全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 361
一种简易快速高效提取麻疯树营养器官中RNA 的方法
罗言云 魏琴 周黎军 张荣 邓骛远 任琛 陈放*
四川大学生命科学学院, 成都610065
A Simple, Rapid and Highly Effective Method for Extracting Total RNA from
Jatropha curcas
LUO Yan-Yun, WEI Qin, ZHOU Li-Jun, ZHANG Rong, DENG Wu-Yuan, REN Chen, CHEN Fang*
College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China
提要 以麻疯树根、茎、叶为材料，用4种方法提取麻疯树中总RNA。琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱分析结果表明，改良
的张年辉法提取的RNA比张年辉法提取的完整性更好，时间更短，条件更粗放；试剂盒A提取的RNA多数降解；试剂
盒B几乎不能提取其RNA。RT-PCR分析表明，以改良的张年辉法提取的根、茎、叶中RNA作模板也可成功地进行RT-
PCR扩增。据此，我们认为用简易、快速、高效的改良张年辉法提取麻疯树根、茎、叶中RNA为最佳选择。
关键词 麻疯树；改良的张年辉法；RNA提取；营养器官
收稿 2004-09-13 修定 　 2004-12-27
资助　 国家“十五”重大科技攻关项目(2002BA901A15)。
致谢 四川大学生命科学学院张年辉先生在实验中给予支持
和帮助。
*通讯作者 (E-mail: cfang@263.net, Tel: 028-85417281)。
麻疯树(J a t r o p h a c u r c a s )为大戟科
(Euphorbiaceae)麻疯树属植物，在我国西南地区
广泛分布。麻疯树根、茎、叶中含有大量的活
性成分，具有杀菌[1]、杀虫[2]等多种功效。麻疯
树产业是联合国倡导的扶贫和生态保护的重点支撑
项目[3]。研究麻疯树不同器官功能基因的表达与
调控是进一步开发麻疯树各活性成分的基础。为
此，分离得到高质量的总 R N A 是首要条件。只
有纯度高、完整性好的总RNA才能用于Northern
杂交、mR N A 纯化、cD N A 文库构建、通过 RT -
PCR 分离基因以及蛋白质体外翻译等进一步实验
操作。植物组织中 R N A 的提取方法较多，但不
同植物的生理生化特点不同，它们的 RNA 提取方
法也各异。从富含次生代谢产物的珙桐种子[4]、
草莓[5]、文冠果[6]、桃[7]、香蕉[8]、柿[9]、哈密瓜[10]、
猕猴桃[11]、荔枝[12]、芒果[13]、葡萄[14]等组织中
提取总RNA的报道较多。Lin等[15]用 Watson公司
的试剂盒(本文实验的试剂盒A)成功地从麻疯树种
子中分离了总RNA，实现了麻疯树毒蛋白(curcin)
基因的 cDNA 克隆，为种子中活性物质的基因研
究建立了基础，而提取麻疯树根、茎、叶中的
RNA 并用以进行基因研究还未见报道。本文以麻
疯树根、茎、叶为材料，选用了 4 种方法提取
它们的 R N A ，以期能找到一种快速、高效提取
根、茎、叶中 R N A 的方法，为麻疯树不同营养
器官功能基因的研究提供实验基础。经过实验探
索，已获得成功，现报道如下。
材料与方法
1 材料
根、茎、叶取自实验室栽培的麻疯树
(Jatropha curcas)幼苗。
2 方法
2.1 RNA提取
2.1.1 张年辉法 器具的处理、提取缓冲液配方和
其它试剂、提取过程完全按张年辉等[16 ]所述进
行：根、茎、叶样品用量为 20 0 m g；R N A 提
取缓冲液配方为200 mmol·L-1 Tris、400 mmol·L-1
KCl、200 mmol·L-1 蔗糖、35 mmol·L-1 MgCl2、
25 mmol·L-1 乙二醇双乙胺醚四乙酸(EGTA)、3
mmol·L-1醋酸钠(NaAc); Tris饱和重蒸苯酚(pH 8)、
3 mol·L-1 NaAc(pH 5.2)和氯仿∶异戊醇(24∶1)
在 4℃下预冷保存。
2.1.2 改良的张年辉法 研钵在用前用酒精烧 2~3
min，其他器具的处理与张年辉法同；RNA 提取
缓冲液配方及其它试剂与张年辉法同；所有试剂
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月362
均于常温存放，用前不需预冷；提取过程的改进
主要体现在处理时间的缩短和常温下离心。具体
步骤是：(1)200 mg样品在液氮中研磨后转移到EP
