21 (DE3) CodonPlus中高效
表达，表达出的重组蛋白具有明显的 γ-TMT活
性。从而证实 BnTMT克隆是真实的，其编码的
蛋白质是 γ-TMT家族的一员。同源性分析显示，
甘蓝型油菜的 γ-TMT与目前注册的 γ-TMT有较高
的同源性。2个 SAM结合结构域及其附近氨基酸
序列的同源性很高，尤其是第一个SAM结合结构
域内的后 7个氨基酸(DVGCGIG)在目前已注册的
20多种序列中几乎完全同源，其余氨基酸变化也
多限于生理功能相似氨基酸间，如V与Ｉ、L等。
γ-TMT的这种保守性证实SAM结合结构域及其附
近氨基酸序列在长期进化过程中承受着较大的功能
选择压力。
γ-TMT的N端有一段叶绿体导肽，负责引导
未成熟 γ-TMT进入叶绿体。不同 γ-TMT的导肽差
异较大。如十字花科的芥菜、结球甘蓝和拟南芥
的导肽均为 47个氨基酸(欧阳青等 2003)，同源性
介于 52.1%~100%之间，但与由 25个氨基酸组成
的集胞藻导肽几乎没有同源性。根据芥菜、结球
甘蓝、拟南芥 γ-TMT的导肽特征，我们推导甘
蓝型油菜导肽长也是 47个氨基酸，后续功能实验
证实，这种预测是对的。
本文之所以采用 BL21 (DE3)和 BL21 (DE3)
CodonPlus两种大肠杆菌菌株表达 BnTMT，是考
虑到基因序列上存在较多的大肠杆菌稀有密码子，
其中有 8个 Arg、7个 Ile、2个 Pro、2个 Leu，
占整个编码区的6.3%。由于BL21 (DE3) CodonPlus
携带稀有密码子 tRNA基因，能在一定程度上解决
稀有密码子问题，本文结果也证实了这一点。有
关选择菌株方法解决稀有密码子的类似报道还有许
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月688
多(Kane 1995；Ivanov等 1997；王涛等 2000；
Kim和Lee 2006)。尽管在 SDS-PAGE中难以检测
到可溶状态的重组酶，但体外酶活性测定结果证
明，上清液中仍表达出具有很好生物学活性的重
组酶，这为今后继续采用该基因进行代谢工程研
究提供了基础。
参考文献
黄筱声(2001). 天然维生素 E与人体健康. 粮食与油脂, 9: 35~36
欧阳青, 樊春涛, 孙卉, 张玉满, 白双义, 蔡文启(2003). 结球甘蓝
γ-生育酚甲基转移酶 cDNA的克隆、分析及其异源表达酶
蛋白的功能研究. 自然科学进展, 13 (7): 709~715
王涛, 周先碗, 胡美浩(2000). 人尿激酶原在大肠杆菌中表达的
研究. 北京大学学报, 36 (6): 802~807
Bradford MM (1976). A rapid sensitive method for the quantitation
of microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248~254
Buring JE, Hennekens CH (1997). Antioxidant vitamins and car-
diovascular disease. Nutr Rev, 55: S53~S60
Chen D, Kawarasaki Y, Nakano H, Yamane T (2003). Cloning
and in vitro and in vivo expression of plant glutathione S-
transferase zeta class genes. J Biosci Bioeng, 95: 594~600
Cho EA, Lee CA, Kim YS, Baek SH, de los Reyes BG, Yun SJ
(2005). Expression of gamma-tocopherol methyltransferase
transgene improves tocopherol composition in lettuce
(Latuca sativa L.). Mol Cells, 19: 16~22
Fryer MJ (1992). The antioxidant effects of thylakoid vitamin E
(α-tocopherol). Plant Cell Environ, 15: 381~392
Grusak MA, DellaPenna D (1999). Improving the nutrient com-
position of plants to enhance human nutrition and health.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 50: 133~161
Ivanov IG, Saraffova AA, Abouhaidar MG (1997). Unusual effect
of clusters of rare arginine (AGG) codons on the expression
of human interferon α1 gene in Escherichia coli . Int J
Biochem Cell Biol, 29 (4): 659~666
Kane JF (1995). Effects of rare codon clusters on high-level
expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr
Opin Biotechnol, 6 (5): 494~500
Kim S, Lee SB (2006). Rare codon clusters at 5-end influence
heterologous expression of archaeal gene in Escherichia coli.
Protein Expr Purif, 50 (1): 49~57
Rimm EB, Stampfer MJ, Ascherio A, Giovannucci E, Colditz GA,
Willett WC (1993). Vitamin E consumption and the risk of
coronary heart disease in men. New Engl J Med, 328:
1450~1456
Sattler SE, Cahoon EB, Coughlan SJ, DellaPenna D (2003). Char-
acterization of tocopherol cyclases from higher plants and
cyanobacteria. Evolutionary implications for tocopherol
synthesis and function. Plant Physiol, 132: 2184~2195
Shintani D, DellaPenna D (1998). Elevating the vitamin E con-
tent of plants through metabolic engineering. Science, 282
(5396): 2098~2100
Stampfer MJ, Hennekens CH, Manson JE, Colditz GA, Rosner B,
Willett WC (1993). Vitamin E consumption and the risk of
coronary disease in women. New Engl J Med, 328: 1444~
1449
Tavva VS, Kim YH, Kagan IA, Dinkins RD, Kim KH, Collins GB
(2007). Increased alpha-tocopherol content in soybean seed
overexpressing the Perilla frutescens gamma-tocopherol
methyltransferase gene. Plant Cell Rep, 26 (1): 61~70
Traber MG, Sies H (1996). Vitamin E in humans: demand and
delivery. Annu Rev Nutr, 16: 321~347