管中，按3~4 倍量(mL·g-1)加入提取缓冲液，1/2
(V/V)提取缓冲液的苯酚，1/2(V/V)提取缓冲液的
氯仿-异戊醇，剧烈震荡混匀。(2)4℃下，3 800×g
离心2 min。上清液转移到新EP管中，加入等体
积的苯酚和氯仿 - 异戊醇，剧烈震荡混匀，常温
下， 3 800×g 离心2 min。重复 1次。(3)上清液
转移到新 EP 管，加入等体积的氯仿抽提，常温
下，以3 800×g离心2 min。(4)上清液转移到新EP
管中，加入1/10体积的醋酸钠(pH 5.2)及 2倍体
积的100%乙醇于 –20℃下沉淀3 h。(5)于常温下，
6 800×g 离心3 min。尽量倒去乙醇，用 0.5 mL
的 NaAc(pH 5.6)洗下沉淀，共 1次。(6)常温下，
15 000×g 离心3 min。沉淀加入0.2 mL DEPC水、
0.04 mL醋酸钠(pH 5.6)、1 mL 100%乙醇混合，
在–20℃下沉淀3 h。(7)常温下，3 800×g离心2 min。
沉淀用70%乙醇洗 2次。常温下， 15 000×g 离心
2 min，除去乙醇，沉淀溶解于50 mL DEPC水中，
于 –2 0℃中保存，备用。
2.1.3 试剂盒A法 试剂盒A购于Watson公司，完
全按照其使用说明书操作。
2.1.4 试剂盒B法(磁珠法) 试剂盒B购自云南旺源
生物技术有限公司，完全按照其使用说明书操
作。
2.2 RNA 电泳分析 取2 mL RNA 样品，点样于
1% 琼脂糖凝胶上，每 100 mL 凝胶加入 2.5 mL
EB，80 V 恒压 50 min，在凝胶成像系统中观察
检测提取 R N A 的完整性。
2.3 RNA纯度鉴定 取1 mL RNA样品，稀释4倍
后测定波长230、260 和 280 nm 处的吸收值(A)。
计算A260/A280及 A260/A230用于纯度分析，并于紫外
光下对样品进行扫描。
2.4 RT-PCR 按一步法 RT-PCR 试剂盒 (TaKaRa)
操作手册进行。因到目前为止，未见在麻疯树
根、茎中成功分离功能基因的报道，故没有现成
的引物用于 R T - P C R 检测。本文用麻疯树叶的
J F I P 基因的特异引物——5 引物 P 1 ( 5
T A G C C A A A G T C A T A A A T T C T G G G G A C A 3 )
和 3 引物 P2 ( 5 C A T T C A A C A A G A C T C C C -
ATGAGACCTTT 3)[17]为引物，分别以改良的张年
辉法和张年辉法提取的 R N A 为模板进行 R T -
PCR。在 50℃下反转录 30 min 后，进行PCR。参
数是：94℃ 2 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s, 72℃ 2
min，25个循环；最后72℃延伸5 min。每个RNA
样品均以未经反转录的PCR和不加模板的RT-PCR
为对照。
实验结果
1 RNA完整性分析
用改良的张年辉法提取的根、茎、叶 R N A
条带清晰，无拖尾，不同分子量的 R N A ( 2 8 S、
18 S、5. 8 S )均可提出；用张年辉法提取的根、
茎、叶中 R N A 条带稍欠清晰，略有拖尾，不同
分子量的 RNA(28S、18S、5.8S)也均可提出；
用试剂盒 A 提取的 RNA 降解多；用试剂盒 B 未能
提出根、茎、叶中的 R N A (图 1 )。
2 RNA 纯度检测
采用 4 种方法提取的根、茎、叶中 R N A 的
A230、A260、A280 值见表 1。经计算，4 种方法提
取的根中 RNA 样品的 A260/A 280 值分别为 1.97、
1.91、1.81，茎中分别为1.89、1.86、1.71，叶
中分别为 1.98、2.02、1.92。这些数字均在
1.8~2.0之间，表明样品几乎无蛋白质污染[5]。根
中 RNA样品的A260/A230 分别为1.65、1.61、1.46，
茎中分别为 1.51、1.56、1.48，叶中分别为
1.59、1.65、1.54。这些数字均大于 1.0，表明
图 1 4 种方法提取的麻疯树根、茎、叶中 RNA 电泳图谱
A: 改良张年辉法; B: 张年辉法; C: 试剂盒A法; D: 试剂盒B法。1: 根； 2: 茎； 3: 叶。
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 363
样品几乎无多糖和酚类污染[5]。
将根、茎、叶 R N A 放在紫外光区进行扫描
后发现260 nm 处有高的吸收峰，而在280 nm 处
几乎无吸收峰(图 2，根、茎扫描图略)。
3 RT-PCR
以麻疯树叶中的JFIP基因的特异引物(P1和
图2 4种方法提取麻疯树叶中RNA紫外光谱吸收图谱
A: 改良张年辉法; B: 张年辉法; C: 试剂盒A法; D: 试剂盒B法。
表 1 用 4种方法提取的麻疯树根、茎、叶中RNA的紫外光吸收值(A)

紫外光吸收值
根 　　　　　　　　　 茎
改良法　　 张年辉法　 试剂盒A法　试剂盒B法　　　 改良法　 张年辉法 试剂盒A法　试剂盒B法
A260 0.387±0.021 0.368±0.032 0.185±0.009 0.035±0.022 0.525±0.037 0.522±0.043 0.288±0.038 0.044±0.009
A280 0.196±0.025 0.193±0.029 0.102±0.013 0.032±0.019 0.278±0.026 0.283±0.039 0.168±0.026 0.037±0.014
A230 0.235±0.030 0.229±0.033 0.127±0.021 0.085±0.026 0.347±0.022 0.336±0.028 0.194±0.087 0.046±0.028
A260/A280 1.97 1.91 1.81 — 1.89 1.86 1.71 —
A260/A230 1.65 1.61 1.46 — 1.51 1.56 1.48 —
紫外光吸收值
　
叶
改良法 张年辉法 试剂盒A 法 试剂盒B法
A260 0.613±0.027 0.658±0.034 0.361±0.036 0.066±0.025
A280 0.309±0.029 0.352±0.031 0.188±0.027 0.058±0.032
A230 0.385±0.036 0.399±0.024 0.235±0.025 0.075±0.023
A260/A280 1.98 2.02 1.92 —
A260/A280 1.59 1.65 1.54 —
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P2)为引物，分别以改良的张年辉法和张年辉法提
取的 RNA 为模板进行 RT-PCR，结果预期的 570
bp 的目标带可成功地扩增，在未经反转录的和没
有模板的对照中未见有扩增条带；而以试剂盒 A
提取的 RNA 为模板进行 RT-PCR 后，产物中未见
目标带的被扩增(图 3); 试剂盒B未提出RNA，故
未进行 RT-PCR 试验。
讨　　论
用改良的张年辉法和张年辉法提取的麻疯树
根、茎、叶中RNA 在得率上并无明显差异(表 1)，
但改良的张年辉法比张年辉法提取 RNA 有以下优
点：(1)RNA更完整(图1); (2)操作更快速(改良的
张年辉法比张年辉法用的时间少近 70 min); (3)操
作条件更粗放(操作可在常温下进行，即常温下离
心和使用常温下存放的试剂)。总之，用改良的
张年辉法可得到更高质量的 RNA，操作更方便、
更简捷，还可降低成本。另外，使用前直接用
酒精烧研钵以灭活 RNA 酶的方法可克服实验前由
于不慎或准备不充分而造成的不良影响。
改良法之所以能在较粗放的条件下进行，我
们推测这可能与提取液中的起渗透保护作用的蔗
糖、氯化钾有关[16]。缩短提取时间利于其RNA 的
提取，可能与缩短了 R N A 酶与 R N A 作用时间，
从而减少了 RNA 降解的可能性有关。如果在粗放
的条件下操作，提取时间越短，则越利于保证
R N A 的完整性。
改良的张年辉法比张年辉法之所以更有利于
麻疯树根、茎、叶中 R N A 的提取，可能与麻疯
树根、茎、叶中含丰富的乳汁有关。据文献 1 8
和 1 9 报道，麻疯树乳汁富含麻疯树碱、糖类、
小分子醛和酸类等。破碎细胞时 RNA 与乳汁可同
时析出，会比无乳汁植物可能更易发生次生物质
氧化或和酚试剂发生化学反应。因此，快速提取
可减少次生物质的氧化反应，减少与核酸的不可
逆性结合，从而减少 RNA 的降解。改良的张年辉
法是否适用于多数乳汁植物，还待进一步试验。
为何试剂盒 A 会导致麻疯树根、茎、叶中
RNA 的降解，试剂盒 B 无法提取麻疯树根、茎、
叶中 RNA，目前由于还不知其提取液的成分是什
么，所以尚无从分析。这一问题也值得探讨。
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图3 RT-PCR产物的琼脂糖电泳图谱
M: DNA 分子量标准; 1: RT-PCR 产物, 以张年辉法提取的
RNA 为模板; 2: RT-PCR 产物, 以改良的张年辉法提取的 RNA
为模板; 3: RT-PCR产物(无目标带), 以试剂盒A提取的RNA为
模板; 4、5: 未经反转录的对照; 6~8: 没有模板的对照。